CN110734899A

CN110734899A - 一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110734899A
Application number: CN201911056382.9A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 段培枫; 张佳宁; 张显; 杨套伟; 徐美娟; 邵明龙; 刘雨; 王紫薇; 陈妍; 陈奇
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110734899B; US11203742B2; US20210130797A1

Abstract

本发明涉及一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明所述突变体是在肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上，进行定点突变实现蔗糖磷酸化酶酶活的提高的，将突变体在谷氨酸棒杆菌中表达，并用作全细胞催化剂生产2‑O‑α‑D‑甘油葡糖苷，在5L发酵罐水平，实现短时间内高效生产大量的2‑O‑α‑D‑甘油葡糖苷，这有利于扩大蔗糖磷酸化酶生产2‑O‑α‑D‑甘油葡糖苷工业化应用前景，实现大规模工业化应用。

Description

一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7，Sucrose Phosphorylase，Spase)是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体，如以D-果糖为受体，在该酶催化下可生成蔗糖；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质，如以磷酸为受体，可生成1-磷酸葡萄糖和D-果糖。

应用该催化特性，蔗糖磷酸化酶能以果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖为受体，催化合成相应的多一个葡萄糖基团的低聚糖，如2-α-D-葡糖基-D-果糖、1-α-D-葡糖基-D-木糖、2-α-D-葡糖基-L-半乳糖、2-α-D-葡萄糖基-鼠李糖等；修饰和改造含有醇羟基、酚羟基及羧基的化合物，如蔗糖磷酸化酶能以甘油为受体，催化蔗糖合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，极具工业化价值。

蔗糖磷酸化酶的酶活相对比较低，限制了蔗糖磷酸化酶生产2-O-α-D-甘油葡糖苷在工业中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用。本发明所述突变体酶活高，底物转化率高，具有很高的工业应用潜力。

本发明提供了一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的重组表达载体。

本发明还提供了表达上述技术方案所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因工程菌。

优选的是，所述基因工程菌的宿主菌包括谷氨酸棒杆菌。

本发明还提供了上述技术方案所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的基础上，将编码第138位赖氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因，将所述基因连到表达载体得到重组表达载体，重组表达载体转化到宿主菌中，得到基因工程菌。

优选的是，第138位赖氨酸的密码子突变用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的F-primer和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的R-primer。

本发明还提供了上述技术方案所述突变体或上述技术方案所述基因或上述技术方案所述重组表达载体或上述技术方案所述基因工程菌或上述技术方案所述构建方法得到的基因工程菌在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

优选的是，所述应用包括提高2-O-α-D-甘油葡糖苷、低聚糖、α-熊果苷或咖啡酸葡萄糖苷的合成产量。

本发明提供了一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体。本发明所述突变体是在肠膜明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上，进行定点突变实现蔗糖磷酸化酶酶活的提高的，酶活的提高有利于扩大蔗糖磷酸化酶生产2-O-α-D-甘油葡糖苷工业化应用前景，实现大规模工业化应用。试验结果表明，本发明在天然蔗糖磷酸化酶的基础上，通过定点突变生物技术改造蔗糖磷酸化酶分子结构，获得的突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高58％，并且通过全细胞转化可以得到280g/L的2-O-α-D-甘油葡糖苷，底物转化率可以达到91％；且本发明表明138位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

附图说明

图1为本发明提供的重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C在底物浓度420g/L，pH7.0，温度35℃下，转化20h的底物蔗糖和产物的情况图。

具体实施方式

本发明提供了一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明所述突变体是在如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基础上，将138位的赖氨酸突变成半胱氨酸获得的。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的重组表达载体。在本发明中，所述表达载体优选包括pXMJ-19质粒。

本发明还提供了表达上述技术方案所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因工程菌。在本发明中，所述基因工程菌的宿主菌包括谷氨酸棒杆菌。

在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的基础上，将编码第138位赖氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因，将所述基因连到表达载体得到重组表达载体，重组表达载体转化到宿主菌中，得到基因工程菌。在本发明中，当所述表达载体使用pXMJ-19质粒时，得到的重组表达载体命名为pXMJ-19-K138C，当所述宿主菌为C.glutamicum感受态细胞ATCC 13032时，得到的基因工程菌具体命名为C.g ATCC13032/pXMJ-19-K138C。在本发明中，第138位赖氨酸的密码子突变用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的F-primer和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的R-primer。

本发明还提供了上述技术方案所述突变体或上述技术方案所述基因或上述技术方案所述重组表达载体或上述技术方案所述基因工程菌或上述技术方案所述构建方法得到的基因工程菌在食品、保健品或化妆品领域中的应用。在本发明中，所述食品中的应用也包括食品添加剂领域。本发明所述突变体能够用于制备具有美白作用的化妆品及改变食品风味的食品添加剂。在本发明中，所述应用优选包括提高2-O-α-D-甘油葡糖苷、低聚糖、α-熊果苷或咖啡酸葡萄糖苷的合成产量。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

下述实施例中涉及的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032购自北纳生物；下述实施例中涉及的pXMJ-19质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司；下述实施例中涉及的蔗糖、甘油均购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基(LB平板)：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、2％琼脂粉(v/v)。

BHI培养基(g/L)：蛋白胨10，脱水小牛脑浸粉12.5，脱水牛心浸粉5，氯化钠5，葡萄糖2，磷酸氢二钠2.5，pH7.2。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

酶活定义为：每1min生成1μmol的2-O-α-D-甘油葡糖苷所需的酶量为1个酶活力单位U；

蔗糖磷酸化酶酶活的测定

将粗酶液用0.2μm的滤膜过滤处理后通过Ni-NTA亲和层析，利用咪唑进行洗脱获得纯化后的酶；反应体系包含200mmol/L蔗糖、400mmol/L甘油、50mmol/LpH 7.0的MES缓冲液、100μL纯酶液，35℃水浴反应20min，沸水浴10min终止反应；使用HPLC法检测酶活；

HPLC方法：采用HPLC示差法测定底物与产物浓度；其中，色谱条件：色谱柱：AminexHPX-87C(300×7.8mm)；流动相：超纯水；检测器：RID Detector，柱温：80℃，进样量：10μL，流速：0.6mL/min。

实施例1

含蔗糖磷酸化酶突变体的重组载体的构建

具体步骤如下：

(1)K138C突变体的获得：以SEQ ID NO:4所示核苷酸序列为模板，F-primer 1(序列如SEQ ID NO:5所示)、R-primer 1(序列如SEQ ID NO:6所示)为引物，进行PCR即得到SEQID NO:3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pXMJ-19分别用BamH I、Ecol I双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。测序工作由上海生工完成。

实施例2

产蔗糖磷酸化酶突变体重组谷氨酸棒杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pXMJ-19-K138C化学法转化入E.coli感受态细胞，具体方法如下：

转化实验所需溶液如下(g/L)：

LB培养基：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10。

50％甘油，0.1M CaCl，115℃湿热灭菌。

(1)接种大肠杆菌JM109或者大肠杆菌BL21(DE3)于50mL新鲜LB培养液中37℃，220r/min过夜培养。

(2)取过夜培养物1mL接种到100mL新鲜LB培养基中37℃，220r/min振荡培养。

(3)培养1h后开始用分光光度计检测培养液的0D₆₀₀值，每隔20min左右检测一次，直到0D₆₀₀值达到0.6时为止(约需要2h)。

(4)将培养液等份35mL分装于50mL的离心管中，并放置在冰上预冷约10min。

(5)4℃，1000g离心5min，完全弃去上清。

(6)向50mL的离心管中加入2mL预冷的0.1M氯化钙溶液，缓慢吹打均匀冰上静置15min，重复操作两次。

(7)随后加入3.2mL 0.1M氯化钙溶液和1.6mL50％甘油后分装于1.5mL的离心管中，每支离心管分装120μL。

大肠杆菌感受态化学转化法：在120μL感受态细胞中加入5μL重组质粒，混匀后冰上放置半小时，然后42℃准确热击90s，冰上冷置5min后加入800μLLB培养基，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布氯霉素抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌E.coli BL21/pXMJ-19-K138C。

之后接种重组菌E.coli BL21/pXMJ-19-K138C，培养后抽提重组质粒pXMJ-19-K138C，通过电转仪，1800V，电击5ms，将提取的重组质粒pXMJ-19-K138C电转谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞，再加入BHI培养基培养后，取菌液涂布氯霉素抗性平板，30℃培养18h，挑取阳性转化子验证。最终得到重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C。

实施例3

重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C蔗糖磷酸化酶高效表达及酶活测定

将实施例2构建的重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C与表达未突变的酶的原始菌株C.gATCC 13032/pXMJ-19-SP分别接种于10mL含氯霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养16-20h，次日按1％的接种量转接于培养基中诱导表达，30℃培养14h，取培养液于4℃、10000r/min离心10min，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，然后采用Ni柱纯化得到纯酶液，用于酶活力的测定。对纯酶酶学性质进行探究，蔗糖磷酸化酶突变菌株的最适反应温度是35℃，最适反应pH是7.0。

结果表明重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C表达的蔗糖磷酸化酶的比酶活为10.83U/mg，作为对照的原始菌株C.gATCC 13032/pXMJ-19-SP的比酶活为6.85U/mg，突变菌株比原始菌株比酶活提高了58％。

通过诱导得到的C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C菌体进行全细胞转化生产2-O-α-D-甘油葡糖苷，在1L的转化体系中，把菌体悬浮于MES缓冲液中，菌体的OD₆₀₀为50，控制反应的pH为7.0，温度35℃下，发酵罐转速为200rpm，添加底物蔗糖420g、甘油300g、曲拉通1mL，转化20h可以生产280g/L的2-O-α-D-甘油葡糖苷，转化率达91％(结果如图1所示，图1为重组菌C.gATCC 13032/pXMJ-19-K138C在底物浓度420g/L，pH7.0，温度35℃下，转化20h的底物蔗糖和产物的情况，最终生产2-O-α-D-甘油葡糖苷280g/L，转化率达91％)，相同条件下，比野生型菌株C.gATCC 13032/pXMJ-19-SP全细胞转化的转化率提高了近26％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Ile Gln Asn Lys Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Asn Leu Lys Asp Val Arg Lys Val Leu Lys Glu Asp Ile Gly

20 25 30

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asp Tyr Thr Arg Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Ser Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Val Met Tyr Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Lys Asn His Asp Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Phe Phe Ile

100 105 110

Arg Trp Glu Lys Phe Trp Ala Lys Ala Gly Glu Asn Arg Pro Thr Gln

115 120 125

Ala Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Cys Asp Lys Ala Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe

145 150 155 160

Gly Asp Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu

165 170 175

Phe Ile Lys Thr Thr Leu Glu Asp Met Val Lys His Gly Ala Asn Leu

180 185 190

Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Asn

195 200 205

Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg

210 215 220

Glu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu

225 230 235 240

His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr

245 250 255

Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys

260 265 270

Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp

290 295 300

Val Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Tyr Ala Ser Glu Glu Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Val Gly Ala Asn Val Lys Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Ser Tyr Asn Asn

325 330 335

Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn

340 345 350

Asp Asp Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Ile Phe Gln Val Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp

370 375 380

Ile Glu Leu Leu Glu Ser Ser Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His

385 390 395 400

Tyr Tyr Ser Val Asp Glu Val Lys Glu Glu Val Lys Arg Pro Val Val

405 410 415

Ala Lys Leu Leu Lys Leu Leu Ser Trp Arg Asn Asn Phe Ala Ala Phe

420 425 430

Asp Leu Asp Gly Ser Ile Asp Val Glu Thr Pro Ser Asp Thr Thr Ile

435 440 445

Lys Ile Thr Arg Lys Asp Lys Ser Gly Glu Asn Val Ala Val Leu Val

450 455 460

Ala Asn Ala Ala Asp Lys Thr Phe Thr Ile Thr Ala Asn Gly Glu Glu

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Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ala Asp Lys Gln Gln Leu

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<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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145 150 155 160

Gly Asp Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu

165 170 175

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180 185 190

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Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg

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His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr

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260 265 270

Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ala Asp Lys Gln Gln Leu

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<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaaattc aaaataaagc aatgctcatc acatacgctg attcattggg taaaaacttg 60

aaggatgttc gcaaagtctt gaaagaagat attggtgatg caattggtgg tgttcacttg 120

ttgccatttt tcccatcaac gggagaccgc ggttttgcac cttctgatta cacacgtgtt 180

gattcagcat ttggtgattg gagtgatgta gaagcattag gtgaagaata ttacttgatg 240

tttgatttca tgattaacca tatttcacgt gaatctgtta tgtatcaaga tttcaagaag 300

aatcatgatg aatcaaaata taaggatttc ttcattcgct gggaaaagtt ctgggccaag 360

gctggtgaaa accgtccaac acaagccgat gttgacttga tttacaagcg taaggattgt 420

gcaccaactc aagaaattac ttttgatgat ggtacaactg aaaacttgtg gaacacattt 480

ggtgatgaac aaattgatat cgatgtaaac tcagctatcg ctaaagaatt tatcaagaca 540

acgcttgaag acatggtgaa gcatggagct aacttgattc gtttggatgc ctttgcatac 600

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cactattcaa ttcctaagaa gatcaatgat catggttact tcacatatga ttttgctttg 780

ccaatgacga cactttatac attgtattca ggtaaaacaa atcaattggc taaatggttg 840

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cgtatcttcc aagtgttcgc tcctggtatt ccacaaatct actatgttgg tttgttggcc 1140

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<210> 4

<211> 1478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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aaggatgttc gcaaagtctt gaaagaagat attggtgatg caattggtgg tgttcacttg 120

ttgccatttt tcccatcaac gggagaccgc ggttttgcac cttctgatta cacacgtgtt 180

gattcagcat ttggtgattg gagtgatgta gaagcattag gtgaagaata ttacttgatg 240

tttgatttca tgattaacca tatttcacgt gaatctgtta tgtatcaaga tttcaagaag 300

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actactcagt tgatgaagtt aaggaagaag ttaagcgccc agttgttgct aagttgttga 1260

agcttttgtc atggcgtaac aactttgctg catttgattt ggacggatca attgacgttg 1320

aaacaccatc tgatacaact atcaagatta ctcgtaagga taagtctggt gaaaatgttg 1380

cagtcttggt tgccaacgct gccgataaga cattcacaat cactgcaaat ggtgaagaaa 1440

tcttagccaa cacagaagct gataagcaac aattgtaa 1478

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atttacaagc gttgtgataa ggcaccaact caagaaa 37

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtgcctta tcacaacgct tgtaaatcaa gtcaa 35

Claims

1.一种酶活提高的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

3.含权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.表达权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌包括谷氨酸棒杆菌。

6.权利要求4所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，第138位赖氨酸的密码子突变用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的F-primer和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的R-primer。

8.权利要求1所述突变体或权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述基因工程菌或权利要求6～7任一项所述构建方法得到的基因工程菌在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高2-O-α-D-甘油葡糖苷、低聚糖、α-熊果苷或咖啡酸葡萄糖苷的合成产量。