CN111013508A - 一种羧基生物磁珠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的提供了一种羧基生物磁珠的制备方法，该方法通过羧基化磁性微球的制备、羧基化磁性微球的活化和羧基生物磁珠的制备三个步骤制备得到羧基生物磁珠，该羧基生物磁珠将含唾液酸的胎球蛋白结合在羧基化磁性微球上制成羧基生物磁珠，使得胎球蛋白中的唾液酸作为流感病毒的受体从而富集流感病毒，该羧基生物磁珠可以用于大体积的生物样品的检测，且该羧基生物磁珠生物磁珠的指标简单，试剂与设备的要求低，且制备得到的羧基生物磁珠的稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羧基生物磁珠的制备方法。
背景技术
生物磁珠是指具有细小粒径的超顺磁微球，一般具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。其次，具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降。再次，具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。
唾液酸（Sialicacid）唾液酸是9-碳单糖的衍生物，它不仅具有"诱导"入侵病菌的作用，目前认知是神经节苷脂的传递递质，并且是大脑的组成部分，唾液酸同时也是流感病毒的受体，是流感病毒结合在黏液细胞中的结合位点。在胎球蛋白的寡糖两端含有丰富的唾液酸。
将含有含有唾液酸的胎球蛋白和生物磁珠相结合用来富集流感病毒暂无报道。
发明内容
为了解决上述问题本发明提供一种羧基生物磁珠的制备方法。该羧基生物磁珠可以富集流感病毒，用于临床检测，本发明的内容如下：
本发明的目的在于提供一种羧基生物磁珠的制备方法，其技术点在于：所述的羧基生物磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤1：羧基化磁性微球的制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合均匀溶解于水中，调节pH至9~11，70~80℃下反应0.5~1h，然后滴加入油酸于50~90℃下反应0.5~1h得到混合物，反应结束后将所述的混合物进行磁分离，制得羧基化磁性微球；
步骤2：羧基化磁性微球的活化：将步骤1制备得到的羧基化磁性微球放置于离心管中于混合仪上振荡5～10min，然后将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，去除上清液，分两次加入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液进行洗涤，随后再加入碳二亚胺混合均匀，于20~30℃条件下，在混合仪上活化20~40min；
步骤3：羧基生物磁珠的制备：在步骤2制备活化后羧基化磁性微球中含唾液酸的胎球蛋白溶液，于2~6℃温度下偶联，反应3~4h后离心得到上清液和沉淀，弃上清，用PBS缓冲液重悬活化后羧基化磁性微球，再加入甘氨酸溶液，室温振荡20~40min后弃去上清，用PBS缓冲液重悬制得羧基生物磁珠。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合物的重量：水的体积：油酸的体积=（5~6.4）g：72mL：（2~3）mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的重量之比为（1~2）：4。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中调节pH的溶液为浓氨水，所述的浓氨水的添加量为8~12mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1羧基化磁性微球的制备在N2保护下搅拌进行。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤2中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液的物质的量浓度为和碳二亚胺的物质的量浓度为均10~20mmol·L−1。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中添加的含唾液酸的胎球蛋白溶液的重量为100~200mL，所述的含唾液酸的胎球蛋白溶液的浓度为30~40μg/mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中PBS缓冲液的pH为7~8，所述的PBS缓冲液的用量为600~1000μL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中甘氨酸溶液的物质得量浓度为0.001~0.05mol/L，所述的甘氨酸溶液的用量为200~600μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明采用油酸进行羧基化反应制备得到羧基纳米磁珠，由于油酸属于一种单不饱和Omega-9脂肪酸，存在于动植物体内，即使制备得到的羧基纳米磁珠含有少量的油酸也不会对后续的含唾液酸的胎球蛋白的活性产生不良影响，提高了该羧基生物磁珠的生物活性。
2、本发明的一种羧基生物磁珠的制备方法是将含唾液酸的胎球蛋白结合在羧基化磁性微球上制成羧基生物磁珠，使得胎球蛋白中的唾液酸作为流感病毒的受体从而富集流感病毒，在制备的过程中，本发明添加了甘氨酸，其中甘氨酸同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，由于含有含唾液酸的胎球蛋白也同时具有酸性和碱性官能团，基于物质的相似像容性甘氨酸的添加可以使得含唾液酸的胎球蛋白更好的粘结在羧基化磁性微球表面，增加制备得到的羧基生物磁珠的活性，从而该羧基生物磁珠可以用于大体积的生物样品的检测。
3、在制备种羧基生物磁珠时，本发明的所用的羧基化材料为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物（生物缓冲剂）和碳二亚胺（失水剂）联合使用使得该羧基生物磁珠的稳定性更好，且由于2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物为能液-固界面的性质，使得羧基能和磁珠更好的结合，且该羧基生物磁珠生物磁珠的指标简单，试剂与设备的要求低，且制备得到的羧基生物磁珠的稳定性好。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，本发明的涉及到的试剂，如无特殊说明均为市售。
实施例1
一种羧基生物磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤1：羧基化磁性微球的制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合均匀溶解于水中，调节pH至10，75℃下反应0.75h，然后滴加入油酸于70℃下反应0.75h得到混合物，反应结束后将所述的混合物进行磁分离，制得羧基化磁性微球；
步骤2：羧基化磁性微球的活化：将步骤1制备得到的羧基化磁性微球放置于离心管中于混合仪上振荡7min，然后将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，去除上清液，分两次加入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液进行洗涤，随后再加入碳二亚胺混合均匀，于25℃条件下，在混合仪上活化30min；
步骤3：羧基生物磁珠的制备：在步骤2制备活化后羧基化磁性微球中含唾液酸的胎球蛋白溶液，于4℃温度下偶联，反应3.5h后离心得到上清液和沉淀，弃上清，用PBS缓冲液重悬活化后羧基化磁性微球，再加入甘氨酸溶液，室温振荡30min后弃去上清，用PBS缓冲液重悬制得羧基生物磁珠。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合物的重量：水的体积：油酸的体积=5.7g：72mL：2.5mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的重量之比为1.5：4。
其中，步骤1中调节pH的溶液为浓氨水，所述的浓氨水的添加量为10mL。
其中，步骤1羧基化磁性微球的制备在N2保护下搅拌进行。
其中，步骤2中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液的物质的量浓度为和碳二亚胺的物质的量浓度为均15mmol·L−1。
其中，步骤3中添加的含唾液酸的胎球蛋白溶液的重量为150mL，所述的含唾液酸的胎球蛋白溶液的浓度为35μg/mL。
其中，步骤3中PBS缓冲液的pH为7.5，所述的PBS缓冲液的用量为800μL。
其中，步骤3中甘氨酸溶液的物质得量浓度为0.008mol/L，所述的甘氨酸溶液的用量为400μL。
实施例2
一种羧基生物磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤1：羧基化磁性微球的制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合均匀溶解于水中，调节pH至9，70℃下反应1h，然后滴加入油酸于50℃下反应1h得到混合物，反应结束后将所述的混合物进行磁分离，制得羧基化磁性微球；
步骤2：羧基化磁性微球的活化：将步骤1制备得到的羧基化磁性微球放置于离心管中于混合仪上振荡5min，然后将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，去除上清液，分两次加入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液进行洗涤，随后再加入碳二亚胺混合均匀，于20℃条件下，在混合仪上活化40min；
步骤3：羧基生物磁珠的制备：在步骤2制备活化后羧基化磁性微球中含唾液酸的胎球蛋白溶液，于2℃温度下偶联，反应4h后离心得到上清液和沉淀，弃上清，用PBS缓冲液重悬活化后羧基化磁性微球，再加入甘氨酸溶液，室温振荡20min后弃去上清，用PBS缓冲液重悬制得羧基生物磁珠。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合物的重量：水的体积：油酸的体积=5g：72mL：2mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的重量之比为1：4。
其中，步骤1中调节pH的溶液为浓氨水，所述的浓氨水的添加量为8mL。
其中，步骤1羧基化磁性微球的制备在N2保护下搅拌进行。
其中，步骤2中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液的物质的量浓度为和碳二亚胺的物质的量浓度为均10mmol·L−1。
其中，步骤3中添加的含唾液酸的胎球蛋白溶液的重量为100mL，所述的含唾液酸的胎球蛋白溶液的浓度为30μg/mL。
其中，步骤3中PBS缓冲液的pH为7，所述的PBS缓冲液的用量为600μL。
其中，步骤3中甘氨酸溶液的物质得量浓度为0.001mol/L，所述的甘氨酸溶液的用量为200μL。
实施例3
一种羧基生物磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤1：羧基化磁性微球的制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合均匀溶解于水中，调节pH至11，80℃下反应0.5h，然后滴加入油酸于90℃下反应0.5h得到混合物，反应结束后将所述的混合物进行磁分离，制得羧基化磁性微球；
步骤2：羧基化磁性微球的活化：将步骤1制备得到的羧基化磁性微球放置于离心管中于混合仪上振荡10min，然后将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，去除上清液，分两次加入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液进行洗涤，随后再加入碳二亚胺混合均匀，于30℃条件下，在混合仪上活化20min；
步骤3：羧基生物磁珠的制备：在步骤2制备活化后羧基化磁性微球中含唾液酸的胎球蛋白溶液，于6℃温度下偶联，反应3h后离心得到上清液和沉淀，弃上清，用PBS缓冲液重悬活化后羧基化磁性微球，再加入甘氨酸溶液，室温振荡40min后弃去上清，用PBS缓冲液重悬制得羧基生物磁珠。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合物的重量：水的体积：油酸的体积=6.4g：72mL：3mL。
在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的重量之比为2：4。
其中，步骤1中调节pH的溶液为浓氨水，所述的浓氨水的添加量为12mL。
其中，步骤1羧基化磁性微球的制备在N2保护下搅拌进行。
其中，步骤2中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液的物质的量浓度为和碳二亚胺的物质的量浓度为均20mmol·L−1。
其中，步骤3中添加的含唾液酸的胎球蛋白溶液的重量为200mL，所述的含唾液酸的胎球蛋白溶液的浓度为40μg/mL。
其中，步骤3中PBS缓冲液的pH为8，所述的PBS缓冲液的用量为1000μL。
其中，步骤3中甘氨酸溶液的物质得量浓度为0.05mol/L，所述的甘氨酸溶液的用量为600μL。
实验例
将为添加甘氨酸其余方法同实施例1制备得到的生物磁珠记作对比例1，将实施例1中的“入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物”替换成“ N- 羟基琥珀酰亚胺”其余方法同实施例1制备得到的生物磁珠记作对比例2，取相同重量的实施例1~3和对比例1和对比例2的生物磁珠，用SEM观察其表面的分散情况，测定其在-4℃和80℃下羧基生物磁珠的生物活性，以及其耐酸碱能力，具体见表1：
表1
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的羧基生物磁珠的制备方法包括以下步骤：
步骤1：羧基化磁性微球的制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合均匀溶解于水中，调节pH至9~11，70~80℃下反应0.5~1h，然后滴加入油酸于50~90℃下反应0.5~1h得到混合物，反应结束后将所述的混合物进行磁分离，制得羧基化磁性微球；
步骤2：羧基化磁性微球的活化：将步骤1制备得到的羧基化磁性微球放置于离心管中于混合仪上振荡5～10min，然后将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，去除上清液，分两次加入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液进行洗涤，随后再加入碳二亚胺混合均匀，于20~30℃条件下，在混合仪上活化20~40min；
步骤3：羧基生物磁珠的制备：在步骤2制备活化后羧基化磁性微球中含唾液酸的胎球蛋白溶液，于2~6℃温度下偶联，反应3~4h后离心得到上清液和沉淀，弃上清，用PBS缓冲液重悬活化后羧基化磁性微球，再加入甘氨酸溶液，室温振荡20~40min后弃去上清，用PBS缓冲液重悬制得羧基生物磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合物的重量：水的体积：油酸的体积=（5~6.4）g：72mL：（2~3）mL。
3.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的重量之比为（1~2）：4。
4.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中调节pH的溶液为浓氨水，所述的浓氨水的添加量为8~12mL。
5.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤1羧基化磁性微球的制备在N2保护下搅拌进行。
6.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液的物质的量浓度为和碳二亚胺的物质的量浓度为均10~20mmol·L−1。
7.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中添加的含唾液酸的胎球蛋白溶液的重量为100~200mL，所述的含唾液酸的胎球蛋白溶液的浓度为30~40μg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中PBS缓冲液的pH为7~8，所述的PBS缓冲液的用量为600~1000μL。
9.根据权利要求1所述的一种羧基生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中甘氨酸溶液的物质得量浓度为0.001~0.05mol/L，所述的甘氨酸溶液的用量为200~600μL。
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