CN110699320A - 一种人外周血中性粒细胞外泌体及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人外周血中性粒细胞外泌体的提取方法，属于外泌体制备技术领域。本发明的提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体运载的颗粒酶促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌发生，达到治疗胃癌的目的。将本发明提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体作用于胃癌细胞株HGC‑27，发现人外周血中性粒细胞外泌体具有抑制胃癌细胞活性、延缓胃癌发生发展的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体制备技术领域，尤其涉及一种人外周血中性粒细胞外泌体及其提取方法和应用。
背景技术
胃癌(gastric carcinoma，GC)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。胃癌治疗方法很多包括：手术治疗，化疗，靶向治疗和免疫治疗等。胃癌的免疫治疗包括非特异生物反应调节剂如卡介苗、香菇多糖等；细胞因子如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等；以及过继性免疫治疗如淋巴细胞激活后杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等。但是上述治疗方法仍然存在病程长、预后差的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人外周血中性粒细胞外泌体及其提取方法和应用，所述人外周血中性粒细胞外泌体具有显著的抗胃癌肿瘤作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人外周血中性粒细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：
1)用含超离血清的RPMI1640培养人外周血中性粒细胞，取人外周血中性粒细胞培养上清进行差速离心，收集上清液，得到中性粒细胞培养上清；
2)对所述中性粒细胞培养上清进行浓缩，得到的浓缩液转移至30mg/mL蔗糖/D2O密度垫，于4℃条件下，100000g离心80min，收集底部的缓冲垫；
3)用PBS洗涤所述底部的缓冲垫后，对缓冲垫进行超滤离心，收集超滤之后的上层液体，得到人外周血中性粒细胞外泌体。
优选的，步骤1)中所述培养的温度为37℃，时间为48h。
优选的，步骤1)中所述差速离心的程序为：500g离心10min，2000g离心10min，12000g离心30min，收集上清液进行100000g离心80min。
优选的，步骤2)中所述浓缩的方式为超滤浓缩。
优选的，步骤3)中所述超滤离心的温度为4℃，离心力为100000g，离心时间为80min。
优选的，在步骤3)所述收集上清液后，还包括采用滤膜对上清液进行过滤；所述滤膜的孔径为0.22μm。
本发明还提供了上述方案所述提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体。
本发明还提供了上述方案所述人外周血中性粒细胞外泌体在制备治疗胃癌的药物中的应用。
优选的，所述外泌体通过促进胃癌细胞凋亡和/或抑制胃癌细胞活性来治疗胃癌。
本发明的有益效果：本发明提供了一种人外周血中性粒细胞外泌体的提取方法。本发明的提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体运载的颗粒酶促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌发生，达到治疗胃癌的目的。将本发明提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体作用于胃癌细胞株HGC-27，发现人外周血中性粒细胞外泌体具有抑制胃癌细胞活性、延缓胃癌发生发展的治疗作用。
附图说明
图1为实施例2中人外周血中性粒细胞外泌体透射电镜图；
图2为实施例2中人外周血中性粒细胞外泌体形态的NTA检测结果；
图3为实施例2中人外周血中性粒细胞外泌体的westernblot检测结果；
图4为实施例3中人外周血中性粒细胞外泌体被胃癌细胞株HGC-27吞噬结果；
图5为实施例4中人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27体外抗肿瘤效果，其中图5-A为Westernblot检测凋亡和增殖相关蛋白表达情况；图5-B为CCK8细胞增殖实验检测不同浓度的人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27的毒性作用；图5-C为流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27抗肿瘤作用；图5-D为平板克隆实验检测人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27克隆形成能力的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种人外周血中性粒细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：
1)用含超离血清的RPMI1640培养人外周血中性粒细胞，取人外周血中性粒细胞培养上清进行差速离心，收集上清液，得到中性粒细胞培养上清；
2)对所述中性粒细胞培养上清进行浓缩，得到的浓缩液转移至30mg/mL蔗糖/D2O密度垫，于4℃条件下，100000g离心80min，收集底部的缓冲垫；
3)用PBS洗涤所述底部的缓冲垫后，对缓冲垫进行超滤离心，收集超滤之后的上层液体，得到人外周血中性粒细胞外泌体。
本发明中首先用含超离血清培养基RPMI1640培养人外周血中性粒细胞，取人外周血中性粒细胞培养上清进行差速离心，收集上清液，得到中性粒细胞培养上清；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的时间优选为48h；所述差速离心的程序优选为：500g离心10min，2000g离心10min，12000g离心30min，收集上清液进行100000g离心80min。
本发明中，所述人外周血中性粒细胞优选的采用以下方法提取得到：
S1.在容器中加入多形核白细胞分离液，再将相同体积的抗凝全血铺于分离液上层，于25℃条件下，800g，32min进行第一次密度梯度离心；
S2.所述第一次密度梯度离心后共分为四层，取中间由单核细胞和多形核细胞(PMN)组成的白色条带层，得到细胞悬液；
S3.用无血清RPMI1640洗涤所述细胞悬液，于25℃条件下，800g，5min，进行第二次密度梯度离心；
S4.所述第二次密度梯度离心后，收集沉淀与低渗红细胞裂解液混合，进行红细胞裂解5min，得到的裂解液与无血清RPMI1640混合，于25℃条件下，800g，5min，进行第三次密度梯度离心，弃掉上清液，得到人外周血中性粒细胞沉淀。
本发明首先在容器中加入多形核白细胞分离液，再将相同体积的抗凝全血铺于分离液上层，于25℃条件下，800g，32min进行密度梯度离心。
本发明中，所述容器优选为离心管；所述离心管的规格优选为15mL；所述密度梯度离心采用的设备优选为德国艾本德Eppendorf Centrifuge5804/5804R离心机。
经第一次密度梯度离心后共分为四层，取中间由单核细胞和多形核细胞(PMN)组成的白色条带层，得到细胞悬液。
得到细胞悬液后，本发明用无血清RPMI1640洗涤所述细胞悬液，于25℃条件下，800g，5min，进行第二次密度梯度离心。
本发明中，所述无血清RPMI1640的用量优选的与抗凝全血的用量一致(体积)；所述密度梯度离心采用的设备优选为德国艾本德EppendorfCentrifuge5804/5804R离心机。
经第二次密度梯度离心后，本发明收集沉淀与低渗红细胞裂解液混合，进行红细胞裂解5min，得到的裂解液与无血清RPMI1640混合(终止裂解)，于25℃条件下，800g，5min，进行第三次密度梯度离心，弃掉上清液，得到人外周血中性粒细胞沉淀。
本发明中，所述低渗红细胞裂解液的用量与抗凝全血的用量一致(体积)；所述无血清RPMI1640的用量与抗凝全血的用量一致(体积)。
得到中性粒细胞培养上清后，本发明对所述中性粒细胞培养上清进行浓缩，得到的浓缩液转移至30mg/mL蔗糖/D2O密度垫，于4℃条件下，100000g离心80min，收集底部的缓冲垫；所述浓缩的方式优选为超滤浓缩；所述浓缩的比例优选为100：3；所述离心的时间优选为80min；所述离心的设备优选为100000Da MWCO超滤离心机。
得到底部的缓冲垫后，本发明用PBS洗涤所述底部的缓冲垫后，进行超滤离心，弃掉上清液，得到人外周血中性粒细胞外泌体；所述超滤离心的温度为4℃，离心力为100000g，离心时间为80min；在收集上清液后，本发明优选的还包括采用滤膜对上清液进行过滤；所述滤膜的孔径优选为0.22μm。
本发明还提供了上述方案所述提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体；所述人外周血中性粒细胞外泌体是中性粒细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外的大小100nm的杯状膜形囊泡；所述人外周血中性粒细胞外泌体抗肿瘤的活性成分是颗粒酶；所述人外周血中性粒细胞外泌体通过运载颗粒酶促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌发生发展。
本发明还提供了上述方案所述人外周血中性粒细胞外泌体在制备治疗胃癌的药物中的应用；所述外泌体通过促进胃癌细胞凋亡和/或抑制胃癌细胞活性来治疗胃癌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
GC(gastric carcinoma，胃癌)；Neu(Neutrophils，中性粒细胞)；N-exos(Neutrophil-derived exosomes，中性粒细胞来源外泌体)。
实施例1制备人外周血中性粒细胞
1.将多形核白细胞分离液(PolymorphPrep分离液)及红细胞裂解液至25℃平衡；
2.抽取新鲜人外周抗凝血；
3.在15mL离心管中先加入5.0mLPolymorphPrep分离液，再将5.0mL抗凝全血铺于分离液上层；
4.25℃条件下进行一次密度梯度离心：800g，32min，(EppendorfCentrifuge5804/5804R离心机)；
5.离心后共分为四层，吸取中间由单核细胞和多形核细胞(PMN)组成的白色条带层；
6.用5mL无血清RPMI1640洗涤细胞悬液，进行二次密度梯度离心：800g，5min，(EppendorfCentrifuge 5804/5804R离心机)；
7.弃去细胞上清液，加入5mL低渗红细胞裂解液，裂解红细胞5min；
8.加入5mL无血清RPMI1640终止裂解，进行三次密度梯度离心：800g，5min，(EppendorfCentrifuge 5804/5804R离心机)；
9.对中性粒细胞进行形态学检查和细胞计数，用含超离血清的RPMI1640，孵箱内37℃培养48h，收集得到人外周血中性粒细胞。
实施例2人外周血中性粒细胞外泌体的提取与鉴定
人外周血中性粒细胞培养试剂：RPMI1640、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基(上海依科赛公司；倒置显微镜，超净工作台，台式离心机，超速离心机(美国贝克曼公司)。
Exosome提取试剂：重水(D2O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，兔抗人Alix抗体(CST公司)，兔抗人CD9抗体(美国Bioworld Technology公司)，兔抗人CD63抗体(美国Epitomics公司)，兔抗人CD81抗体(美国Epitomics公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，HRP化学发光底物、100-kDaMWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)，透射电子显微镜(FEI Tecnai 12，Philips公司)。
1)用含超离血清的RPMI1640培养人外周血中性粒细胞，37℃条件下培养48h，取人外周血中性粒细胞培养上清进行差速离心(500g离心10min，2000g离心10min，12000g离心30min，收集上清液进行100000g离心80min)，弃掉上清，得到人外周血中性粒细胞外泌体沉淀；
2)人外周血中性粒细胞外泌体的分离纯化：差速离心去细胞碎片及细胞器后，用15mL规格100000Da MWCO超滤管浓缩人外周血中性粒细胞培养上清，浓缩液移至5mL浓度为30％的蔗糖/D2O密度垫上，4℃条件下，100000g离心80min，收集底部5mL的缓冲垫(含外泌体)用PBS稀释洗涤后，置入100000Da MWCO超滤离心管中洗涤，最后将收集的外泌体浓缩，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-70℃冷藏备用；
3)透射电镜和Nanoparticle TrackingAnalysis观察外泌体形态特征：中性粒细胞外泌体20μL，混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，静置5min后，用滤纸吸去残余液体，将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，25℃条件下负染5min，白炽灯下烘干，透射电镜下观察拍照，图1所示外泌体直径约为120nm左右囊泡状结构；图2所示NTA检测人外周血中性粒细胞外泌体的粒径大小，图2显示：外泌体粒径大小约为100nm左右；
4)westernblot检测外泌体表面标记蛋白：配制15％SDS-PAGE电泳胶，外泌体充分裂解加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸10min，按200μg蛋白质总量上样电泳，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，50g/L脱脂牛奶室温封闭1h，与鼠抗人Alix抗体、兔抗人CD9抗体、兔抗人CD63抗体兔抗和人CD81抗体(1:500)4℃反应过夜，次日TBS/0.5％Tween 20洗膜3次，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h)，TBS/0.5％Tween 20洗膜3次，加入预混HRP化学发光底物，化学发光凝胶成像系统曝光检测，如图3所示人外周血中性粒细胞来源的外泌体的标记，由图3可以看出，人外周血中性粒细胞外泌体高表达Alix,CD9,CD63和CD81。
实施例3胃癌细胞系HGC-27对实施例2中制备的人外周血中性粒细胞外泌体吞噬效应
本实施例所使用的主要材料和来源分别如下：
24孔细胞培养板(JET Biofil)，细胞爬片15mm(NEST)，细胞染料DAPI和DIR，Theslides were visualized with Confocal microscope(JE公司)。
实施步骤：
1.HGC-27细胞接种于细胞爬片上，待细胞贴壁以后加入1ML RPMI1640和1μL人外周血中性粒细胞外泌体共培养，检测不同时间点：4h，8h，12h下HGC-27吞噬人外周血中性粒细胞外泌体的能力；
2.用4％多聚甲醛固定HGC-27细胞，进行细胞染色(DAPI染细胞核，DIR染人外周血中性粒细胞外泌体)；
3.利用激光共聚焦显微镜对细胞进行拍照。检测结果参见图4，图4为人外周血中性粒细胞外泌体内吞实验，由图4可知胃癌细胞株HGC-27对人外周血中性粒细胞外泌体的吞噬效果有时间依赖性，时间越长，HGC-27吞噬的人外周血中性粒细胞外泌体越多。
实施例4人外周血中性粒细胞外泌体体外抗肿瘤作用
本实施例所使用的主要材料和来源分别如下：
细胞培养皿(Excel公司)，结晶紫染色液(福麦斯，南京)，CCK8检测试剂盒(Vazyme)，96孔细胞培养板(JET Biofil)，AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(福麦斯，南京)，倒置显微镜(Nikon公司，日本)，流式细胞仪(CaliburBD公司，美国)。
实施步骤：
1.消化HGC-27，离心沉淀后细胞计数，实验共分为四组Ctrl,N-CM,N-exo,N-CMdepleted ofexo。每组分别接种800个HGC-27细胞，待细胞贴壁后分别加不同的处理(Ctrl组加1ML RPMI1640培养液，N-CM组加1ML中性粒细胞培养上清，N-exo组加1μL中性粒细胞来源外泌体，N-CM depleted ofexo组加1ML无exo中性粒细胞培养上清)，进行平板克隆实验。
2.消化HGC-27，离心沉淀后细胞计数，将细胞接种于96孔板内，待细胞贴壁后分别加不同的处理(Ctrl组加1ML RPMI1640培养液，N-CM组加1ML中性粒细胞培养上清，N-exo组加1μL中性粒细胞来源外泌体，N-CM depleted of exo组加1ML无exo中性粒细胞培养上清)，分别在0h,12h,24h,36h,48h用CCK8试剂检测人外周血中性粒细胞外泌体对HGC-27增殖能力的影响。
3.消化HGC-27，离心沉淀后细胞计数，将细胞接种于6孔板内，待细胞贴壁后分别加不同的处理(Ctrl组加1ML RPMI1640培养液，N-CM组加1ML中性粒细胞培养上清，N-exo组加1μL中性粒细胞来源外泌体，N-CM depleted of exo组加1ML无exo中性粒细胞培养上清)，使用流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞外泌体对HGC-27细胞凋亡的影响。
结果参见图5，其中图5-A为Westernblot检测凋亡和增殖相关蛋白表达情况；图5-B为CCK8细胞增殖实验检测不同浓度的人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27的毒性作用；图5-C为流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27抗肿瘤作用；图5-D为平板克隆实验检测人外周血中性粒细胞外泌体对胃癌细胞株HGC-27克隆形成能力的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种人外周血中性粒细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：
1)用含超离血清的RPMI1640培养人外周血中性粒细胞，取人外周血中性粒细胞培养上清进行差速离心，收集上清液，得到中性粒细胞培养上清；
2)对所述中性粒细胞培养上清进行浓缩，得到的浓缩液转移至30mg/mL蔗糖/D2O密度垫，于4℃条件下，100000g离心80min，收集底部的缓冲垫；
3)用PBS洗涤所述底部的缓冲垫后，对缓冲垫进行超滤离心，收集超滤之后的上层液体，得到人外周血中性粒细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的温度为37℃，时间为48h。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述差速离心的程序为：500g离心10min，2000g离心10min，12000g离心30min，收集上清液进行100000g离心80min。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述浓缩的方式为超滤浓缩。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述超滤离心的温度为4℃，离心力为100000g，离心时间为80min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤3)所述收集上清液后，还包括采用滤膜对上清液进行过滤；所述滤膜的孔径为0.22μm。
7.权利要求1～6任意一项所述提取方法得到的人外周血中性粒细胞外泌体。
8.权利要求7所述人外周血中性粒细胞外泌体在制备治疗胃癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外泌体通过促进胃癌细胞凋亡和/或抑制胃癌细胞活性来治疗胃癌。
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