CN111019908A - 一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及试剂盒。a、采集待检测病毒污染的牡蛎样本，以单个牡蛎为检测对象，冲洗外壳后，解剖取其消化腺组织，并称重；b、按每0.15g消化腺组织置于2.0mL离心管中，加入1.2mL的病毒提取液进行匀浆操作，然后补齐提取液体积，混匀；c、将混匀后的匀浆液，置于37℃下300r/min转速振荡孵育25min，60℃下孵育5min；d、孵育后液体12000r/min离心5min，取上清液，在上清液中加入上清液1/2体积的PEG病毒浓缩液，混匀后室温静置5min；e、静置后溶液12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬。本发明不但能够针对单个牡蛎样本进行前处理操作，而且充分地提取出了牡蛎中的病毒颗粒，从而显著性提高了病毒回收率。

Description

一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及 试剂盒

技术领域

本发明属于食品微生物安全检测技术领域，具体涉及一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及试剂盒。

背景技术

诺如病毒是造成全球急性胃肠炎的最常见食源性病原。据世界卫生组织2015年发布的全球食源性疾病负担统计报道，每年在由传染性病原导致的约5.5亿例急性腹泻中，诺如病毒就引发了超过1.2亿例，社会经济损失逾600亿美元。诺如病毒能够感染各年龄段人群，对于婴幼儿、老人、免疫缺陷人群等高危人群，诺如病毒感染还会引发脱水性死亡。据美国CDC报道，美国每年诺如病毒感染造成超过800人的死亡；Ahmed等统计，发展中国家中每年诺如病毒感染也至少造成了20万例的儿童死亡。尽管近年来体外培养体系研究取得了重要突破，但合适感染模型的长期缺乏仍阻碍着对这种病毒的全面认识，目前仍无有效的病毒疫苗以及防控策略。

我国是诺如病毒流行的主要国家之一，在多数省市被发现是引起急性胃肠炎的主要病原，对食品安全和公共卫生工作均造成了极大威胁。广州更是我国的诺如病毒主要流行地区，尤其学校是该疫情暴发的主要场所。自2013年广州大学城数百人感染以来，诺如病毒引发了广泛关注，然而每年仍会发生多起校园疫情。其中2014年新现变异株更是引发了广东省的诺如病毒流行高峰，省卫生计生委专门发布了相关预警信息。申报团队自2010年起对广州散发性胃肠炎相关诺如病毒感染情况进行监测，早期诺如病毒为仅次于轮状病毒的第二位非细菌性病原，感染率为10％左右；然而2014年以来诺如病毒已上升为首位散发性腹泻病原，年感染率超过20％。因此，我国加强食源性诺如病毒防控研究已迫在眉睫。

诺如病毒的危害主要源于其三个重要特征。首先，极低的致病剂量。据报道，几十个病毒颗粒(～18)就能造成宿主感染，而患者样本中的病毒浓度能够达到10⁸拷贝数/g以上，因此诺如病毒极易在封闭性场所暴发疫情，例如学校、医院、养老院、军队、邮轮等。其次，多样化的传播途径与病毒的环境稳定性。贝类、浆果、叶菜、各类水体及食品从业人员等均是常见的病毒传播媒介；同时，诺如病毒对热、酸、乙醚等都均有较强的抵抗力，能够在自然环境中长时间稳定存在，室温下在污染的水、食物、环境中可以存活数周乃至数月，是食源性诺如病毒疫情暴发的潜在威胁来源。据报道，室温、pH2.7的环境下3h或20％的乙醚4℃处理18h后诺如病毒仍有感染性；可耐受普通饮用水中3.75～6.25mg/L的氯离子浓度(游离氯0.5～1.0mg/L)，在10mg/L高浓度氯离子(处理污水采用浓度)条件下才被灭活；诺如病毒对高温、冰冻、高压等也有一定的耐受度，60℃孵育30min后，病毒不能完全灭活；冰冻3个月对食品中NoV活性没有任何影响；商业上通用的烹饪高压对贝类中病毒的灭活作用有限。第三，丰富的遗传多样性。作为RNA病毒，诺如病毒极易变异，它能够通过改变自身的受体结合能力及免疫原性等特征，实现对宿主人群的持续感染并长期流行。因此，新型快速、灵敏、特异检测技术的不断发展，尤其是复杂基质的前处理技术，是提升我国诺如病毒防控能力的基础，具有重要意义。

诺如病毒基因组大约7.5～7.7kb，包括3个开放阅读框，分别编码非结构蛋白前体、衣壳蛋白VP1和次衣壳蛋白VP2。衣壳蛋白包裹病毒，易受到外界的影响而发生变异，对于逃逸宿主免疫、增强病毒粒子稳定性及适应外界变化等具有重要意义，常用作病毒分型的标准。根据其衣壳蛋白序列同源性可分成7个基因组GI-GVII，基因组之间的核酸序列同源性约46％，其中GI、GII和GIV为人源病毒。同一基因组内的核酸同源性为69％～97％，进一步分成不同的基因型，例如GI含有9个基因型，GII含有25个(并不断增加)。病毒的基因多样性增加了研究的困难，因此加强国际之间的合作，建立标准的病毒分型和命名规则，将有助于诺如病毒的深入研究。我国相应的诺如病毒监测与积累工作还不太成熟，有必要加强高风险样本与毒株的收集，同尤其重视环境与食品中的病毒污染状况的监测，这对于病毒的传播特点、分布规律以及稳定性等研究具有指导意义。

牡蛎是诺如病毒传播的重要载体之一。患者粪便中的病毒排泄到污水中被迅速地稀释，而滤食性贝类(牡蛎、扇贝、贻贝等)滤食水中微藻和有机碎屑获取食物的同时，也将水体中的病毒进行了富集，这些贝类大都养殖、收获于近海岸，而近海岸的海水往往易受到城市污水的污染，另外牡蛎养殖区水污染主要是由强降雨和污水排放造成的。病毒被富集于贝类体内并且可能在贝类体内存在较长时间，富集的病毒浓度可以达到其周围养殖水体中病毒浓度的100～1000倍，并且牡蛎的消化腺细胞存在着类似于诺如病毒受体的结构，使诺如病毒可以被高效地特异性地富集于牡蛎等贝类体内。Schwab等通过分析牡蛎组织内病毒的分布来研究诺如病毒的吸收、分布和排泄情况，结果发现无论接种病毒浓度的高低，消化道和胃均可以检测到病毒，在高浓度病毒下的检出效果更好，并且当牡蛎暴露在高浓度的诺如病毒中时，肌肉和体液细胞才能检出诺如病毒。法国及日本等地区的人们习惯生食贝类等海产品，即使采用一些烹调方法也不能完全消灭贝类中病毒，这些因素给食用贝类引起胃肠炎暴发带来了隐患。食用加工不当的污染牡蛎等贝类是导致胃肠炎暴发的最常见原因之一。各年龄段人群均可能因食用诺如病毒污染的生牡蛎而感染急性胃肠炎。2002年，来自爱尔兰Cork湾的牡蛎在香港引起了诺如病毒的暴发流行；2004年，新加坡诺如病毒的流行可能是由于食用中国进口的冷冻牡蛎造成的。日本1997～1998年暴发的诺如病毒引起的胃肠炎中，有57起(37％)与牡蛎有关。在美国，第一起报道的生食牡蛎造成的疫情发生于1980年1月的佛罗里达。在1993-1996年间路易斯安那州也暴发了三起牡蛎引起的诺如病毒疫情。2010年三个牡蛎养殖场由于造成39人因食用牡蛎感染诺如病毒而关闭了8天，从而对海产业造成很大损失。

尽管如此，牡蛎中的诺如病毒污染的浓度难以满足常见检测方法的最低限度。由于牡蛎组织中含有多糖、蛋白质等杂质，这些复杂的基质会严重抑制核酸分子检测的扩增效果。因此，牡蛎前处理技术已成为食源性病毒检测中的瓶颈环节。目前报道的牡蛎中诺如病毒检测中一般采用1.5g消化腺组织作为检测对象，前处理方法主要包括蛋白酶k法、甘氨酸-PEG法、超速离心法等。然而以上方法难以有效解决现有的问题，存在操作复杂、回收率低、抑制物难以去除等不足。因此，有必要建立一种操作简单、回收率高，并且满足高通量处理的前处理方法，从而保证牡蛎中病毒监测工作的有效开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、回收率高，能满足高通量处理的前处理方法，从而保证牡蛎中病毒监测工作的有效开展。

本发明的从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法，包括以下步骤：

a、采集待检测病毒污染的牡蛎样本，以单个牡蛎为检测对象，冲洗外壳后，解剖取其消化腺组织，并称重；

b、按每0.15g消化腺组织置于2.0mL离心管中，加入1.2mL的病毒提取液进行匀浆操作，然后补齐提取液体积，混匀；

c、将混匀后的匀浆液，置于37℃下300r/min转速振荡孵育25min，60℃下孵育5min；

d、孵育后液体12000r/min离心5min，取上清液，在上清液中加入上清液1/2体积的PEG病毒浓缩液，混匀后室温静置5min。

e、静置后溶液12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬。

所述的病毒提取液的配方为：0.2mg/mL蛋白酶K，20mmol/LTris，1mmol/L EDTA，pH8.0，溶剂为无RNase的水。其配制方法是将各成分混合均匀制得。

所述的PEG病毒浓缩液的配方为：PEG600036％g/ml、NaCl 0.9mol/L，溶剂为水。其配制方法是将各成分混合均匀制得。

所述的病毒复溶液为DEPC处理的PH 7.4PBS。

重悬后的溶液即可用于核酸抽提及病毒检测.

本发明的第二个目的是提供一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理试剂盒，包括病毒提取液、病毒浓缩液和病毒复溶液和无核酸酶离心管；

所述的病毒提取液的配方为：0.2mg/mL蛋白酶K，20mmol/LTris，1mmol/L EDTA，pH8.0，溶剂为无RNase的水。其配制方法是将各成分混合均匀制得。

所述的PEG病毒浓缩液的配方为：PEG600036％g/ml、NaCl 0.9mol/L，溶剂为水。其配制方法是将各成分混合均匀制得。

所述的病毒复溶液为DEPC处理的PH 7.4PBS。

所述的无核酸酶离心管是2ml的无核酸酶离心管。

本发明巧妙的优化了牡蛎中病毒提取体系，并且偶联了病毒富集纯化工艺，不但能够针对单个牡蛎样本进行前处理操作，而且充分地提取出了牡蛎中的病毒颗粒，从而显著性提高了病毒回收率。该发明方法操作简单、成本低廉，反应快速，无需特殊的仪器、耗材或试剂，无环境污染，并且在1.5h内即可处理多达24份牡蛎样本，是食品安全常规检测或贝源病毒暴发溯源的重要快速检测工具。

附图说明

图1：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法流程图；

图2：不同牡蛎中提取诺如病毒的样本前处理方法A-E的流程示意图；

图3：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法的体系优化与性能评价，A.病毒回收率，B.PCR扩增效率。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。这些实施方式是为了能够更好地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员，但并不应被这里阐述的实施方式所限制。

以下实施例所用的病毒提取液的配方为：0.2mg/mL蛋白酶K，20mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，pH8.0，溶剂为无RNase的水，其配制方法是将各成分混合均匀制得。

PEG病毒浓缩液的配方为：PEG600036％g/ml、NaCl 0.9mol/L，溶剂为水，其配制方法是将各成分混合均匀制得。

病毒复溶液为DEPC处理的PH 7.4PBS。

实施例1：从牡蛎中高效提取诺如病毒前处理方法的设计

如图1所示，本发明的前处理方法包括以下步骤：

a(30min)、采集待检测病毒污染的牡蛎样本，以单个牡蛎为检测对象，冲洗外壳后，解剖取其消化腺组织，并称重；

b(10min)、按每0.15g消化腺组织置于2.0mL离心管中，加入1.2mL的病毒提取液进行匀浆操作，然后补齐提取液体积，混匀；

c(30min)、将混匀后的匀浆液，置于37℃下300r/min转速振荡孵育25min，60℃下孵育5min；

d(10min)、孵育后液体12000r/min离心5min，取上清液，在上清液中加入上清液1/2体积的PEG病毒浓缩液，混匀后室温静置5min。

e(10min)、静置后溶液12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬，沉淀复溶后用于核酸提取及病毒核酸检测。

本方法可于1.5h内处理完24份牡蛎样本的病毒提取工作。

实施例2：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法的体系优化与性能评价

(1)市售牡蛎的收集及净化

收集市售的新鲜牡蛎，在实验室经无菌人工海水培养24h后，取其中3只以上牡蛎进行人源诺如病毒污染检测。结果为病毒污染阴性后，同批次剩余牡蛎进行后续实验。

(2)市售牡蛎的诺如病毒人工污染

市售牡蛎的诺如病毒人工污染方法，主要参考国标GB 4789.42-2016中相关介绍。具体而言，取诺如病毒污染阴性的牡蛎样本10-15份，冲洗外壳后解剖取其消化腺组织，通过匀浆仪充分匀浆，并分别称取1.5g和0.15g的匀浆牡蛎消化腺组织分装于2.0mL离心管中后，然后再加入合适量的GII型人源诺如病毒临床样本上清液，混匀后作为人工污染牡蛎样本待用。

(3)病毒前处理方法优化

方法A-E的实验方案流程见图2，具体而言：

方法A：按照国标GB 4789.42-2016进行。具体而言，取出分装好的牡蛎组织1.5g于50mL离心管，加入2μL共7.92×10⁶基因组拷贝数(genome copies,GC)的诺如病毒阳性样本(GII型人源诺如病毒临床样本上清液)后，再加入3mL的病毒提取液并充分混匀后；然后于37℃下按照300r/min转速振荡孵育60min并于60℃下处理15min；接下来，于3000r/min下离心5min后，取上清液至新的离心管中，即为前处理后样本。

方法B：按照国标GB 4789.42-2016方法进行体系缩减，具体而言，取出分装好的牡蛎组织0.15g于2mL离心管，加入2μL共7.92×10⁶GC的诺如病毒阳性样本(GII型人源诺如病毒临床样本上清液)后，再加入0.3mL的病毒提取液并充分混匀后；然后于37℃下按照300r/min转速振荡孵育25min并于60℃下处理5min；接下来，于12000r/min下离心5min后，取上清液至新的2mL离心管中，即为前处理后样本。

方法C：在方法B的基础上，最终上清液中加入1/2体积的PEG病毒浓缩液后，于室温条件下，静置5min；接下来，于12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬，获得前处理后样本，可用于核酸抽提及病毒检测。

方法D：基于方法B，将提取液提及由0.3mL提升至1.2mL，其余条件不变。

方法E：在方法D的基础上，最终上清液中加入1/2体积的PEG病毒浓缩液后，于室温条件下，静置5min；接下来，于12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬，获得前处理后样本，用于核酸抽提及病毒检测。

(4)病毒RNA核酸抽提与诺如病毒荧光定量Real-time RT-PCR检测

取前处理后得到的样本溶液140μl(前处理后样本)，通过RNA提取试剂盒抽提样本RNA，共获得目的RNA共50μl。

诺如病毒荧光定量Real-time RT-PCR检测采用20μl一步法反应体系，含有2×one-step RT-PCR Buffer III 10μl，Ex Taq HS 0.4μl，Prime Script RT Enzyme Mix II0.4μl，10μmol/L上游引物(5'ATG TTC AGR TGGATG AGR TTC TCW GA 3')和下游引物(5'TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 3')各0.4μl，10μmol/L探针(5'FAM-AGC ACG TGG GAG GGGATC G-TAMRA 3')0.8μl，RNA模板2μl，ddH₂O 5.6μl。PCR反应条件为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，变性95℃5s，退火-延伸60℃20s，45个循环。

诺如病毒荧光定量Real-time RT-PCR的质控品cRNA及标准曲线均按照国标GB4789.42-2016制备。

(5)回收率与RT-PCR扩增效率计算

通过荧光定量Real-time RT-PCR的标准曲线，计算并比较添加病毒的拷贝数与回收病毒的拷贝数，从而评价方法的提取效果。RT-PCR扩增效率的计算，通过以下方式进行：将已知浓度的质控品cRNA加入到新提取的样本RNA中，进行荧光定量Real-time RT-PCR定量；通过标准曲线，计算并比较纯质控品cRNA与混有样本RNA的质控品cRNA的拷贝数差异，从而评价RT-PCR扩增效率。

结果如图3所示，本发明方法E的回收率能够达到9.81％±0.08％，显著性高于国标方法A以及其他三种方法B-D。同时，本发明方法E的PCR扩增效率也达到了103.65％±0.39％，高于国标方法A以及其他三种方法B-D。

实施例3：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法的灵敏度评价

(1)按照实施例2的方法制备人工污染牡蛎样本(即取出分装好的牡蛎组织0.15g于2mL离心管，加入适当量的诺如病毒阳性样本)。其中诺如病毒阳性样本进行10×梯度的系列稀释处理后，再添加至牡蛎样本中。

(2)按照本发明方法E进行牡蛎中病毒提取与富集，取前处理后得到的样本溶液140μl，通过RNA提取试剂盒抽提样本RNA，共获得目的RNA共50μl。

(3)通过荧光定量Real-time RT-PCR进行检测定量(参照实施例2)，并计算不同病毒添加量下的牡蛎样本中病毒回收率。

结果如表1所示，在病毒添加量为7.19×10²拷贝数至8.73×10⁷拷贝数下，牡蛎样本中病毒回收率稳定，达到了5.57％-9.09％。

表1：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法的灵敏度评价。

实施例4：新方法在实际检测中的应用评价

(1)从广州黄沙水产市场采样市售的牡蛎样本38份，按照实施例2的方法E进行样本前处理。

(2)取前处理后得到的样本溶液140μl，通过RNA提取试剂盒抽提样本RNA，共获得目的RNA共50μl。

(3)通过荧光定量Real-time RT-PCR进行检测定量。在此过程中，采用鼠源诺如病毒作为质控病毒，计算不同牡蛎样本的病毒回收率；采用cRNA质控品，计算不同牡蛎样本的RT-PCR效率。

结果如表2所示，38份牡蛎样本中共检出11份GII型诺如病毒污染阳性样本，污染的病毒浓度范围拷贝值如表2所示。

表2：从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本前处理方法在实际检测中的应用评价。

Claims (6)

1.一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、采集待检测病毒污染的牡蛎样本，以单个牡蛎为检测对象，冲洗外壳后，解剖取其消化腺组织，并称重；

b、按每0.15g消化腺组织置于2.0mL离心管中，加入1.2mL的病毒提取液进行匀浆操作，然后补齐提取液体积，混匀；

c、将混匀后的匀浆液，置于37℃下300r/min转速振荡孵育25min，60℃下孵育5min；

d、孵育后液体12000r/min离心5min，取上清液，在上清液中加入上清液1/2体积的PEG病毒浓缩液，混匀后室温静置5min；

e、静置后溶液12000r/min下离心10min，弃上清后，沉淀用140μl病毒复溶液重悬。

2.根据权利要求1所述的从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法，其特征在于，所述的病毒提取液的配方为：0.2mg/mL蛋白酶K，20mmol/LTris，1mmol/L EDTA，pH8.0，溶剂为无RNase的水。

3.根据权利要求1所述的从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法，其特征在于，所述的PEG病毒浓缩液的配方为：PEG600036％g/ml、NaCl 0.9mol/L，溶剂为水。

4.根据权利要求1所述的从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法，其特征在于，所述的病毒复溶液为DEPC处理的PH 7.4PBS。

5.一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理试剂盒，其特征在于，包括病毒提取液、PEG病毒浓缩液、病毒复溶液和无核酸酶离心管；

所述的病毒提取液的配方为：0.2mg/mL蛋白酶K，20mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH8.0，溶剂为无RNase的水；

所述的PEG病毒浓缩液的配方为：PEG600036％g/ml、NaCl 0.9mol/L，溶剂为水；

所述的病毒复溶液为DEPC处理的PH 7.4PBS。

6.根据权利要求5所述的从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理试剂盒，其特征在于，所述的无核酸酶离心管是2ml的无核酸酶离心管。

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