CN110699457B

CN110699457B - 检测肺癌的引物组和试剂盒

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Publication number: CN110699457B
Application number: CN201911046807.8A
Authority: CN
Inventors: 任建卫; 郭玮; 刘俊; 杨敏
Original assignee: Shenzhen Ritzcon Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Ritzcon Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN110699457A

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测肺癌的引物组和试剂盒。所述引物组包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一外引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第一内引物对；如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第二外引物对，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二内引物对；如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的第三外引物对，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的第三内引物对；如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的第四外引物对，如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的第四内引物对。

Description

检测肺癌的引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测肺癌的引物组和试剂盒。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，2018年全世界新发肺癌210万例，占所有新发肿瘤病例的11.6％，死亡180万例，占所有肿瘤死亡病例的18.4％，均排在第一位。肺癌也是我国主要的的恶性肿瘤之一，由于人口基数较大，我国肺癌的新发病例和死亡病例数远超其他国家，肺癌的疾病负担一直以来都十分为沉重。

早期肺癌生存率远远高于晚期肺癌，研究发现一期肺癌的一年存活率可达85％，是四期肺癌患者的五倍之多，因此降低肺癌患者死亡率的关键在于早期诊断和早期治疗。目前的肺癌检测技术中，传统的侵入性(invasive)方法，例如组织活检，正逐渐被先进的非侵入性(non-invasive)方法所取代，其中，基于生物标志物分子检测的液体活检技术在肺癌早期诊断中拥有广阔的应用前景。

肿瘤蛋白质生物标志物如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1，KRT19)等已广泛用于肺癌的筛查诊断、疗效评估、术后检测、预后判断等方面。这些标志物的实用性在临床实践中已经得到了充分的证实，然而由于抗原抗体反应中会出现无法避免的交叉反应现象，因此蛋白分子检测在特异性、灵敏性方面相较于核酸分子检测具有很大的局限性。相比于蛋白分子，核酸分子的一大优势就是可以通过PCR技术进行扩增，并通过测序技术鉴定序列，从而能够显著提高灵敏性以及特异性。

目前用于肺癌早期诊断的核酸分子标志物主要为血浆内循环的或外泌体包含的肿瘤DNA(ctDNA)和微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)。DNA作为肿瘤标志物，主要通过检测甲基化、核苷酸突变或基因融合位点进行癌症诊断。甲基化步骤繁琐，技术壁垒高，准确性很难得到保证。而基因突变或融合随机性大，受影响区域的定位比较困难。例如即使在肺癌中两个高频基因间融合，KIF5B-RET，其融合位点在基因组中的定位也是不同的。另外，目前所检测到的DNA肿瘤标志物变化，发生频率较低，例如在一项研究报告中，ALK融合基因阳性率仅为3.43％，而另一项报告中，EML4-ALK基因融合检出率为7.3％。由此可见，基于DNA分子的检测手段的覆盖率是比较低的。

miRNA作为肿瘤标志物被广泛应用于液体活检的开发当中，然而，作为一类长度仅仅约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过序列判断其精准性、特异性拥有一定难度。Abcam曾经开发了一个基于miRNA检测的肺癌诊断试剂盒(产品号ab04060)却停止推销，大概就是精准性、特异性的原因。另外，目前识别出miRNA数目有限，仅有2300个左右，也大大限制了miRNA在癌症诊断中的应用潜力。mRNA、LncRNA等长链RNA的表达在肿瘤细胞中会发生很大的变化，但目前在液体活检的应用还很少见到报道，对RNA降解的顾虑是主要原因。然而，研究表明非低温长期保存的样本中mRNA片段仍然能够有效提取及定量。另外，相较于目前识别出的数目有限的miRNA，mRNA和LncRNA的变化能够更加准确地反应患者的生理状态，因此，血浆长链RNA相关片段在癌症诊断中的应用日益受到关注。

另外，现有的基于定量分析的肺癌分子诊断方法未能明确区分慢阻肺(COPD)和肺癌的病理变化，例如临床普遍采用的肺癌标志物分子CA125实际上在COPD条件下也有上调，因此，如何区分COPD和肺癌也是肺癌早期诊断中的一大挑战。

因此，现有技术有待改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测肺癌的引物组和试剂盒，旨在解决现有肺癌检测的特异性和灵敏度低，导致检测效果不理想的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种检测肺癌的引物组，所述引物组包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一外引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第一内引物对；如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第二外引物对，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二内引物对；如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的第三外引物对，如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示的第三内引物对；如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的第四外引物对，如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的第四内引物对。

本发明另一方面提供一种检测肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测肺癌反引物组，所述引物组包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一外引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第一内引物对；如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第二外引物对，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二内引物对；如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的第三外引物对，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的第三内引物对；如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的第四外引物对，如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的第四内引物对。

本发明提供的引物组和试剂盒，可以基于实时荧光定量PCR技术通过检测血浆RNA标志物组合辅助诊断早期肺癌。本发明的引物组和试剂盒对肺癌的检测特异性强，灵敏度高，能够克服现有肺癌分子诊断中存在的局限性，用上述引物组进行实时荧光定量PCR可以灵敏、特异地检测血浆微量RNA片段，高效判断肺癌的发生，不仅用于区分肺癌患者与健康者，而且能够在诊断中排除COPD的干扰，相较于目前临床上的辅助诊断方法(如蛋白分子标志物)拥有更高的特异性、灵敏性，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中不同试剂盒提取血浆RNA的效果图；

图2为本发明实施例中不同巢式引物的RT-PCR比较结果图；

图3为本发明实施例中预扩增中引物种类数量对PCR效率的影响结果图；

图4为本发明实施例中预扩增(5、10、15、20个循环)对应qPCR的灵敏度结果图；

图5为本发明实施例中无预扩增对qPCR的灵敏度影响的结果图；

图6为本发明实施例中MALAT1分子标志物单一指标检测结果图；

图7为本发明实施例中XIST1分子标志物单一指标检测结果图；

图8为本发明实施例中MMP1分子标志物单一指标检测结果图；

图9为本发明实施例中CP分子标志物单一指标检测结果图；

图10为本发明实施例中MALAT1/XIST1/MMP1/CP四分子标志物组合联合诊断结果图；A为肺癌与健康人组统计结果图，B为肺癌与COPD+健康组的统计结果图，C为最终推导结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要理解的是，术语“第一”、“第二”、“第三”等等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

MALAT-1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，Malat1)缺乏有意义的开放性编码框，在体外无法翻译蛋白质，属长链非编码RNA(lncRNA)。MALAT-1是第一个报道与肺癌疾病相关联的长链非编码RNA。

X染色体失活特异转录因子(X-inactive specific transcript，XIST)是位于X染色体失活中心的XIST基因的转录产物，作为一种致癌基因在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用，高表达的XIST促进NSCLC(non-small cell lung cancer)非小细胞肺癌的癌细胞的发生发展。

MMP1(matrix metalloproteinase 1)是定位于11q22.3号染色体的MMP基质金属蛋白酶基因簇的一部分。参与细胞外基质的分解，并通过分解I、II、III型间质胶原在肿瘤转移中发挥重要作用，能促进NSCLC细胞的迁移。

Ceruloplasmin(CP)即铜蓝蛋白或铜氧化酶，CP的突变会导致无浆细胞血症、铁的积累和组织损伤，并与糖尿病和神经系统异常有关，可作为NSCLC根治术后肿瘤复发风险评估的预后因子。

蛋白分子标志物检测中由于交叉反应而引起的特异性、灵敏性偏低，DNA甲基化、核苷酸突变或基因融合位点检测中存在的覆盖率不高，miRNA肿瘤标志物选择较少以及精准性、特异性不能充分保证。因此，本发明实施例中，以上四基因均为肺癌相关基因，利用其作为肺癌液体活检肿瘤标志物具有坚实的理论基础，通过检测血浆中肺癌相关mRNA和LncRNA水平的变化，总结出一套MALAT1/XIST1/MMP1/CP四分子标志物组合，以此设计引物组，能够有效检测到健康组与肺癌组、COPD组与肺癌组的区别。

因血浆RNA产量低微，逆转录合成的cDNA也及其微量，不易通过直接qPCR探测到目标模板，而且非特异性PCR背景会增加，因此本实施例采用增强灵敏度及特异性的巢式PCR(nested PCR)方法检测目标基因表达量。本实施例对每个目标基因设计两对引物(即用于预扩增的外引物对：上游F1和下游R1；用于qPCR扩增的内引物对：上游F2和下游R2)，首先设计一对用于qPCR的内引物，然后根据内引物的定位设计一对用于预扩增的外引物。

引物设计要求：内引物对即qPCR引物的设计有一下要求，1)引物长度22-24碱基，GC含量45％-55％；2)PCR产物100-200bp；3)在基因组DNA横跨至少一个内含子；3)能够覆盖目标基因所有已知的转录变异体(trascription variants)；4)设计引物区域的序列不和其它基因重合。外引物对的设计要求：1)引物长度19-21碱基，GC含量45％-55％；2)PCR产物250-300bp，包含内引物扩增区域。

最终的序列如下：

针对MALAT-1基因(NCBI参考号：NR_002819.4)

第一外引物对，用于预扩增：

SEQ ID NO.1：5’-GCATCCGAAGGAATGCTTGA-3’(上游)

SEQ ID NO.2：5’-GATCCAAGCTACTGGCTGC-3’(下游)

第一内引物对，用于qPCR扩增：

SEQ ID NO.3：5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3’(上游)

SEQ ID NO.4：5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGC-3’(下游)

针对XIST基因(NCBI参考号：NR_001564.2)

第二外引物对，用于预扩增：

SEQ ID NO.5：5’-CCTTTCGCATTGCTTCTGAG-3’(上游)

SEQ ID NO.6：5’-GTGGGCAAGAATGGTTCTTG-3’(下游)

第二内引物对，用于qPCR扩增：

SEQ ID NO.7：5’-TCAGCCCATCAGTCCAAGATC-3’(上游)

SEQ ID NO.8：5’-CCTAGTTCAGGCCTGCTTTTCAT-3’(下游)

针对MMP1基因(NCBI参考号：NM_001145938.2)

第三外引物对，用于预扩增：

SEQ ID NO.9：5’-GAAGCATATCGATGCTGCTC-3’(上游)

SEQ ID NO.10：5’-CTTTGGACTCACACCATGTG-3’(下游)

第三内引物对，用于qPCR扩增：

SEQ ID NO.11：5’-GATCTATGGATCCAGGTTATCCC-3’(上游)

SEQ ID NO.12：5’-GCTATTAGCTTTCTGGAGAGTC-3’(下游)

针对CP基因(NCBI参考号：NM_000096.4)

第四外引物对，用于预扩增：

SEQ ID NO.13：5’-AGGTCCACAACTTCATGCAG-3’(上游)

SEQ ID NO.14：5’-CCACTGTAGAGGTCCTTAAC-3’(下游)

第四内引物对，用于qPCR扩增：

SEQ ID NO.15：5’-CCACAAGGCCCTACTCAATACAT-3’(上游)

SEQ ID NO.16：5’-GCCCATGGAATACAAGCAGAATC-3’(下游)

以及在一个实施例中，该引物组包括针对内参基因β-actin基因(NCBI参考号：NM_001101.5)设计的如下第五外引物对和第五内引物对。

第五外引物对，用于预扩增：

SEQ ID NO.17：5’-GTACGCCAACACAGTGCTG-3’(上游)

SEQ ID NO.18：5’-GCCATGCCAATCTCATCTTG-3’(下游)

第五内引物对，用于qPCR扩增：

SEQ ID NO.19：5’-AGGATGCAGAAGGAGATCAC-3’(上游)

SEQ ID NO.20：5’-TGTAACGCAACTAAGTCATAG-3’(下游)。

另一方面，本发明实施例还提供了一种检测肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测肺癌反引物组，所述引物组包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一外引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第一内引物对；如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第二外引物对，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二内引物对；如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的第三外引物对，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的第三内引物对；如SEQID NO.13和SEQ ID NO.14所示的第四外引物对，如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的第四内引物对。

进一步地，所述试剂盒中的该引物组还包括针对内参基因β-actin基因的第五外引物对和第五内引物对。

进一步地，所述试剂盒包括血浆RNA提取试剂。所述血浆RNA提取试剂选自miRNeasy Serum/Plasma Kit。进一步地，所述试剂盒包括RNA逆转录试剂。所述RNA逆转录试剂选自PrimeScript RT Master Mix，所述RNA逆转录试剂含有随机六聚体引物，利用随机六聚体引物进行逆转录。进一步地，所述试剂盒包括PCR试剂。所述PCR试剂用于巢式PCR扩增，具体地选自

PCR Master Mix和TB Green Taq Mix，分别进行预扩增和qPCR扩增。每一个目标基因的外引物对和内引物对组成一组巢式引物，分别进行预扩增和qPCR扩增。

进一步地，用所述第一外引物对、第二外引物对、第三外引物对和第四外引物对进行扩增时，所述第一外引物对、第二外引物对、第三外引物对和第四外引物对的浓度为0.2um。用所述第一内引物对、第二内引物对、第三内引物对和第四内引物对进行扩增时，所述第一内引物对、第二内引物对、第三内引物对和第四内引物对的浓度为0.2um。

本发明实施例用上述试剂盒对肺癌进行检测，包括五项步骤：血浆RNA提取，利用随机六聚体引物进行逆转录，利用外引物对进行预扩增PCR，利用内引物对进行实时荧光定量PCR(qPCR)，收集数据进行分析。

上述引物对的组合和试剂盒可以作为非侵入性的液体活检手段，基于对血浆中mRNA、LncRNA片段的实时荧光定量分析检测肺癌，相较于目前临床上传统的侵入性方法，例如组织活检，拥有伤害小、技术壁垒低、灵敏性高、特异性好的巨大优势；同时，相较于其他分子检测手段也有明显的优点。

1)相比于肿瘤蛋白质生物标志物，本实施例拥有更高的特异性、灵敏性，因为基于抗原抗体反应的蛋白质生物标志物检测会出现无法避免的交叉反应现象。

2)相比于肿瘤DNA标志物，本实施例操作简便，准确性高，覆盖面广，通用性强。DNA标志物检测主要通过检测甲基化、核苷酸突变或基因融合位点进行癌症诊断，甲基化检测步骤繁琐、技术壁垒高，而基因突变或融合随机性大，某特定病理变化发生频率低，因此检测手段的覆盖率比较低。

3)相比于小RNA标志物，例如miRNA，本实施例精准性、特异性高，候选分子选择范围大。miRNA长度仅仅约为22个核苷酸，通过序列判断其精准性、特异性拥有一定难度。另外，目前识别出miRNA数目有限，仅有2300个左右，也大大限制了miRNA在癌症诊断中的应用潜力。

4)相比于目前肺癌检测手段，本实施例还能明确区分慢阻肺(COPD)和肺癌的病理变化。

mRNA、LncRNA等长链RNA水平变化能够非常准确地反映肿瘤细胞的存在，并且会被释放到血浆中游离存在。在血浆中长链RNA都会根据其序列特征受到不同程度的降解，因此血浆中mRNA、LncRNA的成分组合与组织、细胞中有很大差别，检测到由肿瘤细胞释放的RNA片段非常不易，需要大量的筛选工作。本实施例进行了大量的数据挖掘工作，从科研文章、公开数据库中搜寻、总结出50个在肺癌组织中高表达的mRNA、LncRNA候选标记分子，分别设计引物并在95例血浆RNA中(40例肺癌患者血浆，40例慢阻肺(COPD)患者血浆以及15例健康人血浆)验证，筛选出MALAT1/XIST1/MMP1/CP四分子标志物组合。

在一个实施例中，血浆中DNA比较稳定，而RNA容易降解，因此RNA与DNA水平的相对比例不似组织或细胞中那么高。另外，预扩增极大增强了PCR的灵敏度，因此必须考虑基因组DNA对定量结果的影响。本发明实施例除了通过在引物设计上尽量找到内含子跨越以消除DNA的影响外，也在RNA提取上比较了不同方法，通过不同试剂盒的对比(如图1所示)，确定凯杰公司(Qiagen)的miRNeasy Serum/Plasma Kit(产品号#217184)为提取血浆RNA最佳选择，可以完全去除DNA，保证RNA纯度。

在一个实施例中，对设计的高效引物进行了验证，血浆中RNA会根据序列、二级结构等特征而被不同程度的降解，对于同一条mRNA或LncRNA来说，存留在血浆中的片段的水平也可能会有所区别，因此处于不同区域的引物检测目标RNA分子的效率亦会不同。基于此种考虑，对于血浆水平低微、难以检测的目标基因RNA，本实施例针对每个基因在其不同区域设计几组巢式引物，利用血浆RNA进行RT-PCR比较，如以CP基因为例，设计了四组巢式引物，如图2所示，最终以选出效率最高的一组巢式引物(即SEQ ID NO.13-16)加入到试剂盒中，其他三个目标基因类似，从而选出最佳的巢式引物。同时，也对血浆RNA进行RT-外引物对PCR-内引物对PCR后所得PCR产物进行测序分析，确保血浆游离DNA不会在此高灵敏度PCR条件下影响检测。

血浆RNA提取产量及其低微，以常规RT-qPCR方案定量时，很难检测到，并且受到引物二聚体及非特异性PCR产物影响。血浆提取的RNA样品产量很低，并且OD_260nm/OD_230nm比值偏低(如表1所示)，说明提取产物纯净度较低。因此，本发明在RT-PCR定量检测方案中加入了预扩增步骤，以达到提高检测灵敏性、特异性的目的。同时，也对血浆RNA进行RT-外引物PCR-内引物PCR后所得PCR产物进行测序分析，确保血浆游离DNA不会在此高灵敏度PCR条件下影响检测。

通过加入了预扩增步骤，以达到提高检测灵敏性、特异性的目的；而且本实施例对预扩增反应条件进行了优化，在PCR反应中，引物对的种类加入过多，会降低效率、提高非特异性，然而若每个目标基因单独预扩增，会增加试剂盒成本及工作强度，而本发明实施例中，通过比较了预扩增PCR配制的外引物对种类的条件，如图3所示，在一个PCR反应中可以同时进行5个基因的预扩增。而且对于预扩增的循环数及用于后续反应的稀释倍数也进行了摸索，预扩增后，用Ceruloplasmin(CP)内引物对进行了PCR反应，确定了所得预扩增PCR产物稀释50倍用于实时荧光定量PCR(qPCR)的条件。

预扩增显著提高了qPCR的灵敏度。图4和图5结果显示了预扩增步骤加入前后对qPCR结果的影响。如未有预扩增，qPCR溶解曲线(melting curve)只是显示出非特异性杂带，例如引物二聚体。而增加了预扩增后，随着预扩增循环数(cycle)增加，溶解曲线显示qPCR特异性产物增加，而非特异性杂带逐渐消失，说明预扩增富集了目标基因数量，为qPCR探测提供了条件。图4预扩增结果也显示15个循环是最佳条件，过低不能完全消除非特异性杂带，过高可能会过量增加qPCR的模板量，导致定量过程中误差偏大。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1 血浆RNA提取

本实施例采用凯杰公司(Qiagen)的miRNeasy Serum/Plasma Kit(产品号#217184)提取人的血浆RNA。

1.分离血浆样品。抽取血液后，使用EDTA作为抗凝，避免溶血，并于2小时内2800g离心10min分离血浆，于-80℃超低温冰箱保存。

2.从-80℃超低温冰箱中，取出血浆样本，置于冰上融化。

3.取用50-200ul提取RNA。将血浆RNA与5倍血浆体积的Qiazol裂解液混合，涡旋震荡，直至无明显沉淀，室温孵育5min。

4.在4℃下，12000g下离心10min。吸取上清至新的1.5ml灭菌EP管内。

5.加入一倍血浆体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育2-3min。

6.在4℃下，12000g，离心15min。

7.移取上层水相至新的1.5ml(灭菌)EP管中(以200ul血浆制备，可吸取约600ul上层水相)。

8.加入1.5倍向上层水相体积量的无水乙醇(600ul上清液中加入900ul无水乙醇)，反复吹打混匀。

9.吸取700ul混匀后的液体至RNA分离柱上，在室温下(15-25℃)以10000g的离心力离心柱子15s，弃去下层液体后再空管离心15s。

10.重复步骤10操作，直至把水相-乙醇混合液全部过柱。

11.向上述RNA分离柱中加入700ul RNA洗涤缓冲液I(Buffer RWT)，在室温下(15-25℃)以10000g的离心力离心柱子15s，弃去下层液体后再空管离心15s。

12.向上述RNA分离柱中加入500ul RNA洗涤缓冲液II(Buffer RPE)，在室温下(15-25℃)以大于10000g的离心力离心柱子15s，弃去下层液体后再空管离心15s。

13.向上述RNA分离柱中加入500ul RNA洗涤缓冲液II(Buffer RPE)，在室温下(15-25℃)以10000g的离心力离心柱子15s，弃去下层液体后再空管离心15s。

14.向上述RNA分离柱中加入500ul 80％乙醇，在室温下(15-25℃)以10000g的离心力离心柱子2min，弃去下层液体与收集管。

15.将柱子装到新的2ml收集管，以最大的离心力离心5min，干燥柱内的滤膜，弃去流出液与外层收集管。

16.将柱子放于通风橱内，打开管盖，干燥15min，充分干燥滤膜。

17.将柱子转移至无RNA酶的1.5ml EP管内(试剂盒提供)，加入15ul RNase-freeH2O(确保RNase-free H2O直接加在柱基质上)，室温静置3min，，以12000g离心1min。

18.将装有RNA的离心管置于冰盒上备用，取用1ul使用NanoDrop One超微量紫外分光光度计定量。

用上述方法提取了十三个RNA样品，数据如表1所示。

表1

实施例2 RNA逆转录

本实施例采用宝生物(Takara)公司的PrimeScript RT Master Mix(产品号#DRR036A)利用随机六聚体引物进行逆转录。因血浆RNA产量非常低，并且血浆中多糖分子影响很大，所以分光光度计定量可能并不准确，因此实施例1中提取的全部RNA产物被用于逆转录反应。

逆转录反应体系如下表2，逆转录反应程序如下表3，最终逆转录得到的cDNA放在-20℃冰箱内保存。

表2

成分	体积
		5x PrimeScript RT Master Mix	4ul
血浆RNA	13ul
		RNase-free H2O	3ul
Total	20ul

表3

温度	时间
		37℃	15min
85℃	5sec
		4℃	∞

实施例3 PCR扩增

1巢式引物(nested primers)设计：

血浆RNA产量低微，逆转录合成的cDNA也及其微量，不易通过直接qPCR探测到目标模板，而且非特异性PCR背景增加，因此本实施例采用增强灵敏度及特异性的巢式PCR(nested PCR)方法检测目标基因表达量。本实施例对每个目标基因设计两对引物，首先设计一对用于qPCR的内引物，然后根据内引物的定位设计一对用于预扩增的外引物。最终的引物如SEQ ID NO.1-16所示。

2预扩增PCR：

本实施例采用宝生物(Takara)公司的

PCR Master Mix(产品号#RR300A)进行预扩增PCR。每个反应体系可同时加入五对外引物，亦即进行五个目标基因(MALAT1、XIST1、MMP1、CP、β-actin，共5对)的预扩增PCR。

预扩增PCR反应体系如下表4，预扩增PCR反应程序如下表5：预扩增完成后，将PCR产物稀释50倍，取用1ul用于qPCR。

表4

表5

3、实时荧光定量PCR(qPCR)：

本实施例采用宝生物(Takara)公司的TB Green Taq Mix(产品号#RR420B)进行荧光定量PCR(qPCR)。将上述所得预扩增PCR产物稀释50倍，用于qPCR。

qPCR反应体系如下表6，qPCR反应程序如下表7：每个反应跑两个复孔；最后收集数据，进行分析。

表6

成分	体积
		TB Green Taq Mix	6.25ul
上游引物(F2，10uM)	0.25ul
		下游引物(R2，10uM)	0.25ul
cDNA预扩增产物	1ul
		RNase-free H2O	4.75ul
Total	12.5ul

表7

4、数据分析：

qPCR结束后，首先检查熔解曲线(melting curve)，熔解峰异常者均被定为无信号(No Signal Available，NA)。“无信号”测试孔循环阈值(Cycle threshold，Ct值)均定为40。数据均一化进行校正中以目标基因的Ct减去β-actin Ct得到deltaCt(dCt)，然后利用公式2^dCt计算目标基因的相对表达量，进行统计学分析。单一指标检测结果显示(图6-9所示)：MALAT1/XIST1/MMP1/CP四分子标志物组合中每一个分子标志物都能很好地区分肺癌(NSCLC)和健康人组(Healthy)，AUC除了MMP1(0.875)都超过了0.9，说明灵敏性和特异性都很理想。

MALAT1/XIST1/MMP1/CP四分子标志物组合联合诊断结果表明，使用本实施例的四分子组合可以很好地区分肺癌(NSCLC)与健康人组(Healthy)，也可以区分肺癌(NSCLC)与COPD+健康组(Control)样品(如图10所示)。收集数据后导入软件推导出的方程，当结果高于0.5925时，可怀疑受测者为肺癌病症。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳瑞科生物科技有限公司

<120> 检测肺癌的引物组和试剂盒

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatccgaag gaatgcttga 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatccaagct actggctgc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaagcaaggt ctccccacaa g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtctgtgct agatcaaaag gc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctttcgcat tgcttctgag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgggcaaga atggttcttg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcagcccatc agtccaagat c 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctagttcag gcctgctttt cat 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagcatatc gatgctgctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctttggactc acaccatgtg 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatctatgga tccaggttat ccc 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctattagct ttctggagag tc 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggtccacaa cttcatgcag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccactgtaga ggtccttaac 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccacaaggcc ctactcaata cat 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcccatggaa tacaagcaga atc 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtacgccaac acagtgctg 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gccatgccaa tctcatcttg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggatgcaga aggagatcac 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtaacgcaa ctaagtcata g 21

Claims

1.一种检测MALAT-1、XIST、MMP1和CP四个分子标志物组合在血浆RNA中表达量的引物组在制备诊断早期肺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组由基于巢式PCR检测MALAT-1基因的第一外/内引物对、检测XIST基因的第二外/内引物对、检测MMP1基因的第三外/内引物对和检测CP基因的第四外/内引物对组成；

其中，第一外引物对如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示，第一内引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO .4所示；第二外引物对如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示，第二内引物对如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示；第三外引物对如SEQ ID NO .9和SEQ ID NO .10所示，第三内引物对如SEQ ID NO .11和SEQ ID NO .12所示；第四外引物对如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO .14所示，第四内引物对如SEQ ID NO .15和SEQ ID NO .16所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用所述第一外引物对、第二外引物对、第三外引物对和第四外引物对进行扩增时，所述第一外引物对、第二外引物对、第三外引物对和第四外引物对的浓度为0.2um；和/或，

用所述第一内引物对、第二内引物对、第三内引物对和第四内引物对进行扩增时，所述第一内引物对、第二内引物对、第三内引物对和第四内引物对的浓度为0.2um。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括血浆RNA提取试剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括RNA逆转录试剂。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括PCR试剂。