CN111019998A - 一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法及装置，该方法基于纳米材料靶向差异增强异质循环肿瘤细胞(CTCs)电阻抗的原理和阻抗谱分析方法，该方法优选使用具有稳定性好且能够靶向特异识别异质CTCs的纳米材料，与患者血液中异质CTCs靶向差异结合，根据细胞阻抗谱分析区分和定量异质循环肿瘤细胞。本发明实现异质CTCs高灵敏即时检测，无需繁琐复杂的检测流程和大型专业分析仪器进行定量信号读取，提高了检测的即时性、精度与灵敏度，降低了检测时间和成本，可广泛应用于体外诊断技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法及装置。
背景技术
癌症是威胁人类生命健康的重要致死性疾病，据统计，2018年全球约960万人因癌症死亡。研究表明，癌症监测可及早的预警、发现、诊断、治疗癌症并有效的评估其疗效，对提高癌症患者生存率具有重大意义。现常用影像学、血清学和病理学技术实现癌症的监测，但这些技术难以即时准确全面地获取癌症动态信息，如影像技术敏感度低、诊断滞后且主观判断性强；血清学检测无法直接反应癌症进展信息和治疗状态，且特异性差；病理学检测有创，且无法多次进行操作。因此，探索高效安全的癌症监测方法极为重要。
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells，CTCs)监测是一种具有前景的癌症监测手段。相较于传统癌症检测方法，CTCs检测可实时监测癌症的发生发展和抗肿瘤疗效，且具有微创、灵敏度高、可反复进行、肿瘤信息全面、实时应用和反应直观和无需专家主观判断等优势。但是，血液中的CTCs极度稀少、与白细胞极为相似且存在着极大的异质性等，使得CTCs检测变得极为困难。当前CTCs检测的研究，主要基于微流控CTCs分离系统和分离后荧光成像、表面增强拉曼光谱、DNA测序等检测方法，虽能实现异质CTCs计数和分型分析，但是难以实现异质CTCs即时高灵敏检测。因此，发展新颖有效的方法以实现异质CTCs即时高灵敏检测十分必要。
近年来，基于阻抗分析的生物传感器技术迅速发展，实现了CTCs细胞膜电容和细胞质导电率等参数的有效分析。在现有微流控CTCs分离系统基础上，有研究提出利用基于微流控技术的阻抗生物传感器对CTCs进行分离检测。但是到目前为止，因血液成分的影响、异质CTCs间极小差异以及预处理过程可能导致CTCs特征的丧失，现有传感器技术难以实现异质CTCs即时高灵敏检测。纳米材料可增强检测靶标信号进而提高生物传感器的检测灵敏度，但其在传感器中的性质(如理化特性和生物学功能)难以重现和长时间的维持，进而无法有效量化其增敏生物传感器的功能。因此，探索高性能纳米材料并将其用于差异增强异质CTCs的特性进而提高生物传感器检测灵敏度，依然是将CTCs检测用于癌症监测面临的一大挑战。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法，解决血液中CTCs数量极低、外貌形态不典型和极大异质性引起CTCs难以即时分型分析、检测精度和灵敏度低的问题，并最终提高异质CTCs即时检测灵敏度，对癌症早期诊断、精准治疗策略制定、癌症患者病情和预后实时监测等有重要的理论意义和实际应用价值。
本发明还提出实现上述方法的装置。
根据本发明的第一方面实施例的用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法，包括以下步骤：
S1、合成纳米材料，所述纳米材料为特异性抗体修饰且具有电学特性的纳米材料；
S2、将所述纳米材料与异质循环肿瘤细胞靶向差异结合；
S3、分离血液干扰成分，聚焦步骤S2得到的纳米材料靶向差异结合的异质循环肿瘤细胞；
S4、采集阻抗信息；
S5、分析电阻抗数据；
其中，所述电学特性是指阻抗为检测细胞阻抗106倍以内；所述特异性抗体指能与肿瘤细胞表面差异表达活性物质特异结合的抗体。
根据本发明第一方面实施例的方法，至少具有如下有益效果：该方法能够实现异质循环肿瘤细胞高灵敏即时检测，具有即时性、精度与灵敏度高且检测速度快和成本低的优点。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S2中纳米材料包括但不限于修饰肿瘤靶向分子或包裹水凝胶的纳米脂质体、修饰肿瘤靶向分子的金属纳米颗粒、石墨烯纳米材料或复合纳米颗粒。
作为优选的，所述肿瘤靶向分子包括但不限于Ep-CAM抗体或HER-2抗体。
根据本发明的一些实施例，根据循环肿瘤细胞的异质性以及纳米材料的作用时间和作用浓度，确定纳米材料在异质循环肿瘤细胞中的分布以及结合量；所述异质循环肿瘤细胞不同作用时间下结合纳米材料的量不同；所述纳米材料与异质循环肿瘤细胞结合方式包括位于细胞表面和位于细胞内。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S3中分开叠加循环肿瘤细胞的同时将循环肿瘤细胞聚集在一条检测线上；所述血液干扰成分包括但不限于红细胞、未标记的纳米材料和血小板。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S4包括以下步骤：
S41、采集阻抗信号；
S42、采集白细胞的阻抗信号作为第一参考信号；
S43、采集与纳米材料结合的异质循环肿瘤细胞的阻抗信号作为第二参考信号；
S44、采集检测样品与纳米材料作用后的阻抗信号作为测量信号，将测量信号与第一和第二参考信号进行对比，确定异质循环肿瘤细胞信息。
作为优选的，所述采集阻抗信号包括使用阻抗生物传感器、阻抗分析仪或便携式阻抗采集分析设备；所述阻抗信号包括背景阻抗信号、白细胞细胞阻抗信号以及异质循环肿瘤细胞的阻抗信号。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S44中，确定异质循环肿瘤细胞信息的具体操作为：所述异质循环肿瘤细胞逐一通过检测区域，借助于检测区域中的微电极阵列，通过阻抗生物传感器、阻抗分析仪或便携式阻抗采集分析设备采集的阻抗信号为单一循环肿瘤细胞的阻抗信号，通过统计分析阻抗信号的波动频率和幅度值，实现循环肿瘤细胞计数的同时实现分型分析和异质循环肿瘤细胞计数。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S5包括以下步骤：
S51、对阻抗信号进行数据预处理，所述数据预处理包括分割处理、截取处理、降噪处理和滤波处理；
S52、将已知纳米材料处理时间和浓度、异质循环肿瘤细胞类型和数量，结合纳米材料的循环肿瘤细胞阻抗信号幅值作为参考值，对测得阻抗信号进行数据分类；
S53、对分类后的体征信息进行特征提取，所述特征包括阻抗信号的幅值大小、幅值种类、对应幅值大小出现的频率次数、幅值大小和频率的变化；
S54、对提取得到的特征进行分析以确定异质循环肿瘤细胞信息，具体包括通过幅值大小确定异质循环肿瘤细胞的类型(即分型)、通过对应幅值出现的频率次数确定异质循环肿瘤细胞的个数、通过异质循环肿瘤细胞的类型和个数确定肿瘤所处的分级阶段；通过异质循环细胞的类型和个数变化能够确定治疗疗效。
作为优选的，所述步骤S51包括以下步骤：通过小波变换算法分析特征信息中的阻抗信号的幅值、幅值种类、幅值个数及其随治疗或肿瘤演变过程中的变化，确定小波变换的小波基、分解层数和阈值计算方法；根据确定的小波基、分解层数和阈值计算方法，对特征信息进行干扰滤除处理。
根据本发明的第二方面实施例的装置，所述装置包括上层芯片和下层芯片；
所述上层芯片包括样品液进口1和2、样品液出口9、循环肿瘤细胞分离区3、循环肿瘤聚焦区4、废液出口6-8和微阻抗测量通道；
所述下层芯片包括基底材料和电极阵列；所述电极阵列覆盖于基底材料上表面；
所述微阻抗测量通道覆盖于所述电极阵列上方，共同构成微阻抗测量分析区5；
所述微阻抗测量通道的一侧通过连接处与循环肿瘤聚焦区4的尾部相连；所述连接处的另一侧与样本液出口9相连。
根据本发明第二方面实施例的装置，至少具有如下有益效果：该装置通过价格便宜、制作简单且易小型化集成化的阻抗测量电极阵列代替流式细胞仪、荧光仪等大型昂贵设备，并利用纳米材料增敏其检测靶标信号，提高了检测的即时性、精度与灵敏度，降低了检测时间和成本。
根据本发明的一些实施例，所述循环肿瘤细胞分离区3为嵌入有序排列的柱型阵列的矩形凹槽，所述矩形凹槽的宽度大于深度。
作为优选的，所述矩形凹槽的长为0.5cm，宽为0.2cm，深度为50μm；所述柱型阵列由横径为24μm纵径为17μm高50μm横向中心相同纵向中心成
横向柱间距15μm横向柱间距32μm的若干微型柱组成。
根据本发明的一些实施例，所述循环肿瘤聚焦区4为矩形凹槽中嵌入有序排列的有序排列的形态对称的凹槽道阵列，所述凹槽道上下对称且其中心在一条直线上。
作为优选的，所述微阻抗测量流体通道一侧与循环肿瘤聚焦区的尾部相连，连接处宽度经100μm梯形减小至20μm，其中宽度20μm长度为50μm；另一侧与样本液出口相连，连接处宽度经梯形增大至100μm，微通道处ITO电极长宽高为1.5mm×2.5mm×100nm。
根据本发明的一些实施例，所述装置为使用上述方法对异质循环肿瘤细胞进行即时检测的装置。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中的循环肿瘤细胞即时检测方法的流程图；
图2为本发明实施例1中的循环肿瘤细胞即时检测装置的结构示意图；
图3为本发明实施例3中纳米材料与样本作用时间较短即其作用于细胞外时的等效电路图；
图4为本发明实施例3中纳米材料与样本作用时间较长即其作用于细胞内时的等效电路图。
标号说明：1、缓冲液进口；2、样本液进口；3、循环肿瘤细胞分离区；4、循环肿瘤聚焦区；5、微阻抗测量分析区；6、第一废液出口；7、第二废液出口；8、第三废液出口；9、样本液出口。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：设计阻抗高、稳定性好且能够靶向和识别异质CTCs的纳米材料和分离效果好、聚焦能力强以及阻抗测量准的阻抗生物传感器芯片，并将纳米材料应用于阻抗生物传感器芯片，利用纳米材料差异增强阻抗生物传感器检测异质CTCs的阻抗信号，通过阻抗生物传感器芯片上的阻抗测量电极阵列逐一单个测量与纳米材料靶向差异结合的CTCs的阻抗信号，异质细胞因靶点不同与纳米材料结合量不同，测的阻抗信号强度不同，异质细胞数目不同对应幅度阻抗信号出现的频率不同，根据阻抗信号幅度的强弱及对应强度出现次数，确定CTCs的异质性和实现异质CTCs的计数，实现异质CTCs即时高灵敏度检测。换言之，通过测量与纳米材料靶向差异结合的CTCs电阻抗即可进行异质CTCs定性分析和定量检测。因此，通过价格便宜、制作简单且易小型化集成化的阻抗测量电极阵列代替流式细胞仪、荧光仪等大型昂贵设备，并利用纳米材料增敏其检测靶标信号，提高了检测的即时性、精度与灵敏度，降低了检测时间和成本。
实施例1
一种用于异质循环肿瘤细胞即时诊断的新方法，能够实现异质循环肿瘤细胞的即时检测，该方法的具体的流程如图1所示，包括以下步骤：合成功能纳米材料、功能纳米材料作用于样本、分离部分血液细胞分开聚集的循环肿瘤细胞、聚焦循环肿瘤细胞、采集样本阻抗数据、分析样本阻抗数据和获得异质循环肿瘤细胞的数量和分型，上述步骤依次进行。
1、合成功能纳米材料
合成具有电学特性(阻抗为检测细胞阻抗106倍以内)的纳米材料，用能与异质循环肿瘤细胞差异表达物质(如上皮细胞粘附分子Ep-CAM和表皮生长因子受体HER-2等)特异结合的抗体(如Ep-CAM抗体和HER-2抗体)对其修饰制备功能纳米材料。
2、功能纳米材料作用于样本
一定浓度的功能纳米材料与癌症患者血液相互作用一定时间，功能纳米材料与患者血液中的异质循环肿瘤细胞靶向差异结合，其中结合方式与结合量与功能纳米材料的作用浓度和时间有关。
3、分离部分血液细胞分开聚集的循环肿瘤细胞、聚焦循环肿瘤细胞和采集样本阻抗数据
预先分离与功能纳米材料作用后的血液样本中大部分的干扰成分(如血细胞、血小板和未标记上的功能纳米材料等)，分开叠加细胞的同时将CTCs聚焦在一条检测线上，随后将待测液(其中包含液体、白细胞和异质循环肿瘤细胞)流经感知微阻抗变化的装置并记录阻抗信号。
4、分析样本阻抗数据和获得异质循环肿瘤细胞的数量和分型
异质肿瘤细胞表面表达物质(Ep-CAM和HER-2等)量不同，同一作用时间和浓度下，其结合抗体(Ep-CAM抗体和HER-2抗体等)修饰的功能纳米材料量不同，功能纳米材料增敏异质细胞阻抗效果不同，输出异质细胞阻抗信号幅值不同。异质细胞的种类和数量不同，信号出现幅值不同且每种幅值出现的频率次数不同。对记录的阻抗信号进行数据预处理(包括分割处理、截取处理、降噪处理和滤波处理等)，分析处理后阻抗信号，从中获取异质循环肿瘤细胞阻抗信号幅值、幅值种类和幅值个数，通过幅值大小确定异质循环肿瘤细胞的类型(即分型)，通过对应幅值出现的频率次数确定异质循环肿瘤细胞的个数，通过异质循环肿瘤细胞的类型和个数确定肿瘤所处的分级阶段，通过异质循环肿瘤细胞的类型和个数变化确定治疗疗效等，实现异质循环肿瘤细胞的即时检测的目的。
实施例2
参见图2，一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的装置，包括带有微流体通道的上层芯片，上层芯片微流体通道的深度小于上层芯片的厚度，第一通道位于上层芯片的下表面；上层芯片包括样品进出口区(缓冲液进口1、样本液进口2、第一废液出口6、第二废液出口7、第三废液出口8和样本液出口9)、循环肿瘤细胞分离区3、循环肿瘤聚焦区4、微阻抗测量通道；带有电极阵列的下层芯片，下层芯片包括基底材料和覆盖于基底材料上表面的ITO微图案电极阵列；上层芯片的微阻抗测量流体通道和下层芯片的电极阵列构成微阻抗测量分析区5。
在本实施例中，上层芯片的形状为长方形，长宽高为2.56cm×1.60cm×0.25cm，材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)；下层芯片的形状为圆形，直径为5cm，厚度为0.25cm，基底材料为有机玻璃(PMMA)，电极阵列材料为氧化铟锡(ITO)。
在具体实施过程中，对上、下层芯片的形状、材料没有特殊的限制，满足实际操作条件即可。例如，上下层芯片形状均可为圆形或方形，基底材料均可为PDMS、PMMA等，电极阵列材料可为氧化铟锡(ITO)、金或银等；可通过改变通道深度和宽度调节芯片的尺寸大小，芯片的面积可为1～20平方厘米，芯片的厚度可为0.1～1cm。
在本实施例中，该装置为基于微流控技术的阻抗生物传感器芯片，包括缓冲液进口1、样本进口2、循环肿瘤细胞分离区3、循环肿瘤聚焦区4、微阻抗测量分析区5、第一废液出口6、第二废液出口7、第三废液出口8和样本液出口9。
循环肿瘤细胞分离区3的设计方式为在矩形凹槽中嵌入有序排列的柱型阵列。矩形凹槽的长为0.5cm，宽为0.2cm，深度为50μm。本发明中透析单元凹槽的宽度远大于深度时，会增强作用面积，减少传输物质流动的阻力，进而有利于循环肿瘤细胞的分离以及较少工作平台动力损耗。柱型阵列由横径为24μm纵径为17μm高50μm横向中心相同纵向中心成1.7°横向柱间距15μm横向柱间距32μm的若干微型柱组成；采用这种有方法可以使样本溶液和缓冲液的速度快速均匀分布，实现循环肿瘤细胞分离区的充分基于水动力的尺寸分选和惯性分离，进而实现循环肿瘤细胞的快速高效分离；柱型阵列对细胞阻力较小，大幅度地提高细胞回收率。在其他实施例中，矩形凹槽及柱型阵列尺寸范围可变，排列方式可变。
循环肿瘤聚焦区4的设计方式为在矩形凹槽中嵌入有序排列的有序排列的形态对称的凹槽道阵列，凹槽道上下对称且其中心在一条直线上。矩形槽长宽高5mm、300μm、50μm，凹槽宽50μm高间距50μm。
微阻抗测量分析区5的设计方式为上层芯片下表面的微阻抗测量流体通道和下层芯片上表面的电极阵列构成。微阻抗测量流体通道一侧与循环肿瘤聚焦区的尾部相连，连接处宽度经100μm梯形减小至20μm，其中宽度20μm长度为50μm；另一侧与样本液出口相连，连接处宽度经梯形增大至100μm，微通道处ITO电极长宽高为1.5mm×2.5mm×100nm。
使用过程中，缓冲液和癌症患者的血液样本分别由缓冲液进口1、样本进口2流进装置。流经循环肿瘤细胞分离区3时，在水动力和惯性力作用下，血细胞、血小板和未标记上的功能纳米材料等随溶液经第三废液出口8流出，循环肿瘤细胞和部分白细胞随溶液留至循环肿瘤聚焦区4。在循环肿瘤聚焦区4中惯性和流体作用下，分散于溶液中的循环肿瘤细胞和部分白细胞聚焦于循环肿瘤聚焦区4中心线并随溶液单个逐一流至微阻抗测量分析区5，其他废液经第一废液出口6和第二废液出口7流出。循环肿瘤细胞和部分白细胞流经至微阻抗测量分析区5实现细胞微阻抗测量分析，进而实现异质循环肿瘤细胞的即时检测。
实施例3
本实施例中，异质循环肿瘤细胞使用早期阶段的乳腺癌细胞(MCF-7)和侵入性阶段的乳腺癌细胞(MDA-MB-231)；功能纳米材料为EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒功能纳米材料，纳米材料除磁性纳米颗粒外还可以使用脂质体凝胶纳米颗粒、金属纳米颗粒石墨烯纳米材料和复合纳米颗粒等，所使用的抗体还可以选用HER-2抗体等。其中，MCF-7表面靶点n为222×103个，MDA-MB-231表面靶点n为1.7×103个，MCF-7和MDA-MB-231的细胞内阻Ri、膜阻抗Rm、膜电容Cm均分别为1.47KΩ、1.38KΩ、和0.5nF，溶液电阻Rb为745Ω，纳米材料与细胞膜间的阻值Rn和电容Cme分别为120MΩ和0.1pF，纳米材料与电极间电容Ce为0.022pF，频率w范围为1000KHZ，数学复数为j。
使用2mg/ml的EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒与MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别作用5min，后对样本液使用实施例2中的装置进行检测。样本作用时间较短即其作用于细胞外时，纳米材料与溶液、循环肿瘤细胞并联，系统的等效电路图如图3所示。
电极输出阻抗计算公式如下：
Z＝1/{1/Rb+1/[1/(1/Rm+jωCm)+Ri]+1/(Re/n+1/(njωCme)+1/(njωCe))}；
结果得到，1)当MCF-7和MDA-MB-231的分别单独通过微装置时，频率为1000KHZ时，测得MCF-7和MDA-MB-231输出阻抗均为506.0Ω；2)当MCF-7和MDA-MB-231和纳米材料作用后的分别通过微装置时，MCF-7输出阻抗为260.5Ω，MDA-MB-231输出阻抗为503.2Ω。在频率为1000KHZ时，即可通过阻抗分析仪测得的输出阻抗判别异质循环肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231。
由上述结果可知，结合了纳米材料的异质循环肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231输出不同的阻抗数据，由此可分辨出是否存在肿瘤细胞及其种类。
实施例4
本实施例中，异质循环肿瘤细胞使用早期阶段的乳腺癌细胞(MCF-7)和侵入性阶段的乳腺癌细胞(MDA-MB-231)；功能纳米材料为EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒。
其中，MCF-7表面靶点n为222×103个，MDA-MB-231表面靶点n为1.7×103个，MCF-7和MDA-MB-231的细胞内阻Ri、膜阻抗Rm、膜电容Cm均分别为1.47KΩ、1.38KΩ、和0.5nF，溶液电阻Rb为745Ω，纳米材料与细胞膜间的阻值Rn和电容Cme分别为120MΩ和0.1pF，纳米材料与电极间电容Ce为0.022pF，频率f范围为1000KHZ。
使用2mg/ml的EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒与当纳米材料与MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别作用2h，后对样本液使用实施例2中的装置进行检测。当纳米材料与样本作用时间较长即其当纳米材料作用于细胞内时，纳米材料与循环肿瘤细胞串联后与溶液并联，系统的等效电路图如图4所示。
电极输出阻抗计算公式如下:
Z＝1/{1/Rb+1/[(1/Rm+jωCm)+1/(1/Ri+1/(Re/n+1/(njωCme)+1/(njωCe)))]
结果得到，1)当MCF-7和MDA-MB-231的分别单独通过微装置时，频率为1000KHZ时，MCF-7和MDA-MB-231输出阻抗均为506.0Ω；2)当MCF-7和MDA-MB-231和纳米材料作用后的分别通过微装置时，MCF-7输出阻抗为312.8Ω，MDA-MB-231输出阻抗为503.1Ω。在频率为1000KHZ即可通过阻抗分析仪测得的输出阻抗判别异质循环肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231。
由上述结果可知，结合了纳米材料的异质循环肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231输出不同的阻抗数据，由此可分辨出是否存在肿瘤细胞及其种类。
不同的纳米颗粒与肿瘤细胞有不同的结合方式，结合方式不同，阻抗输出不同，但均可以使用上述方法进行检测和分析。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
1)分析过程简单易行，无需繁琐复杂的检测流程，未经专业培训的人员也可操作；
2)使用价格较低的阻抗生物传感器进行样品前处理和定量信号测量，可实现异质CTCs的现场分析、即时定量检测提高检测即时性、降低成本和检测时间；
3)使用纳米材料靶向差异放大检测靶标信号，实现异质CTCs即时检测且提高检测灵敏度；
4)可用于少量全血的分析，可广泛应用于体外诊断技术领域。
综上所述，本发明提供的一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法及装置，该方法能够实现异质循环肿瘤细胞高灵敏即时检测，具有即时性、精度与灵敏度高且检测速度快和成本低的优点，提供的装置具有价格便宜、制作简单且易小型化集成化的优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于异质循环肿瘤细胞即时检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、合成纳米材料，所述纳米材料为特异性抗体修饰且具有电学特性的纳米材料；
S2、将所述纳米材料与异质循环肿瘤细胞靶向差异结合；
S3、分离血液干扰成分，聚焦步骤S2得到的纳米材料靶向差异结合的异质循环肿瘤细胞；
S4、采集阻抗信息；
S5、分析电阻抗数据；
其中，所述电学特性是指阻抗为检测细胞阻抗106倍以内；所述特异性抗体指能与肿瘤细胞表面差异表达活性物质特异结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中纳米材料包括但不限于修饰肿瘤靶向分子或包裹水凝胶的纳米脂质体、修饰肿瘤靶向分子的金属纳米颗粒、石墨烯纳米材料或复合纳米颗粒；所述纳米材料上修饰的肿瘤靶向分子包括但不限于Ep-CAM抗体或HER-2抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中纳米材料与异质循环肿瘤细胞靶向差异结合方式包括纳米材料结合于肿瘤细胞内和纳米材料结合于肿瘤细胞外。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中分开叠加循环肿瘤细胞的同时将循环肿瘤细胞聚集在一条检测线上；所述血液干扰成分包括但不限于红细胞、未标记的纳米材料和血小板。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括以下步骤：
S41、采集阻抗信号；
S42、采集白细胞的阻抗信号作为第一参考信号；
S43、采集与纳米材料结合的异质循环肿瘤细胞的阻抗信号作为第二参考信号；
S44、采集检测样品与纳米材料作用后的阻抗信号作为测量信号，将测量信号与第一和第二参考信号进行对比，确定异质循环肿瘤细胞信息。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S44中，确定异质循环肿瘤细胞信息的具体操作为：所述异质循环肿瘤细胞逐一通过检测区域，借助于检测区域中的微电极阵列，通过阻抗生物传感器、阻抗分析仪或便携式阻抗采集分析设备采集的阻抗信号为单一循环肿瘤细胞的阻抗信号，通过统计分析阻抗信号的波动频率和幅度值，实现循环肿瘤细胞计数的同时实现分型分析和异质循环肿瘤细胞计数。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5包括以下步骤：
S51、对阻抗信号进行数据预处理，所述数据预处理包括分割处理、截取处理、降噪处理和滤波处理；
S52、将已知纳米材料处理时间和浓度、异质循环肿瘤细胞类型和数量，结合纳米材料的循环肿瘤细胞阻抗信号幅值作为参考值，对测得阻抗信号进行数据分类；
S53、对分类后的体征信息进行特征提取，所述特征包括阻抗信号的幅值大小、幅值种类、对应幅值大小出现的频率次数、幅值大小和频率的变化；
S54、对提取得到的特征进行分析以确定异质循环肿瘤细胞信息，具体包括通过幅值大小确定异质循环肿瘤细胞的类型、通过对应幅值出现的频率次数确定异质循环肿瘤细胞的个数、通过异质循环肿瘤细胞的类型和个数确定肿瘤所处的分级阶段。
8.一种用于异质循环肿瘤细胞即时诊断的装置，其特征在于，所述装置包括上层芯片和下层芯片；
所述上层芯片包括样本液进口(1)和(2)、样本液出口(9)、循环肿瘤细胞分离区(3)、循环肿瘤聚焦区(4)、废液出口(6)-(8)和微阻抗测量通道；
所述下层芯片包括基底材料和电极阵列；所述电极阵列覆盖于基底材料上表面；
所述微阻抗测量通道覆盖于所述电极阵列上方，共同构成微阻抗测量分析区(5)；
所述微阻抗测量通道的一侧通过连接处与循环肿瘤聚焦区(4)的尾部相连；所述连接处的另一侧与样本液出口(9)相连。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述循环肿瘤聚焦区(4)为矩形凹槽中嵌入有序排列的有序排列的形态对称的凹槽道阵列，所述凹槽道上下对称且其中心在一条直线上。
10.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述装置为使用如权利要求1至7任一项所述的方法对异质循环肿瘤细胞进行即时检测的装置。
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