CN111004719B - 核酸检测模块、检测单元及检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸检测模块、检测单元及检测系统。核酸检测模块包括预处理组件和微流控检测组件；预处理组件包括核酸提取元件和主体模块，主体模块包括与核酸提取元件配合的洗涤腔和反应腔，洗涤腔用于容置洗涤试剂，洗涤试剂用于纯化所述核酸，反应腔用于容置能够将核酸扩增形成扩增子的核酸扩增反应体系；微流控检测组件包括微流体通道，微流体通道与反应腔连接，微流体通道用于容置包含扩增子、辅助检测试剂的检测反应体系，检测反应体系能够产生可检测信号。本发明将预处理组件和微流控组件相结合，采用iRPAS信号放大方法对提取的核酸进行扩增，并用智能手机对扩增过程进行加热，实现了样品采集、核酸释放、纯化、放大和检测全集成一体化。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种核酸检测模块、检测单元及检测系统，属于微流控检测技术领域。
背景技术
核酸检测在生命科学中具有重要意义，广泛应用于临床诊断，农业监测，食品安全和植物病原体感染检测。此外，随着对人类健康基因组信息的深入理解，基因替换，插入和缺失等多种类型的核苷酸突变已证明与疾病密切相关，如遗传性疾病，代谢疾病和癌症等，甚至单核苷酸多态性(SNP)对于个体疾病易感性也有重要的相关性。因此迫切需要一种具有高灵敏度和单碱基特异性的核酸检测方法。传统的核酸检测方法例如DNA微阵列，DNA测序，多重连接依赖性探针扩增，反向斑点印迹，高分辨率熔解和一些基于传感器的方法等，依赖昂贵的设备和现代化的实验室环境，阻碍其在非实验室环境现场即时核酸检测中的应用。
即时检测是近几年来发展迅速的一种检测手段和趋势，即在现场快速完标本采集，预处理，检测反应和结果读取判别的技术方法。具有快速、简便、高度集成，不依赖大型仪器设备和专业工作人员等特点。即时检测给欠发达地区，资源有限的基层单位公共卫生监控，家庭保健，疾病预防，食品、水资源、环境等现场快速检测提供了可能。即时检测近年来在核酸检测中进行了许多创新检测方法，特别是在等温核酸扩增中，开发了例如环介导等温扩增方法、滚环扩增方法、重组酶聚合酶扩增方法等，未来有望在核酸即时检测中得到广泛应用。
3D打印微流控技术利用3D打印技术直接打印微流控芯片或制备微流控芯片模具的一门新兴技术，进一步推动和延伸了微流控的应用范围。微流控(Microfluidics)是上世纪九十年代出现的技术，指在微米尺度上操作和控制流体，具有体积小，比表面积大，试剂用量少，通量高，反应速度快等特点，在即时检测领域拥有广阔前景。但是微流控芯片制备依赖于半导体工艺，加工工艺繁多，需要在超净间内完成，限制了其应用范围。近年来，随着3D打印技术的发展，利用3D打印技术制作微流控芯片也成为可能，3D打印微流控芯片具有制作简单，加工成本较低等优势，在生物医学检测领域发展迅速。
例如，在CN107904161A中描述了一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片。该芯片设计了依次连通的样本处理区、DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区，利用磁珠法进行核酸提取，利用环介导等温扩增的方法进行核酸扩增。其提供了一种集样本处理、病原体核酸提取、扩增及可视化检测于一体的微流控芯片。但是该芯片操作仍然需要样品进行生理盐水稀释，离心操作，需要利用磁珠、移液器进行辅助操作，更为关键的是反应仍然需要恒温60～68℃热台来进行加热，并不能完全实现现场即时检测。以及，其采用传统光刻微流控芯片制作工艺，整个流道为微米级，无法通过手工进行液体注入，使得其操作简便性大大下降，样品的前处理需要生理盐水稀释和离心机离心才能浓缩样品，采用磁珠法需要磁柱加以辅助，并且试剂加样需要用到移液器，整个操作过程受限于微流控芯片的劣势：手工操作简便性不佳。
在CN103308502B中提供了一种掌上型通用微流控芯片即时检测装置及应用，其主要采用荧光环介导等温扩增的方法对核酸进行放大检测，装置集成了移动电源加热系统和荧光检测系统，克服了传统核酸检测反应需要外部供电和外接大型计算机的缺点，极大的扩展了装置的可适用范围，配合智能移动设备上运行的应用程序(APP)，易于操作，可在核酸扩增反应中的应用；然而该方案中并没有样品前处理系统，检测样品是已经富集纯化后的样品，需要核酸富集纯化系统的辅助，无法完全实现现场即时检测；以及，该核酸即时检测装置采用掌上型微流控芯片，采用荧光环介导等温扩增的方法对核酸进行放大检测，装置集成了移动电源加热系统和荧光检测系统；但其并没有样品前处理系统，检测样品是浓缩纯化后的样品，无法真正实现现场即时检测，并且该方法特异性无法达到单个碱基差异水平。
在US9469871B2中公开了一种用于即时核酸扩增和检测的方法和装置，其实施方案包括完全整合的从样品到结果的分子诊断仪器，该仪器优选利用环介导等温扩增方法，以降低核酸扩增相关的仪器要求，并且通过在扩增反应中添加染料从而通过色移或荧光来实现靶扩增的检测。然而该方法仍然需要外部加热设备提供反应所需的供热(60-65℃)，并且检测特异性并没有实现单个碱基的差异。整个检测装置为宏观毫米级尺度，无法实现微流控芯片；并且其主要基于注射器和配套器件在宏观尺度上对核酸进行纯化和检测，同样采用环介导等温扩增方法，反应需要在60-65℃下进行，需要额外的加热装置进行辅助，并且该方法特异性无法达到单个碱基差异水平。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种核酸检测模块、检测单元及检测系统，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种核酸检测模块，其包括预处理组件(110)和微流控检测组件(120)；
其中，所述预处理组件(110)包括：
核酸提取元件，其至少用于提取样品中的核酸；
主体模块(1103)，其包括与所述核酸提取元件配合的洗涤腔(11031)和反应腔(11032)，所述洗涤腔(11031)用于容置洗涤试剂，所述洗涤试剂用于纯化所述核酸，所述反应腔(11032)用于容置能够将所述核酸扩增形成扩增子的核酸扩增反应体系；
所述微流控检测组件(120)包括微流体通道，所述微流体通道与反应腔(11032)连接，所述微流体通道用于容置包含所述扩增子、辅助检测试剂的检测反应体系，所述检测反应体系能够产生可检测信号。
进一步的，所述核酸提取元件包括过滤篮(1101)，所述过滤篮(1101)具有顶部端口(11012)和底部端口(11013)，且所述过滤篮(1101)内设置有DNA抽提试纸(11011)，所述顶部端口(11012)用于向过滤篮(1101)内注入所述洗涤试剂，所述底部端口(11013)用于使样品进入过滤篮(1101)内并与DNA抽提试纸(11011)接触。
进一步的，在所述过滤篮(1101)被局部插入洗涤腔(11031)时，由洗涤试剂供给管供应的洗涤试剂能够通过过滤篮(1101)内腔进入洗涤腔(11031)。
优选的，所述洗涤试剂供给管中具有用以将不同洗涤试剂彼此分隔的气隙。
优选的，所述洗涤腔(11031)底部设置由排液孔(110311)。
进一步的，在所述过滤篮(1101)被局部插入反应腔(11032)时，吸附在DNA抽提试纸(11011)上的所述核酸能够在反应腔(11032)内与核酸扩增反应所需的其余组件配合形成核酸扩增反应体系，进而形成扩增子。
进一步的，所述过滤篮(1101)具有与阀(1102)配合的连接部(11014)，所述反应腔(11032)具有与微流控检测组件连通的连接管(110321)，在所述过滤篮(1101)通过阀(1102)与反应腔(11032)连接，且所述阀(1102)处于打开状态时，所述过滤篮(1101)内腔通过所述阀(1102)上的出液孔与管道(110321)连通。
进一步的，所述阀(1102)具有插入孔(11024)和出液孔(11023)，在所述过滤篮(1101)被局部插入所述插入孔(11024)时，所述过滤篮(1101)内腔与所述出液孔(11023)连通。
进一步的，所述阀(1102)还具有用于安装密封环的凹槽(11021)。
进一步的，所述阀(1102)还具有旋转定位标志(11022)，所述反应腔(11032)还具有与阀(1102)的旋转定位标志(11022)配合的定位槽(110322)
进一步的，一主体模块上设置有至少一连接凸起(11033)和/或至少一连接凹槽(11034)，所述至少一连接凸起(11033)、至少一连接凹槽(11034)分别与另一主体模块上的相应至少一连接凸起(11033)、相应至少一连接凹槽(11034)匹配。
进一步的，所述辅助检测试剂包括具有链霉亲和素修饰的纳米金缓冲液，所述核酸扩增反应体系包括带尾正向引物和生物素化的反向引物。
进一步的，所述辅助检测试剂还包括银盐和引发剂的混合溶液。
在一些较为具体的实施方案中，所述微流控检测组件(120)还包括临时探针通道，所述微流体通道与临时探针通道连通，所述临时探针通道至少用于提供探针，所述探针与扩增子尾部碱基互补，所述扩增子尾部碱基来源于所述带尾正向引物。
进一步的，所述微流体通道、临时探针通道分别分布在微流控检测组件(120)的微流体通道层(1201)、临时探针通道层(1202)内。
进一步的，所述预处理组件(110)包括3D打印组件。
进一步的，所述检测反应体系包括iRAS放大检测反应体系。
进一步的，所述可检测信号包括可视化检测信号。
本发明实施例还提供了一种核酸检测单元，其包括：
所述的核酸检测模块，以及，与所述核酸检测模块配合的智能终端，所述智能终端至少用于对所述核酸检测模块输出的可检测信号进行处理。
进一步的，所述智能终端还用于为在所述核酸检测单元内进行的核酸扩增反应系统、检测反应体系提供促成反应所需的热量。
进一步的，所述智能终端内置有加热模块。
进一步的，所述智能终端包括手机。
在一些较为具体的实施方案中，所述的核酸检测单元还包括与所述核酸检测模块配合的保温容器，所述保温容器具有温度显示条和温度质量控制盘。
本发明实施例还提供了一种核酸检测系统，其包括：
所述的核酸检测模块或所述的核酸检测单元；以及
智能终端适配模块，其包括可折叠支架，所述可折叠支架具有插入口(2301)和检测信号摄取口(2302)，当将所述核酸检测模块自插入口(2301)插入可折叠支架，且将智能终端的信号摄取机构设置在所述检测信号摄取口(2302)处时，所述智能终端能够采集所述核酸检测模块内的可检测信号。
进一步的，所述可折叠支架为可折叠纸质支架(230)。
进一步的，所述信号摄取机构包括摄像头，且所述检测信号摄取口(2302)处还设置有与所述摄像头配合的光学放大镜(210)。
进一步的，所述信号摄取机构包括摄像头，且与所述检测信号摄取口(2302)相应位置处还设有光源。
与现有技术相比，本发明提供的核酸即时检测检测系统，将预处理组件和微流控组件相结合，采用iRPAS信号放大方法对提取的核酸进行扩增，并用智能手机对扩增过程进行加热，实现了样品采集、核酸释放、纯化、放大和检测全集成一体化。
附图说明
图1a是本发明一典型实施案例中一种核酸检测模块的结构示意图；
图1b是本发明一典型实施案例中一种核酸检测模块的俯视图；
图1c是本发明一典型实施案例中一种过滤篮的结构示意图；
图1d是本发明一典型实施案例中一种旋转阀的结构示意图；
图2a是本发明一典型实施案例中一种可折叠纸质支架的折叠后的结构示意图
图2b是发明一典型实施案例中一种可折叠纸质支架的拆解后的结构示意图；
图2c是本发明一典型实施案例中可折叠支架的折叠流程示意图，其中虚线为折叠线；
图3a是采用本发明提供的核酸即时检测系统对α地中海贫血SEA型(长片段缺失)进行检测的检测结果；
图3b是采用本发明提供的核酸即时检测系统对β地中海贫血CD41型(短片段缺失)进行检测的检测结果；
图3c是采用本发明提供的核酸即时检测系统对β地中海贫血CD17型(单碱基替换)进行检测的检测结果；
图3d是采用本发明提供的核酸即时检测系统对β地中海贫血CD71型(单碱基插入)进行检测的检测结果；
图4a是采用本发明提供的核酸即时检测系统对尿液样品中大肠杆菌(E.coli)进行检测的检测结果；
图4b是采用本发明提供的核酸即时检测系统对尿液样品中肺炎克雷伯菌(K.pn)进行检测的检测结果；
图4c是采用本发明提供的核酸即时检测系统对牛奶样品中大肠杆菌(E.coli)进行检测的检测结果；
图4d是采用本发明提供的核酸即时检测系统对河水样品中大肠杆菌(E.coli)进行检测的检测结果；
图4e是采用本发明提供的核酸即时检测系统对猕猴桃树叶样品中猕猴桃溃疡病菌(P.sa进行检测的检测结果；
图5是在不同环境温度条件下，采用本发明实施例提供的核酸检测系统检测核酸获得的检测信号强度；
图6是本发明一典型实施例中目标DNA浓度与检测信号强度相关性曲线；
图7是不同环境气温条件下，采用智能手机加热核酸检测模块的温度效果图；
图8是本发明一典型实施案例中一种保温袋的结构示意图；
图9是本发明一典型实施案例中运行智能手机中加热应用或程序时的手机操控界面；
图10是本发明一典型实施案例中控制运行算法的数量来调节智能手机的热量的控制流程结构图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
请参阅图1a-图1d，本发明一典型实施案例中的一种核酸即时检测系统主要由检测芯片(即前述核酸检测模块，下同)和定制的智能移动设备200组成，最终用户可以将其放在口袋中并快速组装设备以在资源有限的情况下使用。
请参阅图1a-图1d，检测芯片主要包括预处理组件110和微流控检测组件120；预处理组件110由3D打印而成，其包含了用于样品吸收和DNA纯化的过滤篮1101、用于控制微流体通道打开和关闭的旋转阀(即前述阀，下同)1102以及用于构建腔室和连接检测组件的主体模块1103。
过滤篮1101具有顶部端口11012和底部端口11013，内部设置有DNA抽提试纸11011，旋转阀1102外侧表面设置有密封环放置凹槽11021，底部设置有旋转定位标志11022以及侧壁出液孔11023。
主体模块1103具有洗涤腔11031和反应腔11032，洗涤腔底部有排液孔110311，反应腔侧部经连接管(110321与微流控检测组件连接，底部设置有用于旋转阀定位的定位槽110322，此外，一主体模块上设置有至少一连接凸起11033和/或至少一连接凹槽11034，所述至少一连接凸起11033、至少一连接凹槽11031分别与另一主体模块上的相应至少一连接凸起、相应至少一连接凹槽匹配。
其次，微流控检测组件120包括由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流控通道层1201和醛基官能化修饰的玻璃基底，微流控通道分布在微流控通道层1201中，在醛基官能化修饰的玻璃基底的探针区域表面挂载有能够与扩增子局部序列互补结合的DNA或RNA探针。
具体的，临时探针通道层1202和醛基官能化修饰的玻璃基底通过醛胺缩合反应结合，注入检测探针，探针在醛基官能化修饰的玻璃基底表面包被后临时探针通道层1202被剥离，微流体通道层1201和醛基官能化修饰的玻璃基底再通过醛胺缩合反应结合，组成最终的微流控检测组件120。
具体的，该临时探针通道是用于在微流体通道的不同区域固定上不同的探针；本发明实施例中可以提前在微流体通道的不同区域固定不同的核酸探针；例如，可以通过打印、印刷等方式将探针固定在微流体通道道的特定位置，或者，还可以将临时探针通道在在微流体通道的不同区域以固定不同的核酸探针。
具体的，本实施例中的旋转阀1102是一种侧壁带一出液孔的套管，过滤篮1101插到旋转阀(套管)1102，再一起插入反应腔11032；由于旋转阀1102侧壁出液孔与反应腔11032侧壁的孔是错开的，因此反应液会留存在反应腔11032内，但是旋转阀1102不是必需的，也可以直接将过滤篮1101插入到带反应液的反应腔11032中，此时，虽然反应腔11032侧壁设置有连接孔及外部连接管110321与微流控管道相连，但是液体不容易流入微流控管道，这是由于微流控管道的管径很小，液体进入微流控管道需要一定压力作为推力；旋转阀1102的使用只是为了更好的杜绝反应期间反应液提前漏入微流控管道。
具体的，连接管110321通过反应腔侧壁上的一连接孔与反应腔相通，当出液孔11023与连接孔错位时，过滤篮1101内溶液与连接管110321不通，反应腔11032内溶液不会外流，在反应腔11032内反应；当反应完毕后，旋转整个旋转阀1102，使出液孔11023与连接孔相对，此时反应腔11032与连接管110321连通，从阀11012推入空气，就可将含扩增子的反应液从反应腔注入到微流控管道中，进行杂交显色反应。因此，连接管110321不是必须，理论上，只要反应腔侧壁上的连接孔与微流控芯片上的进液口紧密贴合就不需要连接管110321。
具体的，请参阅图2a、图2b、图2c，智能移动设备包括智能手机(即前述智能终端)和智能手机适配器，智能手机适配器主要由光学放大镜210、LED220和可折叠纸质支架230组成，光学放大镜210的上部与智能手机后置摄像头连接，在光学放大镜210附近使用0.3W白光LED220作为光源模块；光源模块可以由两个纽扣电池供电，并由开/关控制开关操作，可折叠纸质支架230可以由黑色纸板组装而成。
具体的，可折叠纸质支架230具有插入口2301和检测信号摄取口2302，当将所述核酸检测模块自插入口2301插入可折叠支架，且将智能终端的信号摄取机构设置在所述检测信号摄取口2302处时，所述智能终端能够采集所述核酸检测模块内的可检测信号，其中光学放大镜210设置在检测信号摄取口2302处。
本发明实施例提供的该核酸即时检测系统可应用于多种核酸检测方法内，包括但不限于等温重组酶聚合酶-金-银(iRPAS)三重信号放大方法等，其中iRPAS法可以实现指数和可视化信号放大。
在一个更为具体的实施案例中，使用所述的核酸即时检测装置进行核酸检测的方法主要包括三个主要程序：(i)样品预处理、(ii)信号放大、(iii)信号读出以实现样从样品到结果的核酸检测。
具体的，本发明采用等温重组酶聚合酶-金-银(iRPAS)三重信号放大方法对采集的DNA进行扩增处理，其中，首先采用带尾正向引物和生物素化的反向引物通过重组酶聚合酶扩增抽提试纸11011上的核酸，在37℃下进行20分钟实现第一次信号放大；之后，转动旋转阀1102打开聚四氟乙烯连接管110321，将连接管110321内的链霉亲和素修饰的纳米金缓冲液与扩增子混合注入检测组件120中，并通过醛基官能化修饰的玻璃基底中预先包被的探针与扩增子尾部之间的碱基互补反应(本发明实施例中的探针与扩增子的结合点位于尾部，扩增子与探针特异性的结合点还可以在位于中间等其他区域)，从而将扩增子捕获，在微流体通道1201中使链霉亲和素修饰的纳米金与扩增子上面的生物素结合，实现第二次信号放大，受益于微流体通道的高表面积与体积比，信号在很短的反应时间内被充分获得；并且，在蒸馏水洗涤后，为了进一步扩增并获得可视化信号，通过将银盐和引发剂溶液的混合物装入微流体通道1201中反应，纳米金溶液可以高度特异性地使银的沉积成核，此外，沉积在纳米金上的银将级联催化效应以沉积更多的银，从而实现第三次信号放大；最后，在iRPAS三重信号放大后，信号可以通过肉眼观察或通过智能手机半定量化，在信号读出步骤中，将微流控检测组件120插入智能手机底座的底部入口2301，微流控检测组件120上的信号被相机捕获，信号结果将被读出并通过定制应用程序上传到云数据库。
具体的，在进行样品处理时，为了吸收和富集样品中的核酸，采用底部内置有DNA抽提试纸11011的过滤篮1101浸渍数微升唾液或血液或尿液或植物汁液或污水等自然样品，细胞将在试纸表面被裂解和灭活，核酸将通过静电吸附稳定在DNA抽提试纸11011上，待干燥后，将过滤篮1101插入洗涤腔11031中，由于的试剂消耗量较低，本发明实施例将试剂储存在聚四氟乙烯管中，并使用胶带密封端口，以便于使用，更重要的是，不同的试剂可以通过一个管中的气隙分开，这可以在一个管中添加多种试剂。
具体的，本发明实施例将纯化试剂、TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA)和蒸馏水依次通过过滤篮1101的顶部端口11012注入洗涤腔11031；纯化后，将过滤篮1101插入反应腔11032以开始信号放大步骤。
进一步的，本发明实施例中的过滤篮1101的底部端口包括能够与外界连通的孔或缝隙等，该底部端口一方面用于使样品与DNA抽提试剂、DNA扩增试剂等相接触，另一方面，当过滤篮1101放入洗涤腔清洗再取出时，要使进入过滤篮1101的清洗试剂流出，此时扩增子(即扩增的DNA)被吸附在DNA抽提试纸上。
具体的，为实现37℃条件下的等温放大以及微流控检测组件120快速传热，本发明通过智能手机进行加热，进而为整个iRPAS放大过程提供预设的温度条件，为了在37℃实现iRPAS放大的稳定加热，本发明提供了一个加热应用(提取手机温度的应用程序有多种，例如鲁大师APP等，该技术为本领域技术人员已知的现有技术，在此不再赘述)来读取智能手机内部温度传感器的数据，并通过控制运行算法的数量来调节智能手机的热量，该应用程序集成了温度和时间控制功能，加热的开始和停止时间可以由应用程序设置。
本发明实施例利用智能手机等移动设备本身产生的热量，通过在智能手机上安装预设的程序，而使智能手机表面温度或者临近智能手机的温度维持或变化，检测芯片放置在智能手机表面与智能手机接触或者将智能手机和检测芯片一起放置在一保温容器中，进而实现以智能手机产生的热量维持检测芯片中iRPAS放大过程的进行；其中，运行该加热应用或程序时的手机操控界面如图9所示，控制运行算法的数量来调节智能手机的热量的控制流程结构如图10所示，其中用以实现调节智能手机的热量以及利用该热量对反应进行加热的算法以及程序代码等均可以采用现有技术实现。
为了模拟现场测试温度条件的影响，本发明测试了检测平台(即所述核酸即时检测系统)在4℃，25℃和37℃下的性能；本发明通过调节运行算法的数量，将温度在20min达到工作温度，精度达到0.1℃，在4℃条件下的结果表明在25℃和37℃条件下具有可比较的检测性能。本发明提供的核酸即时检测系统，可以在不同温度环境下使用，并时整个iRPAS放大过程的温度保持在37-42℃的测试温度，以保证核酸反应检测。
如图8所示，本发明提供了一个保温容器，例如铝箔制成的绝缘袋，以减少寒冷环境下的热量损失(4℃测试)，保温容器由温度显示条(30-40℃，2℃间隔)和温度质量控制盘(37℃，42℃)组成，显示内部的实时温度，记录温度是否达到工作线和危险线。
具体的，通过对质粒DNA从1011拷贝到10拷贝范围内进行测试，本发明的检测下限为113拷贝每毫升。
例如，一种使用所述的核酸即时检测系统进行核酸检测的方法包括：
1)将底部内置有DNA抽提试纸11011的过滤篮1101浸渍样品，待干燥后，将过滤篮1101插入洗涤腔11031中；然后将聚四氟乙烯管中内置的200微升核酸纯化液(购自美国GE公司FTA纯化试剂)通过过滤篮1101的顶部端口11012注入洗涤腔11031，保持5分钟，再将聚四氟乙烯管中内置的200微升TE缓冲液(含10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA,pH 8.0)注入洗涤腔11031中，保持5分钟，再注入200微升蒸馏水清洗，以完成DNA的提取和纯化；
2)将提取有DNA的过滤篮1101插入反应腔11032内开始信号放大步骤；具体的：
2.1)向反应腔11032中加入RPA反应试剂(购自英国TwistDx公司)，包括25μLTwistDx 2×反应缓冲液、5μL 10×基本E混合液、3.6μL 25mM dNTP、6.6μL水、2.5μL核心混合液，然后加入4.8μL10 uM生物素修饰的DNA扩增引物,2.5μL 280mM乙酸镁溶液，在37℃保温20分钟，实现第一次信号放大；
2.2)反应完成后，再向反应腔11032加入50μL杂交缓冲液，含有5×Denhardt's溶液,3×柠檬酸钠溶液,0.1％牛血清白蛋白及1％亲和素修饰的纳米金颗粒，转动旋转阀1102，使反应腔11032与连接管110321相连通，通过向反应腔11032注入空气，将反应腔内液体推入微流控检测组件120中，在微流体通道中于37℃保存15min，实现第二次信号放大；
2.3)将蒸馏水注入微流控检测组件120冲洗通道，再将10μL银染溶液和10μL银染显色液(均购自美国sigma公司)下注入微流体通道中，在37℃保持7分钟，实现第三次信号放大。
3)采用智能手机对信号放大后的DNA进行观测分析。
进一步的，采用本发明一典型实施例提供的核酸即时检测系统及方法对α地中海贫血SEA型(长片段缺失)、β地中海贫血CD41型(短片段缺失)、β地中海贫血CD17型(单碱基替换)、β地中海贫血CD71型(单碱基插入)、乙醛脱氢酶基因ALDH2单核苷酸多态性(SNP)野生型、乙醛脱氢酶基因ALDH2单核苷酸多态性(SNP)突变杂合型、乙醛脱氢酶基因ALDH2单核苷酸多态性(SNP)纯合突变型进行检测，其检测结果分别如图3a-图3d所示。
采用本发明提供的核酸即时检测装置及方法对尿液样品中大肠杆菌(E.coli)、尿液样品中肺炎克雷伯菌(K.pn)、牛奶样品中大肠杆菌(E.coli)、河水样品中大肠杆菌(E.coli)、猕猴桃树叶样品中猕猴桃溃疡病菌(P.sa)进行检测，检测结果分别如图4a-图4e所示。
在不同环境温度条件下，采用本发明实施例提供的核酸检测系统检测核酸获得的检测信号强度如图5所示，其中目标DNA浓度与检测信号强度相关性曲线如图6所示；在不同环境气温条件下，采用智能手机加热核酸检测模块的温度效果如图7所示。
本发明提供的核酸即时检测系统，将预处理组件和微流控组件相结合，采用iRPAS信号放大方法对提取的核酸进行扩增，并用智能手机对扩增过程进行加热，实现了样品采集、核酸释放、纯化、放大和检测全集成一体化。
与CN107904161A中提供的技术方案相比，本发明无需对样品进行生理盐水稀释和离心机离心，不需要采用磁珠法需要磁柱加以辅助，并且试剂加样不需要用到移液器，不需要额外的恒温热板提供热量。
与CN103308502B中提供的技术方案相比，本发明提供的装置集成了样品前处理系统，对样品要求低。不需要对样品进行浓缩纯化。
与US9469871B2中提供的技术方案相比，本发明提供的装置能充分发挥微流控芯片的优势，并且无需外部加热装置辅助。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种核酸检测模块，其特征在于包括预处理组件（110）和微流控检测组件（120）；
其中，所述预处理组件（110）包括：
核酸提取元件，其至少用于提取样品中的核酸，所述核酸提取元件包括过滤篮（1101），所述过滤篮（1101）内设置有DNA抽提试纸（11011），所述过滤篮（1101）具有顶部端口（11012）和底部端口（11013），所述顶部端口（11012）用于向过滤篮（1101）内注入洗涤试剂，所述底部端口（11013）用于使样品进入过滤篮（1101）内并与DNA抽提试纸（11011）接触，在所述过滤篮（1101）被局部插入洗涤腔（11031）时，由洗涤试剂供给管供应的洗涤试剂能够通过过滤篮（1101）内腔进入洗涤腔（11031）；
主体模块（1103），其包括与所述核酸提取元件配合的洗涤腔（11031）和反应腔（11032），所述洗涤腔（11031）用于容置洗涤试剂，且所述洗涤腔（11031）底部设置由排液孔（110311），洗涤试剂用于纯化所述核酸，所述反应腔（11032）用于容置能够将所述核酸扩增形成扩增子的核酸扩增反应体系；
所述微流控检测组件（120）包括微流体通道和临时探针通道，所述微流体通道与反应腔（11032）连接，所述微流体通道与临时探针通道连通，所述临时探针通道至少用于提供探针，所述微流体通道用于容置包含所述扩增子、辅助检测试剂的检测反应体系，所述检测反应体系能够产生可检测信号，所述微流体通道、临时探针通道分别分布在微流控检测组件（120）的微流体通道层（1201）、临时探针通道层（1202）内。
2.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述洗涤试剂供给管中具有用以将不同洗涤试剂彼此分隔的气隙。
3.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：在所述过滤篮（1101）被局部插入反应腔（11032）时，吸附在DNA抽提试纸（11011）上的所述核酸能够在反应腔（11032）内与核酸扩增反应所需的其余组件配合形成核酸扩增反应体系，进而形成扩增子。
4.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述过滤篮（1101）具有与阀（1102）配合的连接部（11014），所述反应腔（11032）具有与微流控检测组件连通的连接管（110321），在所述过滤篮（1101）通过阀（1102）与反应腔（11032）连接，且所述阀（1102）处于打开状态时，所述过滤篮（1101）内腔通过所述阀（1102）上的出液孔与管道（110321）连通。
5.根据权利要求4所述的核酸检测模块，其特征在于：所述阀（1102）具有插入孔（11024）和出液孔（11023），在所述过滤篮（1101）被局部插入所述插入孔（11024）时，所述过滤篮（1101）内腔与所述出液孔（11023）连通。
6.根据权利要求4所述的核酸检测模块，其特征在于：所述阀（1102）还具有用于安装密封环的凹槽（11021）。
7.根据权利要求4所述的核酸检测模块，其特征在于：所述阀（1102）还具有旋转定位标志（11022），所述反应腔（11032）还具有与阀（1102）的旋转定位标志（11022）配合的定位槽（110322）。
8.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：一主体模块上设置有至少一连接凸起（11033）和/或至少一连接凹槽（11034），所述至少一连接凸起（11033）、至少一连接凹槽（11034）分别与另一主体模块上的相应至少一连接凸起（11033）、相应至少一连接凹槽（11034）匹配。
9.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述辅助检测试剂包括具有链霉亲和素修饰的纳米金缓冲液，所述核酸扩增反应体系包括带尾正向引物和生物素化的反向引物。
10.根据权利要求9所述的核酸检测模块，其特征在于：所述辅助检测试剂还包括银盐和引发剂的混合溶液。
11.根据权利要求9所述的核酸检测模块，其特征在于：所述探针与扩增子尾部碱基互补，所述扩增子尾部碱基来源于所述带尾正向引物。
12.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述预处理组件（110）包括3D打印组件。
13.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述检测反应体系包括iRAS放大检测反应体系。
14.根据权利要求1所述的核酸检测模块，其特征在于：所述可检测信号包括可视化检测信号。
15.一种核酸检测单元，其特征在于包括：
权利要求1-14中任一项所述的核酸检测模块，以及，与所述核酸检测模块配合的智能终端，所述智能终端至少用于为在所述核酸检测单元内进行的核酸扩增反应系统、检测反应体系提供促成反应所需的热量。
16.根据权利要求15所述的核酸检测单元，其特征在于：所述智能终端还用于对所述核酸检测模块输出的可检测信号进行处理。
17.根据权利要求15所述的核酸检测单元，其特征在于：所述智能终端包括手机。
18.根据权利要求15所述的核酸检测单元，其特征在于还包括与所述核酸检测模块配合的保温容器，所述保温容器具有温度显示条和温度质量控制盘。
19. 一种核酸检测系统，其特征在于包括：
权利要求1-14中任一项所述的核酸检测模块或权利要求15-18中任一项所述的核酸检测单元；以及
智能终端适配模块，其包括可折叠支架，所述可折叠支架具有插入口（2301）和检测信号摄取口（2302），当将所述核酸检测模块自插入口（2301）插入可折叠支架，且将智能终端的信号摄取机构设置在所述检测信号摄取口（2302）处时，所述智能终端能够采集所述核酸检测模块内的可检测信号。
20.根据权利要求19所述的核酸检测系统，其特征在于：所述可折叠支架为可折叠纸质支架（230）。
21.根据权利要求19所述的核酸检测系统，其特征在于：所述信号摄取机构包括摄像头，且所述检测信号摄取口（2302）处还设置有与所述摄像头配合的光学放大镜（210）。
22.根据权利要求19所述的核酸检测系统，其特征在于：所述信号摄取机构包括摄像头，且与所述检测信号摄取口（2302）相应位置处还设有光源。
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