CN111020018B - 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：核酸提取；高通量测序文库构建；将高通量测序文库构建中构建的测序文库进行定量；将定量后的测序文库，稀释至1‑4pM，在测序仪上进行高通量测序；对高通量测序中获得的测序数据进行分析。本发明的另一方面，还提供了一种病原微生物检测试剂盒，本发明所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法及试剂盒，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒。
背景技术：
感染性疾病是由病原微生物(细菌、病毒、真菌、寄生虫等)引起的疾病的统称。据统计，感染性疾病死因占全部死因的25％以上，是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。全球每年罹患感染性疾病的患者大约有4000万，我国患者约占四分之一，其中临床诊断病因不明占近百分之五十(约500万)。当不明原因的感染性疾病发生时,快速准确的鉴定病原体是精准治疗、有效监测、控制疾病蔓延和降低医疗负担的关键。
基于高通量测序的宏基因组技术不依赖传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够尽可能地获取样本中包含的所有核酸序列信息，然后与数据库进行比对分析，根据比对得到的序列信息来判断样本中所含微生物的种属信息，在病原体检测中发挥着重要的作用。高通量测序用于感染性疾病的诊断首次报道于2014年1例中枢神经系统感染患者。此外，在呼吸道感染中，高通量测序也用于包括痰液、肺泡灌洗液等多种呼吸道标本，并表现出良好的检测性能。血液样本也是高通量测序的重要应用领域，在血流感染的病原检测中也发挥着作用。
但是目前基于高通量测序技术进行病原微生物检测的技术一般采用传统的基于Illumina测序平台的文库构建方法，包括超声打断、DNA片段末端修复、接头连接和PCR扩增等多个步骤，实验操作复杂，且依赖特定的机械设备如Covaris打断仪，价格成本高且耗时长。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法、病原微生物检测方法及试剂盒，以解决现有技术中的至少一项技术问题。
具体的，本发明的第一方面，提供了一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，所述方法包括如下步骤：
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库。
采用上述技术方案，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。
优选地，步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，
DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，Buffer EB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，
反应条件为：
优选地，所述反应体系还包括0.5-1份的增强剂(Enhance)。
优选地，所述反应体系中，按体积份数计，片段化缓冲液1.5份，片段化酶3份，Enhance0.75份，Buffer EB将体系补足至15份。
优选地，步骤S101中，所述片段化酶反应体系还包括聚乙二醇2000，按体积份数计，所述聚乙二醇2000的含量为0.1-0.3份。更优选地，所述片段化酶反应体系中还包括0.02-0.04份的聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)。在体系中有聚乙二醇存在的情况下，加入微量的PVP-K30，能进一步提高片段的均一性。
优选地，步骤S101中，所述片段化酶为DNA Fragmentase。
优选地，步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：
末端修复产物10-20份，连接缓冲液5-8份，连接酶2-5份，带有标签序列的接头4-6份，Buffer EB0.5-2份，其中，连接酶浓度为500-800U/μl，
反应条件为，
优选地，步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：
末端修复产物15份，连接缓冲液6份，连接酶3份，带有标签序列的接头5份，BufferEB1份，其中，连接酶浓度为600U/μl。
优选地，所述连接缓冲液包括，300-350mM Tris-HCl，30-60mM MgCl2，3-6mM DTT，3-6mM ATP。更优选地，所述连接缓冲液包括330mM Tris-HCl，50mM MgCl2，5mM DTT，5mMATP。
优选地，步骤S103中，对步骤S102中的产物通过磁珠进行纯化。
优选地，所述通过磁珠进行纯化的步骤包括：
S201，吸取10-30μL EBBuffer和30-50μL DNA Clean Beads至20-40μL接头连接反应产物中，充分混匀；
S202，室温孵育1-10min；
S203，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S204，继续在外部磁场的作用下，加入100-300μL的70-90％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育10-60s，移除上清；
S205，将所述磁珠暴露在空气中干燥5-10min，
S206，将磁珠加入10-30μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置1-10min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取10-20μl上清液，即为纯化产物。
优选地，重复所述S204步骤。
优选地，所述外部磁场为磁力架，所述磁力架上设置有与试管相匹配的试管固定部。
优选地，所述磁珠直径为0.5-1.5μm。更优选地，所述磁珠选用
DNA CleanBeads(VazymeN411)。
优选地，所述S204中，所述乙醇溶液中，含有0.02-0.05mol/L的氯化钾。
进一步的，本发明的第二方面，提供了一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法包括如下步骤：
核酸提取；
高通量测序文库构建，采用如上所述的高通量测序文库构建方法；
测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；
高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；
结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析。
优选地，所述结果分析步骤中的分析方法包括步骤：
S401，将样本测序数据进行拆分，
S402，计算数据中的宿主序列比例，
S403，去除宿主序列，
S404，将剩余序列与病原数据库进行比对，获得含有的病原微生物物种信息。
优选地，所述拆分方法为，每一个文库两端所连接的接头上都有一个特异的标签序列，数据下机后，会根据每一条序列上测得的标签序列将不同的reads分配至不同的文库下。
优选地，所述标签序列长度为8nt。
优选地，上机测序时，20个文库同时上机。
优选地，所述S404中，与病原数据库进行比对的方法为，
S501,生成数据库哈希索引，基于特定序列长度s对数据库包含的碱基序列进行拆分，以碱基序列作为哈希索引，存储碱基序列所在基因组位置列表信息；
S502,序列局部比对，将查询序列拆分为同样长度的碱基片段，通过哈希碰撞在哈希索引中查找对应序列，并获取该片段在基因组中的位置信息；
S503,计算测序序列在参考序列不同位置的编辑距离，查找最佳比对结果；
S504,统计比对结果并输出。
优选地，所述步骤S501中，将数据库包含的碱基序列以单元s进行拆分，构建哈希索引，并将基因组位置信息存储于索引中。其典型序列单元s的长度为20个碱基。碱基序列单元的反向互补序列同样作为索引存储于索引库中。
优选地，所述步骤S502中，所述序列查询方式，为将序列拆分为与步骤1相同的序列单元，并通过哈希碰撞方式在步骤1构建的哈希索引中进行查询，以获得碱基序列单元所对应的位置信息。
优选地，所述步骤S503中，根据步骤2种拆分出来的序列单元在索引库中的基因组位置信息，计算序列与基因组间的编辑距离。为避免序列插入缺失带来的影响，将基因组连续32个基因组片段作为一个统计单元，统计单元内的编辑距离，作为最佳比对结果评估依据。根据同一查询序列在相同参考序列中匹配的序列单元数目，计算查询序列与参考序列之间的编辑距离，选择编辑距离最低的序列作为查询序列在参考数据库中的最佳比对结果。
优选地，所述步骤S504中，根据序列差异计算测序序列与数据库参考序列之间的距离，若最佳比对结果编辑距离为m，根据预设的编辑距离范围n，查找编辑距离最小为m，最大为n的比对结果，并将结果输出。
进一步的，本发明的第三方面，提供了一种病原微生物检测试剂盒，所述试剂盒包括：
片段化酶，80-85μL，优选为83μL；
片段化酶缓冲液，40-45μL，优选为44μL；
接头，24X，4-8μL，优选为5μL；
连接酶，80-85μL，优选为83μL；
连接酶缓冲液，170μL。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。
2.本发明所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，通过在片段化酶反应体系中加入聚乙二醇，可以有效降低DNA片段化后的小片段比例，可以使大部分片段保持在150-180bp。
3.本发明所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，通过在磁珠纯化过程中加入适量氯化钾，提高了DNA片段的纯化率。
4.本发明所提供的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，通过与病原数据库的比对算法，得到更准确的病原微生物匹配结果。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
样品例1
本样品例用于制备下述实验例1-2中所用的DNA样品，具体步骤如下所述：
使用核酸提取或纯化试剂(天津金匙医学科技有限公司Cat.1901，津械备20190271)提取1例临床血流感染患者的血浆样本，具体操作步骤如下：
(1)取600μl血浆到3ml的离心管中，如不足600μl，加缓冲液A到600μl终体积；
(2)加入40μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀；
(3)加入600μl的缓冲液B和12μl浓度为1μg/μl的Carrier RNA，轻轻颠倒混匀，70℃孵育15min，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(4)待样品温度降至室温后加入600μl预冷的无水乙醇。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(5)将上一步所得溶液吸取600μl到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(6)重复步骤5；
(7)向吸附柱中加入500μl缓冲液C(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心30sec，弃废液，放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(8)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(9)重复操作步骤8；
(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。用10μl枪头将吸附柱内残留的液体吸弃后，将吸附柱开盖置于事先准备好干净的1.5ml离心管中，室温放置2-5min，至乙醇充分挥发；
(11)注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
(12)向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；
(13)使用Qubit dsDNA HS assay Kit(Invitrogen Cat.Q32851)对提取的核酸DNA进行定量，定量结果如下：
实验例1
本实施例对片段化酶的反应体系进行实验，所述片段化酶选用市售的DNAFragmentase。
方案a
DNA样本1μl，片段化缓冲液1μl，片段化酶2μl，Enhance0.5μl，Buffer EB将体系补足至15μl，
方案b
DNA样本1μl，片段化缓冲液2μl，片段化酶4μl，Enhance1μl，Buffer EB将体系补足至15μl，反应条件参照方案a。
方案c
DNA样本1μl，片段化缓冲液1.5μl，片段化酶3μl，Enhance0.75μl，Buffer EB将体系补足至15μl，反应条件参照方案a。
方案d
DNA样本1μl，片段化缓冲液1.5μl，片段化酶5μl，Enhance1μl，Buffer EB将体系补足至15μl，反应条件参照方案a。
方案e
DNA样本1μl，片段化缓冲液1.5μl，片段化酶1μl，Enhance1μl，Buffer EB将体系补足至15μl，反应条件参照方案a。
方案f
利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率150W，超声时间每8s间隔2s，总工作时间5min，冰浴。
方案g
利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率300W，超声时间每5s间隔5s，总工作时间15min，冰浴。
方案h
利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率450W，超声时间每7s间隔3s，总工作时间30min，冰浴。
将方案a-f中，打断后DNA片段长度进行检测，并记录长度小于100bp，及长度大于300bp的DNA片段占比结果如表1所示：
表1
根据表1的结果，在15μl的体系中，片段化酶的使用量为1-5μl均可以达到片段化的要求，且均一度要显著优于用超声破碎仪进行随机打断的方案。其中，综合酶用量及均一度两项指标，方案a、b、c也即片段化酶使用量在2-4μl的方案更为优选。
以方案b为基础，对片段化酶的酶切反应时间进行实验，结果如表2所示：
表2
根据表2的结果，片段化酶的酶切反应时间在20-40min均可以达到较好的片段化效果，其中，反应时间控制在35min结果更优。
进一步，以方案b为基础，在体系中加入0.2μl聚乙二醇2000，对整个反应的时间进行实验，结果如表3所示：
表3
根据表3的结果，申请人意外的发现，在体系中加入聚乙二醇2000后，酶切时间较长的情况下，片段化酶酶切反应后的小片段比例减少，减少了由于时间控制不当造成的小片段增多的情况，使片段化后的DNA片段均一性更强。
实验例2
由于聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)作为药物制剂的辅料在一定的含量下具有一定的交联性，申请人认为这种交联性可能对片段化反应的均一性有正向促进作用。
故以实验例1中的方案b为基础，在体系中加入0.02mg的PVP-K30，进行片段化反应实验，结果如表4所示：
表4
然而，表4的结果与表2相比，片段化反应后的均一性不但没有提高，反而会有些许降低。
随后的实验中，申请人继续以方案b为基础，在体系中加入0.2μl聚乙二醇2000、0.02mg的PVP-K30，进行片段化反应实验，结果如表5所示：
表5
根据表5的结果所示，在同时加入聚乙二醇2000、PVP-K30后，相比表3，虽然大片段的数量变化不明显(P＞0.05)，但是小片段(小于100bp)的数量，除了10min中一组数据差异不明显(可能是由于反应时间过短)，其余各组的含量均有显著性的降低(p＜0.01)，因此，总体来说，PVP-K30独立加入反应体系对片段化的均一性影响不明显，但在体系中有聚乙二醇存在的情况下，加入微量的PVP-K30，能进一步提高片段的均一性。
实验例3
本实施例对磁珠纯化的方案进行实验。
样品1：以实施例1中方案b的产物为样品1。
样品2：以实施例1中方案b为基础，在其体系中加入0.2μl的聚乙二醇2000，其反应产物为样品2。
方案A，A’：
S1，吸取10μL EBBuffer和30μL DNA Clean Beads至20μL样品中，充分混匀；
S2，室温孵育1min；
S3，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S4，继续在外部磁场的作用下，加入100μL的70％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育10s，移除上清；
S5，将所述磁珠暴露在空气中干燥5min，
S6，将磁珠加入10μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置1min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取10μl上清液，即为纯化产物。
采用样品1为方案A，采用样品2为方案A’。
方案B，B’：
S1，吸取20μL EBBuffer和40μL DNA Clean Beads至30μL样品中，充分混匀；
S2，室温孵育5min；
S3，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S4，继续在外部磁场的作用下，加入200μL的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，移除上清；
S5，将所述磁珠暴露在空气中干燥6min，
S6，将磁珠加入20μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置5min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取16μl上清液，即为纯化产物。
采用样品1为方案B，采用样品2为方案B’。
方案C，C’：
S1，吸取30μL EBBuffer和50μL DNA Clean Beads至40μL样品中，充分混匀；
S2，室温孵育10min；
S3，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S4，继续在外部磁场的作用下，加入300μL的90％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育60s，移除上清；
S5，将所述磁珠暴露在空气中干燥10min，
S6，将磁珠加入30μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置10min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取20μl上清液，即为纯化产物。
采用样品1为方案C，采用样品2为方案C’。
在方案B的基础上，在S4步骤中，分别加入0.03mol/L的氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，形成方案D、E、F、G、H、D’、E’、F’、G’、H’。
对方案A-I的纯化率进行检测，得到表6。
表6
| 组别 | 纯化率(％) |
| 方案A | 55.2 |
| 方案A’ | 48.5 |
| 方案B | 54.4 |
| 方案B’ | 48.0 |
| 方案C | 56.7 |
| 方案C’ | 45.6 |
| 方案D | 48.0 |
| 方案D’ | 45.2 |
| 方案E | 48.3 |
| 方案E’ | 62.2 |
| 方案F | 50.3 |
| 方案F’ | 42.0 |
| 方案G | 44.3 |
| 方案G’ | 44.8 |
| 方案H | 47.7 |
| 方案H’ | 44.6 |
根据表6结果可知，在纯化时，不加入其他组分的情况下(方案A-C，A’-C’)，含有聚乙二醇2000的样品组，纯化率低于不含聚乙二醇2000的样品组(p＜0.01)，证明聚乙二醇2000虽然可以降低DNA在片段化酶作用时的碎片化率，但这一组分的存在对纯化率有着不利影响。根据方案D-H的结果，在样品中加入组分如氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾时，这些组分也会对纯化率起到不利影响，相比与方案A-C，纯化率均有明显下降(p＜0.01)。在含有聚乙二醇2000的样品组中，但申请人意外发现，氯化钾组的纯化率明显升高，不仅高于其他样品组(方案D’、F’、G’、H’)，甚至高于方案A-C，这说明，氯化钾的加入和聚乙二醇2000相配合，在磁珠纯化的过程中起到了协同作用，使纯化率有了显著提高。
样品例2
本样品例用于制备下述实验例1-2中所用的DNA样品，具体步骤如下所述：
使用核酸提取或纯化试剂(天津金匙医学科技有限公司Cat.1901，津械备20190271)提取1例临床血流感染患者的血浆样本，具体操作步骤如下：
(1)取600μl血浆到3ml的离心管中，如不足600μl，加缓冲液A到600μl终体积；
(2)加入40μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀；
(3)加入600μl的缓冲液B和12μl浓度为1μg/μl的Carrier RNA，轻轻颠倒混匀，70℃孵育15min，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(4)待样品温度降至室温后加入600μl预冷的无水乙醇。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(5)将上一步所得溶液吸取600μl到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(6)重复步骤5；
(7)向吸附柱中加入500μl缓冲液C(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心30sec，弃废液，放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(8)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(9)重复操作步骤8；
(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。用10μl枪头将吸附柱内残留的液体吸弃后，将吸附柱开盖置于事先准备好干净的1.5ml离心管中，室温放置2-5min，至乙醇充分挥发；
(11)注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
(12)向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；
(13)使用Qubit dsDNA HS assay Kit(Invitrogen Cat.Q32851)对提取的核酸DNA进行定量，定量结果如下：
| 样本编号 | 浓度(ng/μl) | 体积(μl) | 得率(ng) |
| LYT | 0.608 | 50 | 12.16 |
实施例1
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；所述片段化酶选用DNA Fragmentase。
具体的，将片段化缓冲液解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下反应：
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管暂时置于冰上，在PCR仪上设置下述程序，待PCR仪降到4℃后，按暂停键，将PCR管放入PCR仪，然后继续运行程序：
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
具体的，依照下表中的使用EB将接头(10μM)稀释N倍；
将连接缓冲液解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
在S101步骤中获得的末端修复产物的PCR管中配制如下反应：
*连接缓冲液和连接酶预混后，可于4℃存放不超过24h，接头于反应时加入。
#X为标签编号，每个样品对应一个的Indexprime编号。
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
S103，对S102中的产物通过磁珠进行纯化，获得高通量测序文库。
具体的，所述磁珠纯化步骤为：
S200，将磁珠(DNA Clean Beads)提前30min拿出涡旋震荡混匀，平衡至室温，DNAClean Beads平衡至室温后，涡旋震荡混匀。
S201，吸取10μL EBBuffer和30μL DNA Clean Beads至20μL接头连接反应产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
S202，室温孵育1min。
S203，将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清(注：尽量移除上清)。
S204，保持PCR管置于磁力架中，加入100μL新鲜配制的70％乙醇漂洗磁珠，将PCR管小心移至磁条对面，室温孵育10s，待磁珠完全移动到贴近磁条的管壁上，小心移除上清。重复本步骤一次，总计漂洗两次。
S205，保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5min至无乙醇残留。
S206，将PCR管从磁力架中取出，加入10μL EB洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温静置1min，将PCR管短暂离心并置于磁力架上静置，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取10μL上清至新的PCR管中，切勿触碰磁珠，即得纯化产物。
实施例2
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；所述片段化酶选用DNA Fragmentase。
具体的，将片段化缓冲液解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下反应：
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管暂时置于冰上，在PCR仪上设置下述程序，待PCR仪降到4℃后，按暂停键，将PCR管放入PCR仪，然后继续运行程序：
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
具体的，依照下表中的使用EB将接头(10μM)稀释N倍；
将连接缓冲液解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
在S101步骤中获得的末端修复产物的PCR管中配制如下反应：
*连接缓冲液和连接酶预混后，可于4℃存放不超过24h，接头于反应时加入。
#X为标签编号，每个样品对应一个的Indexprime编号。
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
S103，对S102中的产物通过磁珠进行纯化，获得高通量测序文库。
具体的，所述磁珠纯化步骤为：
S200，将磁珠(DNA Clean Beads)提前30min拿出涡旋震荡混匀，平衡至室温，DNAClean Beads平衡至室温后，涡旋震荡混匀。
S201，吸取30μL EBBuffer和50μL DNA Clean Beads至40μL接头连接反应产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
S202，室温孵育10min。
S203，将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清(注：尽量移除上清)。
S204，保持PCR管置于磁力架中，加入300μL新鲜配制的90％乙醇漂洗磁珠，将PCR管小心移至磁条对面，室温孵育60s，待磁珠完全移动到贴近磁条的管壁上，小心移除上清。重复本步骤一次，总计漂洗两次。
S205，保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min至无乙醇残留。
S206，将PCR管从磁力架中取出，加入30μL EB洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温静置10min，将PCR管短暂离心并置于磁力架上静置，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μL上清至新的PCR管中，切勿触碰磁珠，即得纯化产物。
实施例3
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；所述片段化酶选用DNA Fragmentase。
具体的，将片段化缓冲液解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下反应：
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管暂时置于冰上，在PCR仪上设置下述程序，待PCR仪降到4℃后，按暂停键，将PCR管放入PCR仪，然后继续运行程序：
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
具体的，依照下表中的使用EB将接头(10μM)稀释N倍；
将连接缓冲液解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
在S101步骤中获得的末端修复产物的PCR管中配制如下反应：
*连接缓冲液和连接酶预混后，可于4℃存放不超过24h，接头于反应时加入。
#X为标签编号，每个样品对应一个的Indexprime编号。
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
S103，对S102中的产物通过磁珠进行纯化，获得高通量测序文库。
具体的，所述磁珠纯化步骤为：
S200，将磁珠(DNA Clean Beads)提前30min拿出涡旋震荡混匀，平衡至室温，DNAClean Beads平衡至室温后，涡旋震荡混匀。
S201，吸取20μL EBBuffer和40μL DNA Clean Beads至30μL接头连接反应产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
S202，室温孵育5min。
S203，将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清(注：尽量移除上清)。
S204，保持PCR管置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，将PCR管小心移至磁条对面，室温孵育30s，待磁珠完全移动到贴近磁条的管壁上，小心移除上清。重复本步骤一次，总计漂洗两次。
S205，保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留。
S206，将PCR管从磁力架中取出，加入19μL EB洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温静置5min，将PCR管短暂离心并置于磁力架上静置，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取16μL上清至新的PCR管中，切勿触碰磁珠，即得纯化产物。
实施例4
在实施例1的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.1μL聚乙二醇2000。
实施例5
在实施例2的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.3μL聚乙二醇2000。
实施例6
在实施例3的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.2μL聚乙二醇2000。
实施例7
在实施例4的步骤S204中，所述乙醇溶液中，含有0.02mol/L的氯化钾。
实施例8
在实施例5的步骤S204中，所述乙醇溶液中，含有0.05mol/L的氯化钾。
实施例9
在实施例6的步骤S204中，所述乙醇溶液中，含有0.04mol/L的氯化钾。
实施例10
在实施例6的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.02mgPVP-K30。
实施例11
在实施例6的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.04mgPVP-K30。
实施例12
在实施例6的步骤S101中，在所述片段化酶反应体系中加入0.03mgPVP-K30。
对比例1
对实施例2的步骤S101中，采用超声法对DNA进行片段化。具体的，利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率300W，超声时间每5s间隔5s，总工作时间15min，冰浴。
对比例2
对实施例5的步骤S101中，采用超声法对DNA进行片段化。具体的，利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率300W，超声时间每5s间隔5s，总工作时间15min，冰浴。
对比例3
对实施例8的步骤S101中，采用超声法对DNA进行片段化。具体的，利用超声破碎仪随机打断。其中，超声功率300W，超声时间每5s间隔5s，总工作时间15min，冰浴。
对实施例1-9、对比例1-3的纯化产物进行片段长度检测，检测结果如表7所示：
表7
根据表7的结果可知，采用本发明中，片段化酶进行DNA片段化后，其文库片段在150bp-200bp的占比相比于对比例1-3更高，更有利于后续的病原检测。其中，实施例4-9，即采用聚乙二醇2000的组别，文库中150bp-200bp的占比相比于实施例1-3更高，证明了聚乙二醇2000在构建文库时的积极作用。实施例10-12证明了如下事实，在具有聚乙二醇2000的体系中加入PVP-K30，可以进一步提高反应后DNA片段的均一性。
实施例13-20
S301，核酸提取；
S302，如上所述的高通量测序文库构建方法；
S303，将S302中构建的测序文库进行定量；
S304，将定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；
S305，对S304中获得的测序数据进行分析。
其中，S301，核酸提取，具体步骤如下所述：
使用核酸提取或纯化试剂(天津金匙医学科技有限公司Cat.1901，津械备20190271)提取1例临床血流感染患者的血浆样本，具体操作步骤如下：
(1)取300μl血浆到1.5ml的离心管中，如不足300μl，加缓冲液A到300μl终体积；
(2)加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀；
(3)加入300μl的缓冲液B和6μl浓度为1μg/μl的Carrier RNA，轻轻颠倒混匀，70℃孵育15min，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(4)待样品温度降至室温后加入300μl预冷的无水乙醇。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；
(5)将上一步所得溶液吸取600μl到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(6)重复步骤5；
(7)向吸附柱中加入500μl缓冲液C(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心30sec，弃废液，放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(8)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),8000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放到一个新的剪掉管盖的2ml离心管中；
(9)重复操作步骤8；
(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。用10μl枪头将吸附柱内残留的液体吸弃后，将吸附柱开盖置于事先准备好干净的1.5ml离心管中，室温放置2-5min，至乙醇充分挥发；
(11)注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
(12)向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；
(13)使用Qubit dsDNA HS assay Kit(Invitrogen Cat.Q32851)对提取的核酸DNA进行定量，定量结果如表8所示：
表8
| 组别 | 样本编号 | 浓度(ng/μl) | 体积(μl) | 得率(ng) |
| 实施例13 | ZYR | 0.538 | 20 | 10.76 |
| 实施例14 | CKY | 0.408 | 20 | 8.16 |
| 实施例15 | RJY | 0.478 | 20 | 9.56 |
| 实施例16 | XJY | 0.486 | 20 | 9.72 |
| 实施例17 | HQ | 0.456 | 20 | 9.12 |
| 实施例18 | WRK | 0.508 | 20 | 10.16 |
| 实施例19 | GM | 0.488 | 20 | 9.76 |
| 实施例20 | ZLL | 0.486 | 20 | 9.72 |
S302，采用如实施例9所述的方法构建高通量测序文库；
S303，将S302中构建的测序文库进行定量，具体步骤如下：
使用QubitdsDNAHSassayKit(InvitrogenCat.Q32851)和VAHTS LibraryQuantification Kit for Illumina(VazymeCat.NQ101)对测序文库进行定量，定量结果如表9所示：
表9
| 组别 | 样本编号 | 文库浓度(ng/μl) | 文库总量(ng) | qPCR结果(nM) |
| 实施例13 | ZYR | 0.428 | 8.56 | 0.479 |
| 实施例14 | CKY | 0.35 | 7 | 0.181 |
| 实施例15 | RJY | 0.45 | 9 | 0.284 |
| 实施例16 | XJY | 0.386 | 7.72 | 0.445 |
| 实施例17 | HQ | 0.348 | 6.96 | 0.339 |
| 实施例18 | WRK | 0.434 | 8.68 | 0.483 |
| 实施例19 | GM | 0.424 | 8.48 | 0.416 |
| 实施例20 | ZLL | 0.374 | 7.48 | 0.387 |
S304，将定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序，具体步骤如下：
将实施例12-14测序文库等量混合后浓度稀释至10pM，将实施例15-16测序文库等量混合后浓度稀释至20pM，将实施例16-19测序文库等量混合后浓度稀释至40pM，使用NextSeq 500/550高通量v2试剂盒(75次循环)(illuminaCat.FC-404-2005)，按照其使用说明书，在IlluminaNextSeq550测序仪上进行高通量测序。
S305，对S304中获得的测序数据进行分析，具体步骤如下：
根据每个样本在文库构建过程中所添加的特异分子序列，将属于每个样本的测序数据进行拆分，拆分后的数据通过生物信息学分析软件，首先评价其数据质量，GC含量、重复序列比例等，同时比对宿主数据库，计算数据中的宿主序列比例，具体结果如表10所示：
表10
去除宿主后的序列同自主开发的包含有9705种微生物序列信息的病原数据库进行比对，并通过分析，获得样本含有的病原微生物物种信息，如表11所示：
表11
根据表9-11结果可知，采用本发明方法进行病原检测，其匹配的病原体read数与基因覆盖度相比于现有技术，检测结果更为准确、可靠。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法为非疾病的诊断方法，所述方法包括如下步骤：
核酸提取；
高通量测序文库构建；
测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；
高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；
结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析；
所述高通量测序文库构建方法包括步骤：
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库；
所述结果分析步骤的分析方法包括步骤：
S401，将样本测序数据进行拆分，
S402，计算数据中的宿主序列比例，
S403，去除宿主序列，
S404，将剩余序列与病原数据库进行比对，具体方法包括步骤：
S501，生成数据库哈希索引，基于特定序列长度s对数据库包含的碱基序列进行拆分，以碱基序列作为哈希索引，存储碱基序列所在基因组位置列表信息；
S502，序列局部比对，将查询序列拆分为同样长度的碱基片段，通过哈希碰撞在哈希索引中查找对应序列，并获取该片段在基因组中的位置信息；
S503，计算测序序列在参考序列不同位置的编辑距离，查找最佳比对结果；
S504，统计比对结果并输出，根据序列差异计算测序序列与数据库参考序列之间的距离，若最佳比对结果编辑距离为m，根据预设的编辑距离范围n，查找编辑距离最小为m，最大为n的比对结果，并将结果输出；
其中，步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，Buffer EB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，X＜12，
反应条件为：
所述片段化酶反应体系还包括聚乙二醇2000，按体积份数计，所述聚乙二醇2000的含量为0.1-0.3份，所述片段化酶反应体系中还包括0.02-0.04份的聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)。
2.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：
末端修复产物10-20份，连接缓冲液5-8份，连接酶2-5份，带有标签序列的接头4-6份，Buffer EB 0.5-2份，其中，所述连接酶浓度为500-800U/μl，
反应条件为，
3.根据权利要求1-2任一种所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：步骤S103中，对步骤S102中的产物通过磁珠进行纯化，所述通过磁珠进行纯化的步骤包括：
S201，吸取10-30μL Buffer EB 和30-50μL DNA Clean Beads至20-40μL接头连接反应产物中，充分混匀；
S202，室温孵育1-10min；
S203，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
S204，继续在外部磁场的作用下，加入100-300μL的70-90％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育10-60s，移除上清；
S205，将所述磁珠暴露在空气中干燥5-10min；
S206，将磁珠加入10-30μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置1-10min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取10-20μl上清液，即为纯化产物。
4.根据权利要求3所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述S204中，所述乙醇溶液中，含有0.02-0.05mol/L的氯化钾。
5.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述将样本测序数据进行拆分的方法为，每一个文库两端所连接的接头上都有一个特异的标签序列，数据下机后，会根据每一条序列上测得的标签序列将不同的reads分配至不同的文库下。
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