CN110791122A

CN110791122A - 一种苏丹黑b染色试剂盒

Info

Publication number: CN110791122A
Application number: CN201911197909.XA
Authority: CN
Inventors: 赵光波; 蒋小龙
Original assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本发明提供了一种苏丹黑B染色液，每100ml组成如下：苏丹黑B 0.1～0.7g，低级醇20～60ml，TX‑1000.5～1.5ml，余量为水；优选地，所述低级醇选自每分子含有1～3个碳原子的醇中的1种或2种以上任意配比的组合。本发明还提供了包括该苏丹黑B染色液的试剂盒。本发明的苏丹黑B染色液相比传统的苏丹黑B染色液，能有效减少染色时出现的背景杂质，增加了染色清晰度，染色效果优良。

Description

一种苏丹黑B染色试剂盒

技术领域

本发明涉及病理组织细胞染色领域。

背景技术

苏丹黑B是一种脂溶性染料，可将细胞中的脂类物质染成棕黑色，定位于细胞质内。苏丹黑B染色通常应用于组织化学中用于区分石蜡和动物脂肪，髓素染色，白细胞颗粒和高尔基氏器染色，细胞和组织中类脂质的染色。

苏丹黑B染色液的传统配制方法为：将苏丹黑B溶于70％-100％的乙醇溶液中，即可。传统方法配制的染色液，其溶剂易挥发，苏丹黑B容易析出，最终导致染色不均匀、不清晰，以及染料沉淀导致染色背景不干净的问题。

为了解决这个问题，申请号为201110037185.X的专利申请，使用异丙醇和乙二醇混合液或异丙醇和丙三醇混合液作为溶剂，溶解苏丹黑B。但该专利申请只验证了该染色液对电泳分离的血清脂蛋白的效果，并未在微观尺度(显微镜下)检测其背景杂质的问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种微观尺度下染色背景低的苏丹黑B染色液；本发明的另一目的是提供一种依赖该染色液的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种苏丹黑B染液，每100ml组成如下：苏丹黑B 0.1～0.7g，低级醇20～60ml，TX-100 0.5～1.5ml，余量为水；本发明中低级醇指的是每分子含有1～4个碳原子的醇或其任意2种以上的组合；

优选地，所述低级醇选自每分子含有1～3个碳原子的醇中的1种或2种以上任意配比的组合。

如前述的苏丹黑B染液，所述低级醇选自每分子含1～2个碳原子的醇(甲醇、乙醇、乙二醇)中的1种或2种以上任意配比的组合；

优选地，每100ml染液中低级醇用量为30～50ml；最优选地，为50ml。

如前述的苏丹黑B染液，所述低级醇为每分子含3个碳原子的醇(丙醇、异丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、丙三醇)中的1种或2种以上任意配比的组合；

优选地，每100ml染液中低级醇用量为20～50ml；最优选地，为50ml。

如前述的苏丹黑B染液，每100ml染液中苏丹黑B的用量为0.5g。

如前述的苏丹黑B染液，每100ml染液中TX-100用量为1ml。

一种苏丹黑B染色试剂盒，它包括前述的苏丹黑B染液和染色前固定细胞用的固定剂；

优选地，固定剂是甲醛和乙醇按1∶9的体积比混合而成的混合液。

如前述的试剂盒，它还包括瑞姬氏染液。

一种骨髓涂片或血涂片的染色方法，它是使用前述试剂盒对干燥的骨涂图片或血涂片进行染色；

优选地，包括如下步骤：

1)固定：使用固定剂对干燥的骨髓涂片或血涂片固定30～60s，用水冲洗，待干或滤纸吸干；

2)染色：使用前述苏丹黑B染色液于37℃孵育20～30min，用水冲洗，待干或滤纸吸干；

3)镜检。

如前述的染色方法，步骤2)和3)之间还有复染步骤：

使用3倍稀释的瑞姬氏染液复染3～5min，用水冲洗，待干或滤纸吸干；

前述苏丹黑B染液的制备方法，它是先将苏丹黑B溶解于低级醇，再加TX-100，再用水定容；

或，先将苏丹黑B溶解于低级醇，再加水定容，再加入TX-100。

本发明中，“苏丹黑B”是指2，3-二氢-2，2-二甲基-6-[[4-(苯基偶氮)-1-萘]偶氮]萘嵌问二氮杂苯，其英文名称为Sudan Black B，CAS NO：4197-25-5，分子量：456.55，分子式：C₂₉H₂₄N₆。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的苏丹黑B染色液，染色清楚、背景杂质少，不仅方便医生镜检观察，并且减少背景杂质对检测结果的干扰、提高检测准确度。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过筛选例和对比例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：苏丹黑B用量筛选对应染色显微观察图。

图2：乙醇浓度筛选对应染色显微观察图。

图3：TX-100含量筛选对应染色显微观察图。

图4：不同表面活性剂筛选对应染色显微观察图。

图5：其它低级醇的筛选实验对应染色显微观察图。

图6：本发明(迈克)与贝索、索莱宝的苏丹黑B染色显微观察图。

图7：本发明(迈克)与贝索、索莱宝的苏丹黑B染色玻片外观图。

图8：将贝索试剂盒中的苏丹黑B染色液替换成本发明苏丹黑B染液后的染色显微观察图。

具体实施方式

筛选例苏丹黑B染液组分筛选

本筛选例中统一使用苏丹黑B染色，并用瑞姬氏染液进行复染，具体步骤如下：

1)复染工作液的配制：将瑞姬氏染液(C液)和稀释后的磷酸盐缓冲液(D液)按1∶2比例混合，混匀待用；

2)固定：干燥的骨髓涂片或血涂片用固定剂(A液)固定30秒～60秒，纯化水冲洗，待干或滤纸吸干；

3)染色：固定后的细胞涂片浸入苏丹黑B染液(B液)中，37℃孵育20分钟～30分钟，纯化水冲洗，待干或滤纸吸干；

4)复染：将染色后的细胞涂片浸入复染工作液中，复染3分钟～5分钟，纯化水冲洗，待干或滤纸吸干；

5)镜检。

本例中，固定剂(A液)的配制为本领域的常规方法，例如，将甲醛和乙醇按体积比1∶9混合即可；瑞姬氏染液(C液)的配制为本领域的常规方法：将瑞氏色素加吉氏色素溶解于甲醇溶液里，即得；磷酸盐缓冲液(D液)的配制方法为本领域的常规方法，其pH值为6.1～6.6。苏丹黑B染液(B液)的配方见如下的筛选。

1.苏丹黑B浓度筛选

按下表给出配方配制苏丹黑B染液，对血涂片进行染色。

结果如图1所示，苏丹黑B染色随着苏丹黑B浓度的增加，染色效果越来越强(染色目标为粒细胞，即图中最为醒目的黑色球，在0.1％、0.3％、0.5％、1.0％组为1个，在0.7％组为2个；黑色球中间蓝紫色为瑞姬氏染液对细胞核的染色，而边缘深黑色为苏丹黑B对细胞质中脂类物质的染色)，但是苏丹黑B浓度太大(例如，1.0％)容易引起背景杂质的产生(杂质为红细胞之外、很细小的点)。

苏丹黑B除了定位于粒细胞的胞浆中，还可用于检测单核细胞。由于有些单核细胞及嗜碱粒细胞的颗粒较小，苏丹黑B染色的背景杂质多，可能会对这些阳性细胞的检测进行干扰。

苏丹黑B的浓度在0.1％～0.7％范围内，几乎无背景杂质，均能很好地达到染色目的，其中浓度为0.5％时，效果最佳。

2.乙醇浓度的筛选试验

按下表给出配方配制苏丹黑B染液，对血涂片进行染色。

不同乙醇浓度的染色结果如图2所示，可以看出乙醇浓度为10％时染色会有大量背景杂质，进而粒细胞的辨识度较差；乙醇浓度为20％～60％时染色背景干净，随着乙醇浓度增加，苏丹黑B的染色信号逐渐变弱。

乙醇浓度在20％～60％范围内，染色较好；优选地，乙醇浓度为30％～50％；乙醇的最优浓度是50％。

3.TX-100含量的筛选试验

按下表给出配方配制苏丹黑B染液，对血涂片进行染色。

不同TX-100含量的染色结果如图2所示。

从图3可以看出：TX-100含量为0.3％时，背景杂质较多，不利于对粒细胞的辨识；TX-100含量为0.5％时，杂质减少，粒细胞能够较好辨识；当TX-100含量为1.0％时，未见明显杂质，粒细胞的染色强度大、辨识度高，染色效果佳；当TX-100含量为1.5％时，苏丹黑B的染色信号变淡，但尚能有效辨别粒细胞；当TX-100含量为2.0％时，粒细胞胞浆中的脂类物质不能有效地被着色，辨识度较差。

总的来说，苏丹黑B对单核细胞的染色强度随着TX-100的浓度增加而呈现先增后减的趋势；结合背景杂质综合考虑，TX-100在0.5％～1.5％范围内均可达成染色目的，优选值为1.0％。

4.表面活性剂的筛选试验

按下表给出配方配制苏丹黑B染液，对血涂片进行染色。其中表面活性剂的浓度(体积分数)均为1％。

不同表面活性剂选择的染色结果如图4所示：Tween-20、A60和B66组均出现较多背景杂质，辨识度差；而TX-100组无杂质，粒细胞染色更易辨识。因此，TX-100是苏丹黑B染液中的最佳表面活性剂。

5.有机溶剂筛选

发明人通过实验发现，苏丹黑B染液中的乙醇可替代为甲醇、乙二醇、丙三醇或异丙醇。按下表给出配方配制苏丹黑B染液，对血涂片进行染色。

从图5看出，苏丹黑B染液中的乙醇用乙二醇、丙三醇或异丙醇等其他低级醇替代时，染色背景杂质较少，均能实现较好的染色效果。根据本领域技术人员的合理推断，丙二醇(1，2-丙二醇、1，3-丙二醇)是3个碳原子的低级醇，20％-50％的丙三醇能替代等浓度丙三醇或异丙醇作为苏丹黑B的溶剂，达到较好的染色效果。将各种低级醇混合使用，也能达到较好的染色效果。

对比例与珠海贝索生物技术有限公司(简称“贝索”)、北京索莱宝科技有限公司(简称“索莱宝”)市售同类产品的染色效果比对

1.产品信息：

1)贝索同类产品：贝索苏丹黑B染色液(SBB)(INS-SBB03)，100ml；包括：固定剂、苏丹黑B溶液、瑞姬氏染液和磷酸缓冲液粉剂；本产品各组分可以单独使用，不用批号的各组分产品可交换使用。

2)索莱宝同类产品：苏丹黑B染色液(细胞专用)，货号：G1691；包括3种组分：试剂A(SBB fixative，固定液)、试剂B(SBB Stain，苏丹黑B染液)和试剂C(Wright Stain，瑞氏染液)。

2.染色效果直接对比

2.1方法

贝索与索莱宝产品的染色按照各自试剂盒说明书进行操作。具体地：

贝索试产品：

a.取血涂片，用固定剂固定30～60秒，蒸馏水冲洗，晾干；

b.苏丹黑B溶液37℃孵育20～30分钟，蒸馏水冲洗，晾干；

c.瑞姬氏染色3～5分钟。

索莱宝产品：

a.取血涂片，固定液固定10～15min，晾干；

b.苏丹黑B于室温浸染60min；

c.70％乙醇洗去多余染液，蒸馏水浸洗1min；

d.瑞氏染液染色20～30min。

本发明产品具体组成为同实施例1，染色步骤同筛选例。

2.2结果

染色效果如图6所示。可以看出，本发明提供的苏丹黑B溶液染色，染色背景清晰、杂质少，染色效果明显优于贝索和索莱宝的同类产品。

图7为染色玻片的外观图，由图可知，与本发明的染色相比，索莱宝染色样品出现固定不牢，样品脱落的情况；而贝索染色样品背景较重。

3.本发明试剂和贝索试剂的交叉实验

为了说明本发明苏丹黑B染液的普适性，发明人将贝索试剂盒产品的“苏丹黑B溶液”替换成本发明的苏丹黑B染液，其余组分(固定剂、瑞姬氏染液等)不变，进行染色测试。

结果如图8所示，其染色背景干净无杂质，粒细胞的染色效果良好。

综上，本发明的苏丹黑B染液不仅染色背景干净无杂质，而且染色信号强、染色效果清晰，易于观察。

Claims

1.一种苏丹黑B染液，其特征在于：每100ml组成如下：苏丹黑B 0.1～0.7g，低级醇20～60ml，TX-100 0.5～1.5ml，余量为水；

优选地，所述低级醇选白每分子含有1～3个碳原子的醇中的1种或2种以上任意配比的组合。

2.如权利要求1所述的苏丹黑B染液，其特征在于：

所述低级醇选自每分子含1～2个碳原子的醇中的1种或2种以上任意配比的组合；

3.如权利要求1所述的苏丹黑B染液，其特征在于：

所述低级醇为每分子含3个碳原子的醇中的1种或2种以上任意配比的组合；

4.如权利要求1～3任一所述的苏丹黑B染液，其特征在于：每100ml染液中苏丹黑B的用量为0.5g。

5.如权利要求1～3任一所述的苏丹黑B染液，其特征在于：每100ml染液中TX-100用量为1ml。

6.一种苏丹黑B染色试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1～5任一所述的苏丹黑B染液和染色前固定细胞用的固定剂；

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：它还包括瑞姬氏染液。

8.一种骨髓涂片或血涂片的染色方法，其特征在于：它是使用权利要求6或7所述试剂盒对干燥的骨涂图片或血涂片进行染色；

优选地，包括如下步骤：

2)染色：使用权利要求1～5任一所述苏丹黑B染色液于37℃孵育20～30min，用水冲洗，待干或滤纸吸干；

3)镜检。

9.如权利要求8所述的染色方法，其特征在于：步骤2)和3)之间还有复染步骤：

使用3倍稀释的瑞姬氏染液复染3～5min，用水冲洗，待干或滤纸吸干。

10.权利要求1～5所述苏丹黑B染液的制备方法，其特征在于：它是先将苏丹黑B溶解于低级醇，再加TX-100，再用水定容；

或，先将苏丹黑B溶解于低级醇，再加水定容，再加入TX-100。