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CN111011605A - 一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111011605A CN201911161997.8A CN201911161997A CN111011605A CN 111011605 A CN111011605 A CN 111011605A CN 201911161997 A CN201911161997 A CN 201911161997A CN 111011605 A CN111011605 A CN 111011605A
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Abstract

本发明公开了一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂及其制备方法和应用，该促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂主要由以下重量百分比的原料所制成：淫羊藿苷2‑10％，米糠40‑50％，玉米蛋白粉40‑50％。本发明的饲料添加剂填补目前通过外源饲料添加剂对河蟹卵黄发育和卵黄发生调控的空白，本发明以淫羊藿苷作为主要有效物质，辅以米糠和玉米蛋白粉制成均一的饲料添加剂的能够促进河蟹生长、促进河蟹性激素的分泌、卵黄发生和卵巢发育水平；并且质量安全可控、供应可靠、使用方便，效果显著。

Description

一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于水产动物添加剂技术领域，为一种蟹类饲料添加剂，具体涉及一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂及其制备方法和应用。
背景技术
河蟹是我国重要的经济养殖蟹类，产量呈逐年上升趋势。据联合国粮农组织数据统计，2016年中国河蟹的养殖产量已达到812,103吨。在甲壳动物的人工养殖过程中，投喂天然食物还是人工饲料的比较一直困扰着甲壳动物的水产养殖业。冰鲜鱼曾作为蟹类养殖中的主要饵料来源，但随着河蟹养殖产业的发展，冰鲜鱼、螺蛳等传统型天然饵料资源数量下降、营养成分不均衡、水环境污染、携带病原体、有机污染物及毒素，且无法在源头端控制已无法满足其健康和可持续养殖需求。因此，养殖过程中人工配合饲料的研发与应用，逐渐被广大养殖户所接受。人工饲料的优点是质量安全可控，供应可靠，使用方便。但是，越来越多的试验发现天然饵料中含有很多激素活性物质和未知的成熟刺激因子，能够促进河蟹的卵巢发育和卵黄发生。与天然食物相比，人工饲料缺乏天然饵料含有的能够促进卵巢发育和卵黄发生的类固醇激素，特别是雌激素，因此人工饲料的投喂往往会造成甲壳动物的性腺发育和卵巢成熟迟缓，性腺指数低，蟹黄肥满度差，进而导致延时上市，对经济效益造成一定程度的损失。
甲壳动物的卵黄发生是指各种卵黄营养物质(脂类、蛋白质、碳水化合物等)的形成和在卵母细胞内的积累，是卵母细胞发育成熟的决定性因素，它以血淋巴中卵黄蛋白原浓度的大量增加和卵巢的发育为特征，对于甲壳动物亲本的生殖周期、胚胎和幼体的发育至关重要。研究发现，通过外源注射性激素，如雌二醇，孕酮等，或通过切除河蟹眼柄能够促进河蟹的卵黄发生和卵巢发育，但是此类技术并不适合应用于河蟹的健康养殖和生产上。解决河蟹卵巢发育迟缓、转变传统天然饵料养殖模式、大力推广人工配合饲料推广和应用问题的切入点一定是开发一种绿色健康的饲料添加剂能够促进河蟹自身的性激素分泌，卵黄发生和卵巢发育。
目前关于淫羊藿苷的研究和应用仅局限于人类临床医学和药理学实验上，如对肾脏疾病的防治，对雄性生殖功能障碍的防治，将其作为一种中草药植物提取物饲料添加剂应用于甲壳动物健康养殖中尚属空白。为此，研制一种健康高效的饲料添加剂以调控蟹体本身的性激素分泌及卵黄发生对于河蟹人工配合饲料的推广和应用意义重大。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，填补目前通过外源饲料添加剂对河蟹卵黄发育和卵黄发生调控的空白，本发明得添加剂的应用能够促进河蟹生长、促进河蟹性激素的分泌、卵黄发生和卵巢发育水平。
本发明还提供所述促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，主要由以下重量百分比的原料所制成：淫羊藿苷2-10％，米糠40-50％，玉米蛋白粉40-50％。
作为优选，主要由以下重量百分比的原料所制成：淫羊藿苷5-10％，米糠45-50％，玉米蛋白粉45-50％。
进一步地，所述按重量百分比淫羊藿苷5％，米糠45％，玉米蛋白粉50％。
本发明所述促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂的制备方法，其包括如下步骤：分别称取一定重量份的淫羊藿苷，米糠，玉米蛋白粉，按照逐级预混的原则，先将一定重量份的淫羊藿苷和一定重量份的米糠混匀，再加入一定重量份的玉米蛋白粉混合均匀即可。
本发明所述促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂在制备促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料和药物中的应用。
其中，所述促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂的添加量为基础饲粮质量的1‰-2‰。
其中，所述促进河蟹卵巢发育为河蟹卵巢发育的Ⅱ-Ⅲ期。
本发明所述的促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料，包括促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂和用于河蟹养殖的基础饲粮。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明以淫羊藿苷作为主要有效物质，辅以米糠和玉米蛋白粉制成均一的饲料添加剂；本发明以淫羊藿苷为主要有效物质的混合饲料添加剂促进河蟹生长和存活。本发明的饲料添加剂经试验证明该添加剂促进河蟹生长和存活，显著提高了河蟹的卵巢指数(88.8％-130.3％)，卵母细胞体积(125.4％-204.8％)，雌激素合成量(67.5％-101.0％)，卵巢芳香化酶蛋白表达量(23.5-59.9倍)，血淋巴中卵黄蛋白原的含量(30.6％-35.9％)，肝胰腺和卵巢组织卵黄蛋白原分子表达量(1.7-4.4倍)和蛋白表达量(29.5-92.1倍)，有效地促进河蟹的卵巢发育和卵黄发生。本发明的饲料添加剂混合物内的米糠作为载体，米糠相较于麸皮流动性更好，能使混合更均匀。玉米蛋白粉呈金黄色具有使卵巢着色的功效，进而从多方面促进河蟹的卵巢发育。
本发明的饲料添加剂可以有效应用在制备提高河蟹卵巢发育性能饲料中。与传统采用单侧眼柄摘除或外源注射雌激素方式相比，本发明无需摘除母蟹的眼柄，不会造成蟹体伤害及破坏内分泌系统，也不会对营养品质带来危险和激素残留风险；与传统天然饵料(冰冻杂鱼、螺蛳等)资源日趋匮乏、营养成分不均衡、携带病原体毒素且无法在源头端控制相比，本发明质量安全可控、供应可靠、使用方便，效果显著，有助于人工配合饲料在河蟹养殖产业的大规模推广和应用。
本发明的饲料添加剂来源广泛，制备简单，使用方便，可以大规模生产应用。
附图说明
图1是河蟹卵巢组织切片图；
图2是河蟹卵巢芳香化酶蛋白表达图；
图3是河蟹肝胰腺和卵巢的卵黄蛋白原基因的表达图；
图4是河蟹肝胰腺和卵巢卵黄蛋白原蛋白表达图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，由以下原料按重量百分比组成：淫羊藿苷5％，米糠45％，玉米蛋白粉50％，准确称取此配比的三种原料按照逐级预混的原则将彻底混匀即可制成。
实施例2
促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，由以下原料按重量百分比组成：淫羊藿苷2％，米糠48％，玉米蛋白粉50％，准确称取此配比的三种原料按照逐级预混的原则彻底混匀即可制成。
实施例3
促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，由以下原料按重量百分比组成：淫羊藿苷10％，米糠40％，玉米蛋白粉50％，准确称取此配比的三种原料按照逐级预混的原则彻底混匀即可制成。
实施例4
促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，由以下原料按重量百分比组成：淫羊藿苷10％，米糠45％，玉米蛋白粉45％，准确称取此配比的三种原料按照逐级预混的原则彻底混匀即可制成。
实施例5
促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，由以下原料按重量百分比组成：淫羊藿苷10％，米糠50％，玉米蛋白粉40％，准确称取此配比的三种原料按照逐级预混的原则彻底混匀即可制成。
实施例6
饲料的制备
采用实施例1制备的促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，分别在基础饲粮中添加重量比为0、1‰和2‰的饲料添加剂，基础饲粮以鱼粉、豆粕、花生粕和菜粕为蛋白源，豆油和鱼油为脂肪源，α-淀粉为唯一糖源配制而成。具体配方(质量百分比)见表1。饲料原料逐级混匀，使用绞肉机制成直径4mm,长10mm的颗粒,室温阴干备用。
表1.实施例1饲料配方
Figure BDA0002284638280000041
Figure BDA0002284638280000051
注：复合预混料提供以下矿物质(g/kg饲料)和维生素(IU或mg/kg饲料)：CuSO4·5H2O,2.0g；FeSO4·7H2O,25g；ZnSO4·7H2O,22g；MnSO4·4H2O,7g；Na2SeO3,0.04g；KI,0.026g；CoCl2·6H2O,0.1g；维生素A，1,500,000IU；维生素D，200,000IU；维生素E，5,000mg；维生素K5,220mg；维生素B1,320mg；维生素B2,1090mg；维生素B5,2000mg；维生素B6,500mg；维生素B12,1.6mg；维生素C，14,000mg；泛酸，1,000mg；叶酸，230mg；胆碱，60,000mg；生物素，130mg；肌醇，45,000mg；烟酸，3,000mg。复合预混料可购买市售蟹用复合预混料，购买公司南京华牧动物科技研究所有限公司。淫羊藿苷购买自南通飞宇生物科技有限公司。米糠和玉米蛋白粉及饲料配方中的其他原料均购买自江苏海普瑞饲料有限公司。
实施例7
试验河蟹及饲养管理
将本发明实施例6的添加剂组合物(饲料添加剂和基础饲粮的饲料)进行河蟹室外水泥池养殖试验，选择150只初重为33.5g左右的河蟹为试验研究对象，随机分为三个处理，每个处理5个重复，每个重复10只母蟹。养殖试验在水泥池(长×宽×高＝1m×1m×0.8m)内进行，正式养殖周期为8周，试验期间，水温范围为26±2℃；溶解氧保持在5.0毫克/升以上；pH值为8.5至8.6，养殖试验结束后进行后续各项指标的测定。
1、生长性能的测定
试验结束后，对三组河蟹进行计数，使用纸巾将每只河蟹体表的水分擦干，并称取末重，统计存活率，计算增重率和特定生长率，计算公式如下：增重率(％)＝100×(末重-初重)/初重；特定生长率(％/天)＝100×(Ln末重-Ln初重)/试验天数；存活率(％)＝100×终数量/初始数量；结果见表2。
表2.河蟹生长性能
Figure BDA0002284638280000052
Figure BDA0002284638280000061
注：相同列不同字母表示差异显著(P<0.05)
本发明的饲料添加剂对河蟹的生长性能有显著提升效果，由表2可以看出，与对照组相比，本发明调控剂显著提高了河蟹的末重(4.9％-12.4％)、增重率(9.9％-27.4％)，特定生长率(6.36％-18％)和存活率(4.8％-6.3％)。
2、河蟹卵巢指数和卵母细胞参数的测定
养殖试验结束后，将每只河蟹(即养殖8周后每组存活下来螃蟹，下同)的卵巢完整取出，精确称重，计算卵巢指数，公式如下：卵巢指数(％)＝100×卵巢湿重/河蟹体重。随后，取一小块卵巢组织在Bouin’s溶液中固定24小时，然后在不同梯度浓度的乙醇溶液中逐渐脱水，二甲苯清洗之后，用石蜡包埋成蜡块。用切片机(Leica RM 2016，LeicaMicrosystems Inc.，Bannockburn，IL，USA)制备成厚度约为5-7um的卵巢组织切片，然后用苏木精-伊红(HE)染色，组织学观察和测量在配有自动数码相机系统(Nikon IDXM 1200,Nikon Co.,Shinagawa-ku,Tokyo,Japan)的光学显微镜(Olympus BX-41,OlympusCorporation,Shinjuku-ku,Tokyo,Japan)下进行。使用Image-Pro Plus软件(mediacontrolnetics inc，bethesda，md，usa)测量，统计卵母细胞及细胞核的长径短径，计算卵母细胞的体积和核质比，计算公式如下：卵母细胞体积＝0.523×最长短径2×最长长径；核质比(％)＝100×细胞核体积/卵母细胞体积；结果见图1和表3。
表3.河蟹卵巢指数和卵母细胞参数统计
Figure BDA0002284638280000062
注：相同列不同字母表示差异显著(P<0.05)
本发明的饲料添加剂对河蟹的卵巢指数和卵母细胞体积有显著影响，由图1和表3可以看出，与对照组相比，本发明调控剂显著增加了河蟹卵母细胞的体积(125.4％-204.8％)，显著提高了河蟹的卵巢指数(88.8％-130.3％)。
3、河蟹血淋巴雌二醇和卵黄蛋白原含量的测定
养殖试验结束后，用预先抽取0.5mL抗凝剂的1mL无菌注射器于第三步足基部抽取血淋巴0.5mL，血淋巴和4℃预冷的抗凝剂的比例为1:1，抗凝剂的组成参照文献描述为：100mmol L-1葡萄糖，26mmol L-1柠檬酸盐，30mmol L-1柠檬酸，450mmol L-1氯化钠和10mmol L-1EDTA，PH值＝7.2(E.T.Jia,X.C.Zheng,H.H.Cheng,J.Liu,X.F.Li,G.Z.Jiang,W.B.Liu,D.D.Zhang,Dietary fructooligosaccharide can mitigate the negativeeffects of immunity on Chinese mitten crab fed a high level of plant proteindiet,Fish Shellfish Immunol.84(2019)100–107.)。抽取的血淋巴立即于4℃，以9000转/分钟的转速离心20分钟，上清液中的雌二醇和卵黄蛋白原含量用基于磁性粒子的酶联免疫吸附法ELISA试剂盒进行定量测定，测定方法按制造商说明书逐步进行，试剂盒购买自北京瑞格博科技发展有限公司，结果见表4。
表4.河蟹血淋巴雌二醇和卵黄蛋白原的含量
Figure BDA0002284638280000071
本发明的饲料添加剂显著提升了河蟹血淋巴雌二醇和卵黄蛋白原的含量，由表4可以看出，与对照组相比，本发明显著提高了河蟹血淋巴中雌二醇(67.5％-101.0％)和卵黄蛋白原的含量(30.6％-35.9％)。
4、河蟹卵巢芳香化酶蛋白表达的测定
卵巢蛋白的提取，变性，制胶，加样，电泳，转膜，封闭，洗脱，一抗孵育，二抗孵育和显影按照文献的试验操作流程(Cao,X.F.,High-fat diet induces aberrant hepaticlipid secretion in blunt snout bream by activating endoplasmic reticulumstress-associated IRE1/XBP1 pathway.Biochim.Biophys.Acta,Mol.CellBiol.Lipids.1864,213-223)；Western blot图像用数码相机(EOS D60；Canon,Tokyo,Japan)拍摄，结果分析采用ImageJ 1.44p(U.S.National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)图像分析软件分析Western blotting的蛋白条带结果。芳香化酶蛋白抗体购买自美国abcam公司(#ab124776,abcam)，内参β-actin抗体购买自美国abcam公司(#ab8226,abcam)。结果见图2.
本发明的饲料添加剂显著促进河蟹卵巢芳香化酶蛋白的表达，由图2可以看出，与对照组相比，本发明显著提高了卵巢芳香化酶蛋白的表达(23.5-59.9倍)。
5、河蟹肝胰腺和卵巢卵黄蛋白原基因表达的测定
肝胰腺和卵巢组织RNA提取及其目的基因卵黄蛋白基因的PCR定量，均参照按照文献的实验操作流程(E.T.Jia,Dietary fructooligosaccharide can mitigate thenegative effects of immunity on Chinese mitten crab fed a high level of plantprotein diet,Fish Shellfish Immunol.84(2019)100–107)；目的基因卵黄蛋白基因(f:5'cgctcctgctgagcaaaca-3'和r:5'-tggggcgaataggaaagg-3')(Pan,J.；Immunolocalization and changes of 17beta-estradiol during ovarian developmentof Chinese mitten crab Eriocheir Sinensis.Cell Tissue Res.2018,373,509-520.)和内参基因S27(f:5'-ggtcgatgaagagagcaagga-3'和r:5'-ccacagtactgggcgtcaaa-3')(Huang,S.；Wang,C.H.Selection of appropriate reference genes for qPCR in theChinese mitten crab,Eriocheir sinensis(Decapoda,Varunidae).Crustaceana 2017,90,275–296.)的特异性引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；结果见图3。
本发明的饲料添加剂显著促进河蟹肝胰腺和卵巢组织卵黄蛋白原基因的表达，由图3可以看出，与对照组相比，本发明显著提高了卵巢卵黄蛋白原mRNA的表达(4.2-4.4倍)和肝胰腺卵黄蛋白原mRNA的表达(1.7-1.85倍)。
6、河蟹肝胰腺和卵巢卵黄蛋白原蛋白表达的测定
肝胰腺和卵巢蛋白的提取，变性，制胶，加样，电泳，转膜，封闭，洗脱，一抗孵育，二抗孵育和显影按照文献的试验操作流程(Cao,X.F.,High-fat diet induces aberranthepatic lipid secretion in blunt snout bream by activating endoplasmicreticulum stress-associated IRE1/XBP1 pathway.Biochim.Biophys.Acta,Mol.CellBiol.Lipids.1864,213-223)；Western blot图像用数码相机(EOS D60；Canon,Tokyo,Japan)拍摄，结果分析采用ImageJ 1.44p(U.S.National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)图像分析软件分析Western blotting的蛋白条带结果。卵黄蛋白原蛋白抗体(#abs119855,absin)购买自爱必信(上海)生物科技有限公司；结果见图4。
本发明的饲料添加剂显著促进河蟹肝胰腺和卵巢卵黄蛋白原蛋白的表达，由附图4可以看出，与对照组相比，本发明显著促进了肝胰腺卵黄蛋白原蛋白的表达(29.5-55.7倍)，显著促进了卵巢卵黄蛋白原蛋白的表达(72.3-92.1倍)。
本发明还开展了其他实施例，即在基础饲粮基础上额外添加重量比为3‰和4‰的该饲料添加剂，实验结果发现，该饲料添加剂对河蟹生长性能和卵巢发育相关指标的促进作用与2‰添加重量比组相比出现下降，该试验结果表明添加重量比1‰-2‰的饲料添加剂具有更好地促进河蟹卵巢发育和卵黄发生效果。究其原因可能为:过高的该饲料添加剂添加剂量会造成河蟹的基础代谢负担，提升代谢压力，造成氧化应激，进而造成促进效果的下降。因此，综合考虑成本和促进效果，选择1‰-2‰的添加量为促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的最适添加剂量。该结果符合营养性添加剂试验的结果逻辑。同时实施例2-5制备的促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂效果与实施例1一致。
综上所述，该以淫羊藿苷为主要有效物质的混合饲料添加剂能够促进河蟹生长，显著提高河蟹性腺指数、卵母细胞体积、卵黄蛋白含量、雌激素分泌和卵黄蛋白原基因的表达，促进河蟹卵巢发育。

Claims (7)

1.一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，其特征在于，主要由以下重量百分比的原料所制成：淫羊藿苷2-10％，米糠40-50％，玉米蛋白粉40-50％。
2.根据权利要求1所述的促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂，其特征在于，主要优选由以下重量百分比的原料所制成：淫羊藿苷5-10％，米糠45-50％，玉米蛋白粉45-50％。
3.一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：分别称取淫羊藿苷，米糠，玉米蛋白粉，按照逐级预混的原则将三种原料混合均匀即可。
4.一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂在制备促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料和药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂的添加量为基础饲粮质量的1‰-2‰。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进河蟹卵巢发育为河蟹卵巢发育的Ⅱ-Ⅲ期。
7.一种促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料，其特征在于，包括促进河蟹卵巢发育和卵黄发生的饲料添加剂和用于河蟹养殖的基础饲粮。
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