CN110799205A

CN110799205A - 利用CRISPR-Cpf1的可诱导、可调和多重的人类基因调节

Info

Publication number: CN110799205A
Application number: CN201880041218.8A
Authority: CN
Inventors: Y·G·泰克; B·克莱因斯蒂弗; J·K·乔昂格
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2020-02-14
Also published as: WO2018195540A1; US12202861B2; JP2020517240A; US20230416310A1; AU2022256191A1; US11667677B2; JP7379160B2; US20210309701A1; AU2018254616A1; CA3059208A1; EP3612204A1; JP2024012462A; EP3612204A4; AU2018254616B2

Abstract

药物可诱导、可调和可多重化的基于普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的成簇规律间隔的短回文重复1(Cpf1)的激活子，以及其使用方法。

Description

利用CRISPR-Cpf1的可诱导、可调和多重的人类基因调节

优先权声明

本申请要求2017年4月21日提交的美国专利申请系列号No.62/488,585的权益。上述的全部内容通过引用并入本文。

联邦政府赞助的研究或开发

本发明是在美国国立卫生研究院授予的拨款号No.GM107427和GM118158的政府支持下完成的。政府在本发明中拥有一定权利。

技术领域

本文描述的是药物可诱导、可调和可多重化的基于Cpf1的激活子，以及其使用方法。

背景技术

RNA指导的CRISPR核酸酶由于它们便于重编程来识别目标DNA序列而革新了生物学和治疗学。广泛使用的来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)可以使用相关的互补指导RNA(gRNA)靶向特定的DNA序列，条件是还存在NGG形式的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)。

发明内容

本发明至少部分地基于组成型活性和化学可诱导的基于dCpf1的转录激活子平台的开发以及其使用方法，包括使用多重Cpf1 gRNA表达来实现人类细胞中内源基因的协同或组合激活的方法。

因而，本文提供的是融合蛋白，其包括无催化活性的(即，对于DNA核酸内切酶活性是无催化活性的)、来自毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的成簇规律间隔的短回文重复1(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats from Prevotella and Francisella 1，Cpf1)蛋白Cpf1(dLbCpf1)，其与至少一个激活结构域(例如，1、2、3、4或更多个激活结构域)融合，优选地其中所述激活结构域是合成的VPR激活子(即，包含四个拷贝的VP16、人类NF-KB p65激活结构域和Epstein-Barr病毒R反式激活子(Rta)))。其他的激活结构域包括VP64、Rta、NF-κB p65和p300，在Cpf1和/或每个激活结构域之间具有任选的间插接头。

进一步地，本文提供的是融合蛋白，其包括与条件性二聚化结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006 Cpf1(dLbCpf1)，在Cpf1和/或每个激活结构域之间具有任选的间插接头。在某些实施方案中，条件性二聚化结构域是DmrA或DmrC。这些融合蛋白可以在组合物或试剂盒中提供，所述组合物或试剂盒还包括第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的至少一个激活结构域(例如，1、2、3、4或更多个激活结构域)，在每个激活结构域和/或第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚。在某些实施方案中，权利要求2的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrA，第二条件性二聚化结构域是DmrC，或(ii)权利要求2的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrC，第二条件性二聚化结构域是DmrA。在某些实施方案中，所述激活结构域是VP64、Rta、NF-κB p65、VPR或p300。

还提供的是试剂盒，其包含所述融合蛋白和/或编码本文描述的融合蛋白的核酸，任选地具有二聚剂。

本文还提供的是编码本文描述的融合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体、以及包含所述核酸和/或载体并且任选地表达所述融合蛋白的细胞。

进一步地，提供的是提高细胞中目标基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞接触、或在所述细胞中表达以下中的一种或多种：

(i)融合蛋白，所述融合蛋白包括与至少一个激活结构域(例如，1、2、3、4或更多个激活结构域)融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006蛋白Cpf1(dLbCpf1)；以及至少一种crRNA，所述crRNA将融合蛋白导向目标基因的调节区，例如启动子区；和/或

(ii)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括与条件性二聚化结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006 Cpf1(dLbCpf1)，在Cpf1和/或每个激活结构域之间具有任选的间插接头；和第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与第一融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚(在激活结构域和第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头)；以及至少一种crRNA，所述crRNA将融合蛋白导向目标基因的调节区，例如启动子区。

还提供的是提高细胞中多个目标基因(例如，两个、三个、四个或更多个)的表达的方法，所述方法包括使所述细胞接触、或在所述细胞中表达以下中的一种或多种：

(i)融合蛋白，所述融合蛋白包括与至少一个激活结构域(例如，1、2、3、4或更多个激活结构域)融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006蛋白Cpf1(dLbCpf1)；以及编码多种crRNA的至少一种核酸，所述crRNA各自将融合蛋白导向目标基因之一的调节区，例如启动子区；和/或

(ii)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括与条件性二聚化结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006 Cpf1(dLbCpf1)，在Cpf1和/或每个激活结构域之间具有任选的间插接头；和第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与第一融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚；以及编码多种crRNA的至少一种核酸，所述crRNA各自将融合蛋白导向目标基因之一的调节区，例如启动子区。

在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。本文提及的所有公开物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用将其全部内容并入本文。在冲突的情况下，以本说明书、包括定义为准。

根据以下的详细说明和附图，以及根据权利要求，本发明的其他特征和益处将是明显的。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。带有彩色附图的本申请或专利申请出版物的拷贝将在请求和支付了必要的费用时由官方提供。

图1A-1E.使用单个crRNA和基于dLbCpf1的激活子的靶向人类内源基因调节(A)显示直接dLbCpf1-VPR和dLbCpf-p65激活子融合蛋白的示意图。(B)使用单一crRNA，在人类HEK293细胞中三个内源人类基因(HBB、AR和NPY1R)上dLbCpf1-p65或dLbCpf1-VPR的活性。通过RT-qPCR测量指明的基因启动子的相对激活。三种独立的单个crRNA靶向每个基因的转录起始位点上游1kg的启动子序列之内。通过与不表达crRNA的对照样品相比较来计算相对mRNA表达。(C)靶向人类CD5和CD22启动子的各种crRNA的分析。设计32种crRNA(每个基因16种)来靶向每个基因的TSS的上游1kb的启动子序列或下游500bps之内的目标位点。没有靶向重复序列。在转染后72小时，用针对CD5或CD22蛋白的荧光标记的抗体对细胞进行染色，通过流式细胞术定量荧光阳性细胞。误差线代表三个生物学重复的s.e.m.。黑色圆圈代表与不表达crRNA的对照相比显著不同的(学生t-检验，双尾试验，假设方差相等，p<0.05)样品。(D)说明药物可诱导的两部分基于dLbCpf1的激活子(bi-partite dLbCpf1-basedactivator)融合蛋白的示意图。dLbCpf1与一至四个DmrA结构域融合，VPR或p65与DmrC结构域融合。由于DmrA和DmrC仅在A/C杂二聚体药物(红色菱形)的存在下相互作用，所述两部分激活子仅在该药物的存在下重构。(E)人类HEK293细胞中使用三个内源人类基因(HBB、AR和NPY1R)的单一crRNA，药物可诱导的两部分基于dLbCpf1的激活子的活性。通过RT-qPCR测量指明的基因启动子的相对激活。用于每个启动子的crRNA是上文(B)中显示最高活性的那一个。(B)和(E)中显示的数据代表三个生物学上独立的重复，误差线表示三个技术重复的标准差(SD)。

图2A-2I.基于dLbCpf1的激活子对内源人类基因的多重和协同的调节(A)设计以表达单一转录产物上编码的多个gRNA的表达盒的示意图。箭头指示dLbCpf1的RNase活性加工的切割位点。(B)说明单一细胞中各自靶向不同的内源基因启动子的三种crRNA的多重表达的示意图。(C)利用从多重转录产物表达的、或从单个转录产物表达的crRNA，使用dLbCpf1-VPR直接融合物(左侧画面)、dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-VPR融合物(中间画面)以及dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-p65融合物(右侧画面)，对三个内源人类基因的同时激活。使用RT-qPCR测量HEK293细胞中的转录产物，通过与没有表达crRNA的对照样品相比计算相对mRNA表达。(D)人类U2OS细胞中不同的基于dLbCpf1的激活子的MST crRNA的活性。图形显示了使用dLbCpf1-VPR直接融合物、dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-p65融合物以及dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-VPR融合物，以及从多重单一转录产物(MST)表达的或从编码单一crRNA的转录产物表达的crRNA，对三个内源人类基因的激活。通过RT-qPCR测量RNA表达，显示的相对表达通过与没有表达crRNA的对照样品比较来计算。(E)说明同样的细胞中各自靶向同样的内源基因启动子的三种crRNA的多重表达的示意图。(F)使用从多重转录产物表达的或从单个转录产物表达的三种crRNA，直接dLbCpf1-p65或dLbCpf1-VPR融合物对HBB、AR或NPY1R内源基因启动子的活性。使用RT-qPCR测量HEK293细胞中的转录产物，通过与没有表达crRNA的对照样品相比计算相对mRNA表达。(G)使用从多重转录产物表达的或从单个转录产物表达的三种crRNA的集合，dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-VPR融合物、或dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-p65融合物对HBB、AR或NPY1R内源基因启动子的活性。使用RT-qPCR测量HEK293细胞中的转录产物，通过与没有表达crRNA的对照样品相比计算相对mRNA表达。(C)、(D)、(F)和(G)中显示的数据代表三个生物学上独立的重复，误差线表示三个技术重复的标准差(SD)。hU6，人类U6聚合酶III启动子；DR：指导重复序列。(H)A/C异二聚体药物调节的基于dLbCpf1的激活子的可诱导性和可逆性。为了测量激活子诱导的动力学，使用表达dLbCpf1-DmrA(×4)、DmrC-p65和靶向人类HBB或AR启动子的MST crRNA的质粒转染HEK293细胞。转染后34小时，将这些细胞分成两个培养物：一个使用含有A/C异二聚体(500μM)的培养基(上部，黑色)，一个使用缺乏A/C异二聚体的培养基(底部，灰色)。在各个时间点采集细胞，与阴性对照相比较通过RT-qPCR测量相对mRNA表达水平。(I)为了测量可逆性的动力学，如(H)中的转染HEK293细胞。转染后24小时，将A/C异二聚体(500μM)添加到培养基中。10小时后，将这些细胞分成两个培养物：一个使用含有A/C异二聚体(500μM)的培养基(上部，蓝色)，一个使用缺乏A/C异二聚体的培养基(底部，紫色)。在各个时间点采集细胞，与阴性对照相比较通过RT-qPCR测量相对mRNA表达水平。误差线代表三个生物学重复的s.e.m.。

具体实施方式

无催化活性形式的SpCas9(“死的”SpCas9或dSpCas9)核酸酶已经与转录激活子或阻遏物结构域融合来分别改变基因表达或基因组广度，用于哺乳动物细胞中的文库筛选^1-4，然而有效的激活需要将多个调节结构域征募到单一启动子上⁵。还已经描述了基于小分子dCas9的和基于光可诱导的dCas9的基因调节融合物，为该平台额外提供了重要的能力^6-10。近期描述的核酸酶CRISPR-Cpf1提供了超越包括较短长度gRNA的SpCas9的其他重要能力，靶向可选择的富T PAM序列的能力，以及通过Cpf1核酸酶自身加工来自单一转录产物的多个指导RNA¹¹。然而，就本发明人所知，基于“死”Cpf1的基因调节物迄今为止仅被用于在细菌¹²和植物(拟南芥(Arabidopsis))¹³中抑制基因表达，还没有显示在哺乳动物细胞中起作用或用于激活目标基因。在此我们描述了组成型活性的和可化学诱导的基于dCpf1的转录激活子平台，并且显示可以利用多重Cpf1 gRNA表达来实现人类细胞中内源基因的协同或组合的激活。

据我们所知，本文报道的结果提供了首次证明，即RNA指导的基于Cpf1的融合物可以用于在任何细胞类型中激活内源基因表达，以及人类细胞中Cpf1衍生的基因调节蛋白的首次使用。与SpCas9相比LbCpf1的正交的PAM识别特异性(TTTN对比NGG)打开了用于RNA指导激活子蛋白的一系列新的可靶向序列。考虑到与SpCas9相比所报道的LbCpf1的更高基因组广度的特异性^14,15，dLbCpf1激活子可能具有与dSpCas9激活子可比较的特异性，dSpCas9激活子已经通过RNA-seq显示产生即使有也更少的脱靶基因激活事件。

本工作还建立了药物可诱导的dLbCpf1激活子，其可以用于以多种方式控制基因调节。这些激活子包括配对的融合蛋白，第一融合蛋白，其包括与条件性二聚化结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006Cpf1(dLbCpf1)，在Cpf1和/或每个激活结构域之间具有任选的间插接头；和第二融合蛋白，其包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域，在激活结构域和第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与所述第一融合的蛋白中的条件性二聚化进行二聚。这些激活子的两部分的性质允许用细胞可透过的A/C二聚体药物将它们的活性打开或关闭，这对实验系统提供了有用的可能性。此外，通过提高与dLbCpf1融合的DmrA二聚体结构域的数量可以调节期望的激活水平，推测起来这引起提高数量的DmrC激活子融合物向给定启动子的征募。改变DmrC融合物中使用的激活结构域影响了观察到的激活程度。稍微令人惊讶地，以及与早先基于dSpCas9的激活子的结果相对比，与合成的VPR激活子(其含有六个强激活结构域)相比，p65结构域(使用单个crRNA)更一致性地激活所检查的三个基因启动子。使用导向目标启动子的多种crRNA，p65结构域提供了对两种基因的更强的激活，观察到协同作用。能够使用天然发生的p65激活结构域而不是合成的VPR是有益的，因为它避免了由非常强力的激活子引起的不希望的副作用(例如，压制)^16,17。在它用于基因激活的功用之外，这种药物可诱导的多重的基于dCpf1的平台可以用于允许其他异源蛋白质或功能结构域向感兴趣的任何内源基因组座位的靶向征募。

本工作还证明了，可以利用Cpf1平台的关键优点，即在单一转录产物上更简单地编码多种crRNA的能力，从而在相同的单一细胞中实现内源人类基因的多重激活。使用dSpCas9基因调节蛋白的多重调节是有挑战的，因为如果从独立的启动子表达gRNA，有启动子之间相当程度的重组¹⁸，或者如果从单一转录产物表达多个gRNA，则必须要另外的辅助RNA序列、启动子或反式作用因子^19-25。相反，Cpf1使用的crRNA的更短的～40nt长度允许在单一寡核苷酸上容易地编码两种或三种crRNA，从而允许利用基于芯片的合成来构建靶向感兴趣基因的、精确的用户指定的crRNA的组合；使用dSpCas9 gRNA做到这一点是更有挑战性的，因为需要更长的(～100nt)指导RNA，并且需要辅助序列和因子以允许从单一转录产物进行加工。因而，这些结果证明了进行一些方法的可行性，包括其中同时调节两个以上的基因的表达的多重文库筛选，从而允许利用这种方法分析更复杂的细胞表型。

Cpf1

成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)系统编码细菌适应性免疫所必需的RNA指导的内切核酸酶²⁶。CRISPR相关(Cas)核酸酶可以容易地进行编程来切割目标DNA序列，用于各种生物体中的基因组编辑^27-30。这些核酸酶的一个类别，称为Cas9蛋白，与两个短RNA复合：crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)^31,32。最常用的Cas9直系同源体，SpCas9，使用在其5'末端具有与目标DNA位点的“前间区”区域互补的20个核苷酸(nt)的crRNA。高效的切割还需要SpCas9识别前间区邻近基序(PAM)。crRNA和tracrRNA通常组合成单一的～100nt的指导RNA(gRNA)^31,33-35，其指导SpCas9的DNA切割活性。已经使用许多不同的方法表征了与不同的gRNA配对的SpCas9核酸酶的基因组广度的特异性^36-39。还已经工程化了具有实质上改善的基因组广度特异性的SpCas9变体^40,41。

近来，已经鉴定出称为Cpf1的Cas蛋白，其也可以进行编程来切割目标DNA序列^42-45。不同于SpCas9，Cpf1仅需要单一的42-nt的crRNA，其在它的3'末端具有与目标DNA序列的前间区互补的23nt⁴⁴。此外，虽然SpCas9识别前间区3'的NGG PAM序列，AsCpf1和LbCp1识别位于前间区的5'的TTTN PAM⁴⁴。AsCpf1和LbCpf1的早期实验显示，这些核酸酶可以被编程来编辑人类细胞中的目标位点⁴⁴，但是它们仅在少量位点上进行试验。AsCpf1和LbCpf1的中靶活性和基因组广度特异性都在Kleinstiver&Tsai等人,Nature Biotechnology 2016中表征。

本文提供的是包含LbCpf1的融合蛋白。LbCpf1野生型蛋白质序列如下：

LbCpf1-V型CRISPR-相关蛋白Cpf1[毛螺旋菌科细菌ND2006[,GenBank AceNo.WP_051666128.1

不含18氨基酸的信号序列的成熟LbCpf1：

MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKLKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSLKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFK

KIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDENNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIDRGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKH(SEQ ID NO：2)

本文描述的LbCpf1变体可以包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，例如，至少包含SEQID NO：1的氨基酸23-1246，并且在表A的一个或多个位置处具有突变(即，用不同的氨基酸例如，丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸替换天然氨基酸)，SEQ ID NO：1的氨基酸19-1246与SEQ IDNO：2的氨基酸1-1228相同(SEQ ID NO：1的氨基酸1-1246在本文中称为LbCpf1(+18))。在某些实施方案中，所述LbCpf1变体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少80％，例如至少85％、90％或95％相同，例如，在被替换的SEQ ID NO：2的残基的高达5％、10％、15％或20％处有差异，例如除了本文描述的突变之外，具有保守性突变。在优选的实施方案中，所述变体保持了亲本的期望的活性，例如核酸酶活性(除非其中所述亲本是切口酶或死Cpf1)，和/或与指导RNA和目标DNA相互作用的能力。本工作实施例中使用的LbCpf1的形式是SEQ ID NO：2，省略了上文方框中的前18个氨基酸，如Zetsche等人Cell 163,759-771(2015)中所描述的。

在某些实施方案中，所述Cpf1变体还包括表A中列出的以下突变之一，其降低或破坏Cpf1的核酸酶活性(即，使得它们无催化活性)：

表A

参见，例如，Yamano等人,Cell.2016May 5；165(4):949-62；Fonfara等人,Nature.2016Apr 28；532(7600):517-21；Dong等人,Nature.2016Apr 28；532(7600):522-6；和Zetsche等人,Cell.2015Oct 22；163(3):759-71。注意，“LbCpf1(+18)”是指SEQ IDNO:1的全部氨基酸序列1-1246，而LbCpf1是指Zetsche等人中LbCpf1的序列，本文也显示为SEQ ID NO:2的氨基酸1-1228和SEQ ID NO:1的氨基酸19-1246。因而，在某些实施方案中，对于LbCpf1，催化活性破坏突变在D832和E925处进行，例如，D832A和E925A。

所述Cpf1变体，优选地包含一个或多个核酸酶降低或杀灭突变，可以在Cpf1的N或C末端融合至转录激活结构域(例如，来自单纯性疱疹病毒的VP16结构域的转录激活结构域(Sadowski等人,1988,Nature,335:563-564)或VP64；来自细胞转录因子NF-kappaB的p65结构域(Ruben等人,1991,Science,251:1490-93)；或融合于dCas9的三联效应物，其由串联连接的激活子VP64、p65和Rta(VPR)组成，Chavez等人,Nat Methods.2015Apr；12(4):326-8)；或p300 HAT结构域。p300/CBP是一种组蛋白乙酰基转移酶(HAT)，它的功能对于在哺乳动物细胞中调节基因表达是关键的。p300 HAT结构域(1284-1673)是催化活性的，可以融合到核酸酶用于靶向表观基因组编辑。参见Hilton等人,Nat Biotechnol.2015May；33(5):510-7。

可以使用任何可诱导的蛋白二聚化系统，例如，基于FK506-结合蛋白(FKBP)，参见，例如，Rollins等人,Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun 20；97(13):7096-7101；来自Clontech/Takara的iDFMERIZE^TM可诱导异二聚体系统，其中感兴趣的蛋白分别融合至DmrA和DmrC结合结构域，通过添加A/C异二聚体(AP21967)诱导二聚化。其他也是已知的，例如，CyP-Fas和FKCsA二聚剂的FKBP(参见Belshaw等人,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America.93(10):4604-7(1996))；使用雷帕霉素二聚剂的FKBP和mTOR的FRB结构域(Rivera等人,Nature Medicine.2(9):1028-32(1996))；使用香豆霉素二聚剂的GyrB结构域(Farrar等人,Nature.383(6596):178-81(1996))；赤霉素诱导的二聚化(参见Miyamoto等人,Nature Chemical Biology.8(5):465-70(2012)；Miyamoto等人,Nature Chemical Biology.8(5):465-70(2012))；以及基于衍生自HaloTags的小分子交联融合蛋白和SNAP-标签的蛋白异二聚化系统(Erhart等人,Chemistry and Biology.20(4):549-57(2013)。

为了确定两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较的目的将序列比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳的比对，并且出于比较的目的可以忽视非同源的序列)。出于比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少80％，在某些实施方案中是至少90％或100％。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则该分子在该位置是同一的(即，如本文使用的，核酸“同一性”等同于核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数量的函数，考虑了为了两个序列的最佳比对需要引入的空位的数量、每个空位的长度。按照本领域技术技术范围内的各种方式确定两个多肽或核酸序列之间的同一性百分比，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如，Smith Waterman Alignment(Smith,T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-7)；已合并到GeneMatcher Plus^TM中的“BestFit”(Smith和Waterman,Advances in AppliedMathematics,482-489(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence andStructure,Dayhof,M.O.,编著,pp 353-358；BLAST程序(Basic Local Alignment SearchTool；(Altschul,S.F.,W.Gish,等人(1990)J Mol Biol 215:403-10)，BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可以确定用于衡量比对的合适参数，包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。一般地，对于蛋白质或核酸，比较的长度可以是任何长度，达到或包括全长(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)。出于本组合物和方法的目的，序列全长的至少80％进行比对。

为了本发明的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用Blossum 62评分矩阵、使用空位罚分12、空位延伸罚分4以及移框缺口罚分5来完成。

保守性取代一般包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。

在某些实施方案中，所述突变体具有代替野生型氨基酸的丙氨酸。在某些实施方案中，所述突变体具有精氨酸或赖氨酸(或天然氨基酸)以外的任何氨基酸。

本文还提供的是编码所述Cpf1融合蛋白的分离的核酸；载体，其包含任选地与一个或多个调节结构域可操作连接的分离的核酸，以用于表达所述变体蛋白；以及宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，其包含所述核酸并任选地表达所述变体蛋白。

本文描述的融合蛋白可以用于改变细胞的基因组；所述方法一般包括在所述细胞中表达所述变体蛋白，以及具有与所述细胞的基因组的选定部分互补的区域的指导RNA。选择性地改变细胞的基因组的方法是本领域已知的，参见，例如，US 8,993,233；US20140186958；US 9,023,649；WO/2014/099744；WO 2014/089290；WO2014/144592；W0144288；WO2014/204578；WO2014/152432；WO2115/099850；US8,697,359；US20160024529；US20160024524；US20160024523；US20160024510；US20160017366；US20160017301；US20150376652；US20150356239；US20150315576；US20150291965；US20150252358；US20150247150；US20150232883；US20150232882；US20150203872；US20150191744；US20150184139；US20150176064；US20150167000；US20150166969；US20150159175；US20150159174；US20150093473；US20150079681；US20150067922；US20150056629；US20150044772；US20150024500；US20150024499；US20150020223；；US20140356867；US20140295557；US20140273235；US20140273226；US20140273037；US20140189896；US20140113376；US20140093941；US20130330778；US20130288251；US20120088676；US20110300538；US20110236530；US20110217739；US20110002889；US20100076057；US20110189776；US20110223638；US20130130248；US20150050699；US20150071899；US20150045546；US20150031134；US20150024500；US20140377868；US20140357530；US20140349400；US20140335620；US20140335063；US20140315985；US20140310830；US20140310828；US20140309487；US20140304853；US20140298547；US20140295556；US20140294773；US20140287938；US20140273234；US20140273232；US20140273231；US20140273230；US20140271987；US20140256046；US20140248702；US20140242702；US20140242700；US20140242699；US20140242664；US20140234972；US20140227787；US20140212869；US20140201857；US20140199767；US20140189896；US20140186958；US20140186919；US20140186843；US20140179770；US20140179006；US20140170753；WO/2008/108989；WO/2010/054108；WO/2012/164565；WO/2013/098244；WO/2013/176772；Makarova等人,"Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems"9(6)Nature Reviews Microbiology 467-477(1-23)(Jun.2011)；Wiedenheft等人,"RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea"482Nature 331-338(Feb.16,2012)；Gasiunas等人,"Cas9-crRNAribonucleoprotein complex mediatesspecific DNAcleavage for adaptive immunity in bacteria"109(39)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USAE2579-E2586(Sep.4,2012)；Jinek等人,"AProgrammable Dual-RNA-Guided DNAEndonuclease in Adaptive Bacterial Immunity"337Science 816-821(Aug.17,2012)；Carroll,"ACRISPR Approach to Gene Targeting"20(9)Molecular Therapy 1658-1660(Sep.2012)；2012年5月25日提交的美国申请No.61/652,086；Al-Attar等人,Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats(CRISPRs):The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism inProkaryotes,Biol Chem.(2011)vol.392,Issue 4,pp.277-289；Hale等人,EssentialFeatures and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMPModule Complex to Cleave RNAs,Molecular Cell,(2012)vol.45,Issue 3,292-302。

本文描述的融合蛋白可以用于代替或补充上述参考文献中描述的Cas9或Cpf1蛋白，或与其中描述的类似突变组合，使用适合于选定的Cpf1的指导RNA，即，使用靶向选定序列的指导RNA。

此外，本文描述的融合蛋白可以用于代替本领域已知的野生型Cas9、Cpf1或其他Cas9或Cpf1突变体(例如，dCpf1或Cpf1切口酶)，例如US 8,993,233；US 20140186958；US9,023,649；WO/2014/099744；WO 2014/089290；WO2014/144592；W0144288；WO2014/204578；WO2014/152432；WO2115/099850；US8,697,359；US2010/0076057；US2011/0189776；US2011/0223638；US2013/0130248；WO/2008/108989；WO/2010/054108；WO/2012/164565；WO/2013/098244；WO/2013/176772；US20150050699；US 20150071899和WO 2014/124284中描述的具有异源功能结构域的融合蛋白。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包括Cpf1变体和异源功能结构域之间的接头。可以用于这些融合蛋白(或串联结构的融合蛋白之间)的接头可以包括不干扰所述融合蛋白的功能的任何序列。在优选的实施方案中，所述接头是短的，例如，2-20个氨基酸，并且一般是柔性的(即，包含高自由度的氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。在某些实施方案中，所述接头包含由GGGS(SEQ ID NO:3)或GGGGS(SEQ ID NO:4)组成的一个或多个单元，例如，GGGS(SEQ ID NO:3)或GGGGS(SEQ ID NO:4)单元的两个、三个、四个或更多个重复。还可以使用其他接头序列。

在某些实施方案中，所述变体蛋白包括促进向细胞内空间递送的细胞穿透肽序列，例如，HIV衍生的TAT肽、穿透素(penetratins)、转运蛋白(transportans)或hCT衍生的细胞穿透性肽，参见，例如，Caron等人,(2001)Mol Ther.3(3):310-8；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL2002)；El-Andaloussi等人,(2005)Curr Pharm Des.11(28):3597-611；和Deshayes等人,(2005)Cell Mol Life Sci.62(16):1839-49

细胞穿透肽(CPP)是短肽，其促进各种各样的生物分子跨越细胞膜移动进入细胞质或其他细胞器，例如线粒体和核。可以通过CPP递送的分子的实例包括治疗药物、质粒DNA、寡核苷酸、siRNA、肽-核酸(PNA)、蛋白、肽、纳米颗粒和脂质体。CPP一般是30个氨基酸或更少，来源于天然或非天然发生的蛋白或嵌合序列，含有高相对丰度的正电荷氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸，或者交替模式的极性和非极性氨基酸。本领域中常用的CPP包括Tat(Frankel等人,(1988)Cell.55:1189-1193,Vives等人,(1997)J.Biol.Chem.272:16010-16017)、穿透素(Derossi等人,(1994)J.Biol.Chem.269:10444-10450)、聚精氨酸肽序列(Wender等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13003-13008,Futaki等人,(2001)J.Biol.Chem.276:5836-5840)和转运蛋白(Pooga等人,(1998)Nat.Biotechnol.16:857-861)。

CPP可以通过共价或非共价策略与它们的货物连接。共价连接CPP和它的货物的方法是本领域已知的，例如，化学交联(Stetsenko等人,(2000)J.Org.Chem.65:4900-4909,Gait等人(2003)Cell.Mol.Life.Sci.60:844-853)或克隆融合蛋白(Nagahara等人,(1998)Nat.Med.4:1449-1453)。货物与包含极性和非极性结构域的短的两亲性CPP之间的非共价偶联通过静电和疏水性相互作用来建立。

本领域中已经利用CPP来向细胞递送潜在治疗性的生物分子。实例包括用于免疫抑制的连接到聚精氨酸的环孢霉素(Rothbard等人,(2000)Nature Medicine 6(11):1253-1257)、用于抑制肿瘤发生的、与CPP连接的针对周期蛋白B1的siRNA，称为MPG(Crombez等人,(2007)Biochem Soc.Trans.35:44-46)，与CPP连接的肿瘤抑制物p53肽以降低癌细胞生长(Takenobu等人,(2002)Mol.Cancer Ther.1(12):1043-1049,Snyder等人,(2004)PLoSBiol.2:E36)，以及与Tat融合的Ras的显性阴性形式或磷酸肌醇3激酶(PI3K)以治疗哮喘(Myou等人,(2003)J.Immunol.171:4399-4405)。

本领域已经利用CPP将造影剂转运到细胞内用于成像和生物传感应用。例如，附着到Tat的绿色荧光蛋白(GFP)已经用于标记癌细胞(Shokolenko等人,(2005)DNA Repair 4(4):511-518)。缀合至量子点的Tat已经用于成功地跨越血脑屏障，用于大鼠脑的可视化(Santra等人,(2005)Chem.Commun.3144-3146)。CPP还与磁共振成象技术组合用于细胞成像(Liu等人,(2006)Biochem.and Biophys.Res.Comm.347(1):133-140)。还参见Ramsey和Flynn,Pharmacol Ther.2015Jul 22.pii:S0163-7258(15)00141-2。

可选地或另外地，所述变体蛋白可以包括核定位序列，例如，SV40大T抗原NLS(PKKKRRV(SEQ ID NO:5))和核质蛋白NLS(KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO：6))。其他NLS是本领域已知的，参见，例如，Cokol等人,EMBO Rep.2000Nov 15；1(5):411-415；Freitas andCunha,Curr Genomics.2009Dec；10(8):550-557。

在某些实施方案中，所述变体包括对配体例如GST、FLAG或六组氨酸序列具有高亲和性的部分。这样的亲和标签可以便于重组变体蛋白的纯化。

对于其中将变体蛋白递送给细胞的方法，所述蛋白可以使用本领域已知的任何方法产生，例如，通过体外翻译，或在合适的宿主细胞中从编码所述变体蛋白的核酸表达；生产蛋白的许多方法是本领域已知的。例如，所述蛋白可以在酵母、大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞系、植物、转基因动物或培养的哺乳动物细胞中产生并从中纯化；参见，例如，Palomares等人,“Production of Recombinant Proteins:Challenges and Solutions,”Methods Mol Biol.2004；267:15-52。此外，所述变体蛋白可以连接到便于转移入细胞的部分，例如，脂质纳米颗粒，任选地使用一旦蛋白处于细胞之内就被切割的接头。参见，例如LaFountaine等人,Int J Pharm.2015Aug 13；494(1):180-194。

表达系统

为了使用本文描述的Cpf1融合蛋白，可期望从编码它们的核酸中表达它们。这可以以多种方式进行。例如，编码Cpf1融合蛋白的核酸可以克隆到中间载体中，用于转化入原核或真核细胞用于复制和/或表达。中间载体一般是原核生物载体，例如，质粒，或穿梭载体、或昆虫载体，用于编码所述Cpf1融合蛋白的核酸的保存或操作，用于生产Cpf1融合蛋白。编码Cpf1融合蛋白的核酸还可以克隆到表达载体中，用于向植物细胞、动物细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞、真菌细胞、细菌细胞或原生动物细胞施用。

为了获得表达，一般将编码Cpf1融合蛋白的序列亚克隆到含有指导转录的启动子的表达载体中。适合的细菌和真核启动子是本领域公知的，例如，在Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual(3d ed.2001)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:ALaboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,eds.,2010)中描述。用于表达工程化的蛋白的细菌表达系统可以获自例如大肠杆菌、芽胞杆菌属物种(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva等人,1983,Gene 22:229-235)。用于这类表达系统的试剂盒是商购可得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域公知的，也是商购可得的。

用于指导核酸表达的启动子取决于具体的应用。例如，强组成型启动子一般用于融合蛋白的表达和纯化。相比之下，当Cpf1融合蛋白将被体内施用用于基因调节时，可以使用组成型或诱导型启动子，取决于Cpf1融合蛋白的具体运用。此外，用于Cpf1融合蛋白施用的优选的启动子可以是弱启动子，例如，HSV TK或具有类似活性的启动子。启动子还可以包括响应于反式激活的元件，例如，低氧响应元件、Gal4响应元件、lac阻遏物响应元件和小分子控制系统，例如四环素调节系统和RU-486系统(参见，例如，Gossen&Bujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547；Oligino等人,1998,Gene Ther,5:491-496；Wang等人,1997,Gene Ther,4:432-441；Neering等人,1996,Blood,88:1147-55；和Rendahl等人,1998,Nat.Biotechnol.,16:757-761)。

除了启动子之外，表达载体一般地含有转录单位或表达盒，其含有核酸在原核或真核宿主细胞中表达所需的所有其他元件。因而典型的表达盒含有启动子，其可操作地连接至，例如，编码所述Cpf1融合蛋白的核酸序列，以及例如转录产物的高效多聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点或翻译终止所需的任何信号。所述盒的其他元件可以包括，例如，增强子和异源剪接的内含子信号。

针对所述Cpf1融合蛋白的预期用途选择用于将遗传信息转运入细胞的具体表达载体，例如，在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达。标准的细菌表达载体包括质粒，例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和商业上可获得的标签-融合物表达系统例如GST和LacZ。

含有来自真核生物病毒的调节元件的表达载体常常用于真核表达载体中，例如，SV40载体、乳头状瘤病毒载体和来自Epstein-Barr病毒的载体。其他示范性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，和任何其他载体，所述载体容许蛋白质在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白(polyhedrin)启动子或其他显示了真核细胞中的表达有效性的启动子的指导下表达。

用于表达所述Cpf1融合蛋白的载体可以包括RNA Pol III启动子以驱动指导RNA的表达，例如，H1、U6或7SK启动子。这些人类启动子容许Cpf1融合蛋白在质粒转染之后在哺乳动物细胞中表达。

在某些实施方案中，使用编码多种Cpf1 gRNA的单一核酸，例如，如下

上文中hU6启动子以粗体显示。

Lb crRNA指导重复是AATTTCTACTAAGTGTAGAT(SEQ ID NO:38，上文以斜体显示。将Cpf1导向至目标基因的17-20nt(优选20)的间隔子序列表示为间隔子_序列_1、2或3。

某些表达系统具有用于选择稳定转染的细胞系的标志物，例如，胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。高产量表达系统也是适合的，例如，在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，以及在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下的gRNA编码序列。

一般包括在表达载体中的元件还包括在大肠杆菌(E.coli)中起作用的复制子，编码抗生素抗性的基因以允许选择带有重组质粒的细菌，处在质粒的非关键区域中的独特的限制性位点，以容许重组序列的插入。

使用标准的转染方法来产生表达大量蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准技术进行纯化(参见，例如，Colley等人,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22；Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990))。根据标准技术进行真核和原核细胞的转化(参见，例如，Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349-351；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu等人,eds,1983)。

可以使用向宿主细胞中引入外源核苷酸序列的任何已知的操作。这些包括利用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、核染、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体，游离的和整合的，以及任何其他公知的方法将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遗传材料导入宿主细胞中(参见，例如，上文的Sambrook等人)。仅仅必需的是，所使用的具体的遗传工程过程能够向能表达所述Cpf1变体的宿主细胞中成功地导入至少一种基因。

本发明还包括所述载体和包含所述载体的细胞，以及表达所述融合蛋白的细胞和转基因动物。

实施例

在以下实施例中进一步描述了本发明，其不限制本发明的范围，本发明的范围在权利要求中描述。

方法

以下实施例中使用了以下的材料和方法。

质粒和寡核苷酸

这项研究中使用的质粒和相关序列的列表在下文的序列章节中；LbCpf1crRNA信息在表1中。

表1.单一Cpf1 crRNA

名称	含Cpf1 PAM的间隔子序列	SEQ ID NO	基因组坐标
				HBB_P_1指导	TTTGTACTGATGGTATGGGGCCAA	39	Chr11:5248505-5248528
HBB_P_2指导	TTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAG	40	Chr11:5248452-5248475
				HBB_P_3指导	TTTGCAAGTGTATTTACGTAATAT	41	Chr11:5248550-5248573
AR_P_1指导	TTTGAGAGTCTGGATGAGAAATGC	42	ChrX:66763209-66763232
				AR_P_2指导	TTTCTACCCTCTTCTCTGCCTTTC	43	ChrX:66763260-66763283
AR_P_3指导	TTTGCTCTAGGAACCCTCAGCCCC	44	ChrX:66763299-66763322
				NPY1R_P_1指导	TTTCAAGCCTCGGGAAACTGCCCT	45	Chr4:164254005-164254028
NPY1R_P_2指导	TTTCTTTGTTTGCAGGTCAGTGCC	46	Chr4:164254048-164254071
				NPY1R_P_3指导	TTTGGGCTGGCGCTCGAGCTCTCC	47	Chr4:164254099-164254122

dLbCpf1-p65和dLbCpf1-VPR质粒(分别为JG1202和JG1211)通过Gibson组装使用BstZ17I和Not I位点通过将p65和VPR克隆入dLbCpf1(MMW1578)来构建。VPR从SP-dCas9-VPR扩增，其是George Church(Addgene质粒#63798)的赠送⁴⁶。使用Gibson克隆方法，通过将dLbCpf1插入AgeI和XhoI消化的构建体来产生dLbCpf1-DmrA(×1)到dLbCpf1-DmrA(×4)(分别为JG674、JG676、JG693和YET1000)，所述构建体具有不同数量的DmrA结构域(BPK1019、BPK1033、BPK1140、BPK1179分别用于dCas9-DmrA(×4)到dCas9-DmrA(×4)。早先描述的编码DmrC的质粒用NruI消化，具有G4S接头的p65或VPR通过Gibson组装添加用于DmrC-P65(BPK1169)和DmrC-VPR(MMW948)。对于构建单一crRNA质粒，crRNA间隔子的寡核苷酸对进行退火，连接入BsmBI消化的LbCpf1 crRNA骨架质粒，BPK3082(Addgene#78742)¹⁴。对于这项研究中使用的多重化crRNA的克隆，设计具有突出端的三对寡核苷酸。每个寡核苷酸对在T4 PNK的存在下退火，在一个反应中将所有三个寡聚物对连接至BsmBI和HindIII消化的LbCpf1 crRNA骨架质粒BPK3082。所有寡聚物对的序列在表2A-B中列出。

表2A.靶向单一启动子的多重化Cpf1 crRNA

表2B.靶向多个启动子的多重化Cpf1 crRNA

人类细胞培养和转染

HEK293细胞在37℃、5％CO2下在具有10％胎儿牛血清和1％青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中生长。750ng的dLbCpf1-p65/VPR和250ng的LbCpf1 crRNA使用3μl

转染试剂(Minis，cat#MIR2300)共转染到12孔平板中的HEK293细胞中。400ng与不同数量的DmrA融合的dLbCpf1，200ng的DmrC-p65/VPR和400ng的LbCpf1crRNA使用3μl LT-1共转染到12孔平板中的HEK293细胞中。

逆转录定量PCR

在转染后72小时使用

RNA Plus(Clontech,cat#740984.250)从转染的细胞提取总RNA，250ng纯化的RNA用于使用High-Capacity RNA-cDNA试剂盒(ThermoFisher，cat#4387406)进行cDNA合成。cDNA进行1:20稀释，3μl的cDNA用于定量PCR(qPCR)。使用cDNA、SYBR(ThermoFisher,cat#4385612)、检测每种目标转录产物的引物制备qPCR反应样品。引物序列在表3中列出。使用Roche LightCycler480进行qPCR。由于极低表达的转录产物的Ct值波动，当Ct值超过35时，我们将它们认为是35。用LbCpf1 crRNA骨架质粒转染的样品BPK3082用作阴性对照，相对于阴性对照的激活倍数水平对于HPRT1的表达进行归一化。

表3.RT-qPCR引物

F，正向；R，反向

实施例1.使用单个crRNA和基于dLbCpf1的激活子的靶向人类内源基因调节

在初始的实验中，我们试验无催化活性的Cpf1核酸酶与转录激活结构域的直接融合物(图1A)是否可以激活内源人类基因启动子。通过设计针对每个启动子的三种crRNA(参见表2A-B)，我们试验在人类HEK293细胞中不表达的三个不同内源基因的启动子(HBB、AR和NPY1R)。我们使用来自毛螺旋菌科细菌ND2006的Cpf1的无催化活性的死核酸酶形式(dLbCpf1)，因为我们和其他人已经证明与被报道在人类细胞中有活性的其他Cpf1核酸酶(来自氨基酸球菌种(Acidaminococcus sp.)BV3L6的AsCpf1)相比，它具有更高的核酸酶活性^14,36,44。使用九种单个crRNA试验的与单一人类NF-KB p65激活结构域的dLbCpf1融合物要么未能提高、或仅微弱地提高来自三个人类目标基因启动子的转录(图1B)，与使用dSpCas9的单一激活结构域融合物的早先公开的结果一致⁴⁶。相反，与合成的多聚VPR激活子(由四个拷贝的基于病毒的VP16激活子、人类NF-KB p65激活结构域和Epstein-Barr病毒R反式激活子Rta组成)的dLbCpf1融合物可以使用三个目标基因各自的至少一种crRNA显著地激活转录(图1B)。这个结果类似于早先dspcas9激活子的实验，其展现了需要征募多个转录激活结构域来实现目标基因启动子活性的有效上调^46,47。

我们还试验更大系列的32种crRNA，其位于编码细胞表面蛋白的两个另外的内源基因CD5和CD22的TSS 1kb上游或500bp下游之内。当位于TSS的～600bp上游和～400bp下游之间时，试验的32种crRNA的大多数可以显著激活目标基因启动子(图1C)，与使用dSpCas9激活子获得的结果一致³。使用基于dLbCpf1的激活子观察到的激活水平与天然发生的生物系统中观察到的激活水平是可比较的，类似于早先对类似的基于dCas9的激活子报道的激活水平⁵。

我们接下来试图开发可化学诱导的两部分的基于dLbCpf1的转录激活子。我们预想使用FK506-结合蛋白(FKBP)和FKBP-雷帕霉素-结合蛋白(FRB)的片段的二聚化系统，其分别被称为DmrA和DmrC结构域，仅在称为A/C异二聚体的雷帕霉素类似物的存在下相互作用⁴⁸，从而将dLbCpf1激活子分成两个部分，这两个部分仅在A/C药物的存在下组装(图1D)。使用在这些启动子上用直接dLbCpf1激活子融合物有效工作的单一crRNA的任何一个，与单一DmrA结构域融合的dLbCpf1以及与NF-KB p65或VPR融合的DmrC结构域一起未能激活HBB、AR或NPY1R基因的转录(图1E)。由于提高与dLbCpf1连接的DmrA结构域的数量可以提高基因激活的效率，我们构建了带有两个、三个或四个DmrA结构域的融合物。这些使用单一crRNA的与DmrC-VPR的融合物的试验显示了三个内源基因启动子中的两个的激活(HBB和NPY1R；图1E)，使用更多的DmrA结构域观察到效果提高，最大水平达到用直接dLbCpf1-VPR融合物观察到的水平的大约一半。这种最大激活水平取决于A/C异二聚体药物的存在(图1E)，证明这种系统是药物可诱导的。

令人惊讶的是，这些dLbCpf1融合物与DmrC-p65一起可以使用单一crRNA强健地激活来自所有三种目标基因启动子的转录(图1E)，考虑到使用相同的crRNA用直接dLbCpf1-p65融合物没有观察到激活，这是出乎意料的发现(图1B)。对于AR启动子，与缺乏DmrC-VPR的作用相比，DmrC-p65可以激活转录达～25倍。对于HBB和NPY1R启动子，使用DmrC-p65观察到的激活水平稍微低于(分别为～50％和～30％)用DmrC-VPR获得的激活水平，但在绝对值上仍然是强健的(～20倍和～10倍激活)。DmrC-p65融合物的最大激活再一次取决于A/C异二聚体药物的存在。合起来，这些发现证明，对于药物可诱导的dLbCpf1激活子平台，p65可以提供对于VPR的重要的替代。

实施例2.基于dLbCpf1的激活子对内源人类基因的多重和协同的调节

Cpf1核酸酶相对于Cas9核酸酶的主要优点是能够更容易地表达超过一个指导RNA用于多重应用。早先的工作已经证明，由U6启动子驱动的单一转录产物中编码的多种crRNA可以被Cpf1自身加工成单个crRNA(图2A)，允许诱变基因组编辑事件的多重诱导⁴⁹。我们试验我们是否可以使用基于dLbCpf1的系统来使用三种crRNA激活三个不同的内源人类基因，所述crRNA各自都已被证明使用基于dLbCpf1的激活子时是有活性的，并且都在单一转录产物上编码(图2B)。这些多重crRNA转录产物的试验显示，可以与dLbCpf1-VPR直接融合物、与dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-VPR融合物、以及与dLbCpf1-DmrA(×4)和DmrC-p65融合物一起使用，来介导人类HEK293细胞中多个内源基因启动子的转录激活(图2C)。使用多重crRNA观察到的激活量级稍微低于(～18％至55％)用单一crRNA表达观察到的那些。这些差异的一种可能的解释可能是，由于在表达多重转录产物的细胞中存在推测起来三倍以上的水平的crRNA，对于结合dLbCpf1融合蛋白有更大的竞争。尽管如此，这些结果证明，在更大的多重转录产物中编码的多达三种crRNA可以用于利用基于dLbCpf1的激活子激活多个基因目标的转录。

为了将我们的发现扩展到另一人类细胞系，我们还在人类U2OS细胞中试验直接VPR激活子融合物和药物调节的VPR和p65激活子，使用MST crRNA和单一crRNA靶向相同的基因(HBB、AR和NYP1R)(图2D)。我们观察到HBB和NPY1R是高度上调的，DmrC-p65的HBB激活甚至大于HEK293中的。我们没有观察到AR基因的激活，但这可能因为它的基线表达已经在U2OS细胞中高度提高了(基础的定量RT-PCR Ct值～28)。单一表达的或MST中表达的crRNA的效力方面的相对差异类似于我们在HEK293中观察到的。

我们还设法确定从单一构建体表达的多种crRNA在相同的细胞中是否是实际上有活性的。由于我们的实验在用表达载体瞬时转染的细胞群体上进行，形式上可能的是，上文中我们观察到的多重基因激活是由于不同crRNA在转染的细胞群体内的不同细胞中有活性。为了排除这种可能性，我们认为如果针对同一基因启动子内的位点设计的多种crRNA从单一细胞内的同一转录产物表达，这可能引起来自目标基因启动子的转录方面的协同提高(图2E)(协同激活被定义为大于作用于同一启动子的两个以上的激活子的加成效果²)。使用VPR与dLbCpf1的直接融合物，对于我们检查的三个内源基因启动子中的两个(HBB和AR；图2F)，使用在单一转录产物中表达的三种crRNA，我们观察到协同激活。对于第三个基因启动子(NPY1R)，使用从同一转录产物表达的三种crRNA，我们没有观察到协同激活，但是当它们作为同时导入的独立的RNA来表达时在对照实验中确实观察到协同作用(图2F)。使用从同一转录产物表达的、或从独立的转录产物表达的三种crRNA，在三个基因的任何一个中，使用p65与dLbCpf1的直接融合物我们也没有观察到协同激活(图2F)。使用药物可诱导的dLbCpf1和VPR激活子系统，在HBB和AR启动子上我们再一次观察到协同作用，但在NPY1R启动子上仅有使用独立表达的转录产物时观察到(图2G)。使用药物可诱导的LbCpf1和p65系统观察到类似的结果模式(图2G)。重要的是，在HBB和AR基因上使用p65激活结构域观察到的协同激活水平，与使用VPR激活子进行的可比较实验相比再一次是更高的(图2G)。结合起来，我们断定，多个活性crRNA可以在同一细胞中从单一转录产物表达，尽管与从多个独立的表达载体表达它们相比活性稍低。

另外，我们评估了添加和撤销A/C异二聚体的激活子作用的动力学。我们发现，在添加药物之后～25到35小时观察到HBB和AR基因的最大激活(图2H)，在撤销药物之后～35到45小时发生了激活的基因表达向基线的返回(图2I)。我们预想，药物可诱导性可以容易地扩展到其他同源基因，我们已经成功地使用这些相同的策略来调节和调整基于dSpCas9的激活子。

序列

名称	Addgene编号#	说明
			MMW1578	104563	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA
BPK1169		CAG-DmrC-NLS-FLAG-P65
			MMW948	104565	CAG-DmrC-NLS-FLAG-VPR
JG1202		CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-P65
			JG1211	104567	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-VPR
JG674	104568	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X1)
			JG676	104569	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X2)
JG693	104570	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X3)
			YET1000	104571	CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X4)
BPK3082	78742	U6-LbCpf1-crRNA-BsmBI盒

1.MMW1578:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA

人类密码子优化的dLbCpf1：粗体，NLS：斜体，3xHA：小写字母

2.BPK1169:CAG-DmrC-NLS-FLAG-P65

DmrC:粗体,NLS-Flag:斜体,P65:小写字母

3.MMW948:CAG-DmrC-NLS-FLAG-VPR

DmrC:粗体,NLS-Flag:斜体,VPR:小写字母

4.JG1202:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-P65

人类密码子优化的dLbCpf1：粗体，NLS：斜体，3xHA：小写字母,P65：小写字母和粗体

5.JG1211:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-VPR

人类密码子优化的dLbCpf1：粗体，NLS：斜体，3xHA：小写字母,VPR：小写字母和粗体

6.JG674:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X1)

人类密码子优化的dLbCpf1：粗体，NLS：斜体，3xHA：小写字母，DmrA：小写字母和粗体

7.JG676:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X2)

8.JG693:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X3)

9.YET1000:CAG-人类dLbCpf1(D832A)-NLS-3xHA-DmrA(X4)

10.BPK3082:U6-Lb-crRNA-BsmBI盒

U6启动子：粗体，Lb crRNA：斜体，BsmBI位点：小写字母，U6终止子：斜体和粗体

11.图2b_序列

hU6启动子：粗体，Lb crRNA直接重复：斜体，crRNA1_HBB间隔子序列：小写字母，crRNA3_AR间隔子序列：小写字母和粗体,crRNA1_NPY1R间隔子序列：小写字母、粗体和斜体，终止子：粗体和斜体

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其他实施方案

要理解的是虽然已经连同其详细说明一起描述了本发明，以上的描述意图说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由附随的权利要求的范围所定义。其他方面、优点和改变在所附权利要求的范围之内。

Claims

1.一种融合蛋白，其包含与至少一个激活结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006蛋白Cpf1(dLbCpf1)，优选地其中所述激活结构域是包含四个拷贝的VP16、人类NF-KB p65激活结构域和Epstein-Barr病毒R反式激活子(Rta)的合成的VPR激活子。

2.一种融合蛋白，其包含与条件性二聚化结构域融合的无催化活性的毛螺旋菌科细菌ND2006 Cpf1(dLbCpf1)，并具有任选的间插接头。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述条件性二聚化结构域是DmrA或DmrC。

4.一种组合物，其包含根据权利要求2所述的融合蛋白和第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的至少一个激活结构域，在每个激活结构域和/或第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中(i)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrA，所述第二条件性二聚化结构域是DmrC，或(ii)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrC，所述第二条件性二聚化结构域是DmrA。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述激活结构域是VP64、Rta、NF-κB p65或VPR。

7.一种核酸，其编码根据权利要求1至3任一项所述的融合蛋白。

8.一种试剂盒，其包含编码权利要求2所述的融合蛋白以及第二融合蛋白的核酸，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域，在激活结构域和第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中(i)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrA，所述第二条件性二聚化结构域是DmrC，或(ii)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrC，所述第二条件性二聚化结构域是DmrA。

10.一种细胞，其表达根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白。

11.一种细胞，其表达根据权利要求2所述的融合蛋白和第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中(i)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrA，所述第二条件性二聚化结构域是DmrC，或(ii)权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化是DmrC，所述第二条件性二聚化结构域是DmrA。

13.一种提高细胞中目标基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞接触、或在所述细胞中表达以下中的一种或多种：

(i)权利要求1所述的融合蛋白，和将所述融合蛋白导向所述目标基因的调节区的至少一种crRNA；

(ii)权利要求2所述的融合蛋白；和包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域的第二融合蛋白，在激活结构域和第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚；以及将所述融合蛋白导向所述目标基因的调节区的至少一种crRNA。

14.一种提高细胞中多个目标基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞接触、或在所述细胞中表达以下中的一种或多种：

(i)权利要求1所述的融合蛋白，和编码多种crRNA的至少一种核酸，所述多种crRNA各自将所述融合蛋白导向所述目标基因之一的调节区；

(ii)权利要求2所述的融合蛋白；和包含与第二条件性二聚化结构域融合的激活结构域的第二融合蛋白，在激活结构域和第二二聚化结构域之间具有任选的间插接头，所述第二条件性二聚化结构域在二聚剂的存在下与权利要求2所述的融合蛋白中的条件性二聚化进行二聚；以及编码多种crRNA的至少一种核酸，所述多种crRNA各自将所述融合蛋白导向所述目标基因之一的调节区。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。

17.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述调节区是启动子区。