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CN110698701B - 一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法。该制备方法包括：1)在4℃‑20℃低温条件下，以酸性溶液溶解天然胶原，得到胶原溶液；2)以磷酸盐缓冲溶液对步骤1)所得胶原溶液进行透析；3)在4℃‑20℃低温条件下，对步骤2)所得胶原溶液进行紫外辐射，得到所述胶原自组装凝胶。本发明利用紫外辐射在低温条件下诱导胶原分子纤维化自组装，有效降低了胶原分子自组装的温度阈值，拓宽了胶原纤维化自组装特征分子行为的应用范围。本发明制备的胶原自组装凝胶，具有良好的热稳定、凝胶强度和细胞相容性，有效提升了胶原自组装凝胶的生物学性能和应用价值。

Description

一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，更具体地，涉及一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，为结缔组织提供机械完整性和生物学功能。因其众所周知的优势，包括良好的生物相容性、可接受的生物降解性和低免疫原性等，而被广泛用作生物材料的基础构建模块。在生物体内胶原通常以高度有序的胶原纤维形式存在并赋予不同组织特异性的功能。例如，胶原纤维可以为结缔组织(如韧带、肌腱)提供优异的力学性能和热稳定性。在体外，通过调节合适的条件，如pH值、温度，胶原分子也会自发地有序堆积形成纤维状的聚集体，即体外纤维重组，胶原纤维构成的微环境更有利于细胞的生长。作为天然胶原的重要分子行为特征，纤维重组的研究贯穿了从胶原分子行为到胶原基新材料创制的各个环节。
大量的前期工作表明，通过控制胶原分子的组装条件包括温度、pH值、离子强度、初始胶原浓度以及添加非胶原成分，可在分子水平上设计和控制胶原基生物材料的结构和形态特征，获得用于各种稳定的胶原纤维组织工程材料。
在各种环境影响因素中，温度是胶原分子自组装行为最重要的触发条件。研究表明，只有当环境温度高于一个阈值温度时，胶原的体外纤维重组行为才会发生。大多数学者认为，将温度升至略低于胶原三螺旋的解离温度时(即自组装的阈值温度)，由于结构水的释放，胶原侧链活动性的增加和三螺旋的松弛，促使胶原分子趋向于自组装形成高级有序结构。因此，在需要构筑胶原纤维类生物材料时，往往需要通过适度提高环境温度(一般为37℃)来实现胶原的体外纤维重组。当环境温度低于纤维重组阈值温度时，一般不能获得具有纤维构造的胶原基材料。
但是，对于一些需要较低温条件制备的特殊性生物材料，例如热敏性药物、功能性因子、细胞的包埋、负载、定向递送等材料，要同步实现温敏物质的低温保护和纤维重组，仍没有合适技术手段。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种低温诱导的胶原自组装凝胶及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种低温诱导的胶原自组装凝胶的制备方法，该制备方法包括：
1)在4℃-20℃低温条件下，以酸性溶液溶解天然胶原，得到胶原溶液；
2)以磷酸盐缓冲溶液对步骤1)所得胶原溶液进行透析；
3)在4℃-20℃低温条件下，对步骤2)所得胶原溶液进行紫外辐射，得到所述胶原自组装凝胶。
作为优选方案，所述低温条件为4℃-15℃。
作为优选方案，步骤1)中，所述酸性溶液选自盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液和柠檬酸水溶液中的至少一种。
作为优选方案，步骤1)中，所述酸性溶液中，酸的摩尔浓度为0.05mol/L-0.5mol/L。
作为优选方案，步骤1)中，所述天然胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中的至少一种为原料提取的胶原。
作为优选方案，步骤1)中，所述胶原溶液中天然胶原的浓度为0.1mg/mL-10mg/mL。
作为优选方案，步骤2)中，所述磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为0.01mol/L-0.2mol/L。
作为优选方案，步骤2)中，所述透析采用截留分子量1000-100000道尔顿的透析袋进行透析，进一步优选采用截留分子量为12000-15000道尔顿的透析袋进行透析。
作为优选方案，步骤2)中，透析温度为4℃-20℃，透析时间为24h-96h。通常情况下，当透析袋内外pH相同时，可判定透析过程已充分进行。
根据本发明，紫外辐射的温度需一直保持在4℃-20℃，紫外辐射过程中若样品温度＞20℃，需暂停辐射待样品充分冷却后继续辐射。
具体地，实际操作过程中，若设定温度为4℃-10℃，则紫外辐射过程中若样品温度＞10℃，需暂停辐射待样品充分冷却后继续辐射。
作为优选方案，步骤3)中，紫外辐射的波长为200nm-400nm，紫外辐射的时间为30min-240min。当紫外辐射的波长200nm-300nm时，累计辐射时间为30min-150min；当紫外辐射的波长300nm-400nm时，累计辐射时间为150min-240min。如当紫外辐射的波长200nm时，累计辐射时间为30min；如当紫外辐射的波长300nm时，累计辐射时间为150min；如当紫外辐射的波长400nm时，累计辐射时间为240min。
本发明的第二方面提供由上述的制备方法制备得到的胶原自组装凝胶。
本发明的优点和积极效果：
(1)本发明利用紫外辐射，在低温条件下，诱导胶原分子纤维化自组装，有效降低了胶原分子自组装的温度阈值，拓宽了胶原纤维化自组装特征分子行为的应用范围。
(2)在紫外辐射的作用下，可同步实现胶原纤维的交联和胶原自组装凝胶的杀菌，本发明制备的胶原自组装凝胶，具有良好的热稳定、凝胶强度和细胞相容性，有效提升了胶原自组装凝胶的生物学性能和应用价值。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1示出了实施例1制得的胶原自组装凝胶产物中胶原纤维的微观形貌图。
图2示出了实施例3制得的胶原自组装凝胶产物中胶原纤维的微观形貌图。
图3示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装凝胶产物的凝胶强度分析结果。
图4示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装产物的热稳定性分析结果。
图5示出了实施例2与对比例3制得胶原自组装产物的热稳定性分析结果。
图6示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装凝胶产物的细胞相容性的分析结果。
图7示出了实施例4与对比例4制得胶原自组装凝胶产物的细胞相容性的分析结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1
称取适量牛跟腱胶原样品，用0.5mol/L乙酸配制成牛跟腱胶原浓度为2mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析48h，此时透析袋内外pH相同；在4℃-14℃的温度条件下，将透析后的胶原溶液置于紫外波长254nm下辐射140min(紫外辐射过程中，若样品温度＞14℃，暂停辐射，待样品充分冷却后继续辐射，140min为累计辐射时间)，制得胶原自组装凝胶产物。
实施例2
称取适量牛跟腱胶原样品，用0.5mol/L乙酸配制成牛跟腱胶原浓度为4mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析48h，此时透析袋内外pH相同；在低于4℃-14℃的温度条件下，将透析后的胶原溶液置于紫外波长365nm下辐射200min(紫外辐射过程中，若样品温度＞14℃，暂停辐射，待样品充分冷却后继续辐射，200min为累计辐射时间)，制得胶原自组装凝胶产物。
实施例3
称取适量草鱼皮胶原样品，用0.1mol/L盐酸配制成草鱼皮胶原浓度为8mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.04mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析36h，此时透析袋内外pH相同；在低于4℃-10℃的温度条件下，将透析后的胶原溶液置于紫外波长365nm下辐射240min(紫外辐射过程中，若样品温度＞10℃，暂停辐射，待样品充分冷却后继续辐射，240min为累计辐射时间)，制得胶原自组装凝胶产物。
实施例4
称取适量牛蛙皮胶原样品，用0.1mol/L柠檬酸配制成牛蛙皮胶原浓度为1mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析72h，此时透析袋内外pH相同；在低于4℃-10℃的温度条件下，将透析后的胶原溶液置于紫外波长312nm下辐射200min(紫外辐射过程中，若样品温度＞10℃，暂停辐射，待样品充分冷却后继续辐射，200min为累计辐射时间)，制得胶原自组装凝胶产物。
对比例1
称取适量牛跟腱胶原样品，用0.5mol/L乙酸配制成牛跟腱胶原浓度为2mg/mL的胶原溶液样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析48h，此时透析袋内外pH相同；将透析后的胶原溶液在37℃下恒温培养140min，制得胶原自组装凝胶产物。
对比例2
称取适量牛跟腱胶原样品，用0.5mol/L乙酸配制成牛跟腱胶原浓度为2mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析48h，此时透析袋内外pH相同；将透析后的胶原溶液在14℃下恒温培养140min，胶原溶液仍为流体态，未发生自组装形成凝胶产物。
对比例3
称取适量牛跟腱胶原样品，用0.5mol/L乙酸配制成牛跟腱胶原浓度为4mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析48h，此时透析袋内外pH相同；将透析后的胶原溶液在37℃下恒温培养200min，制得胶原自组装凝胶产物。
对比例4
称取适量牛蛙皮胶原样品，用0.1mol/L柠檬酸配制成牛蛙皮胶原浓度为1mg/mL的样品50mL(在4℃下进行)；再将胶原溶液装入截留分子量为12000-15000道尔顿透析袋中，在4℃，用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析72h，此时透析袋内外pH相同；将透析后的胶原溶液在30℃下恒温培养200min，制得胶原自组装凝胶产物。
图1示出了实施例1制得的胶原自组装凝胶产物中胶原纤维的微观形貌图。可以观察到紫外辐射诱导自组装形成的胶原纤维具有明显的D周期有序结构特征。
图2示出了实施例3制得的胶原自组装凝胶产物中胶原纤维的微观形貌图。可以观察到紫外辐射诱导自组装形成的胶原纤维具有明显的D周期有序结构特征。
图3示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装凝胶产物的凝胶强度分析结果。通过质构分析胶原自组装凝胶产物的凝胶强度，可以看到紫外辐射诱导自组装形成的凝胶具有比温度诱导自组装凝胶更好的凝胶强度和相近的粘度。
图4示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装产物的热稳定性分析结果。通过DSC分析自组装产物的热稳定性，可以看到紫外辐射诱导自组装形成的产物具有比温度诱导自组装产物更好的热稳定性，包括更高的热收缩温度和更高的热收缩焓。
图5示出了实施例2与对比例3制得胶原自组装产物的热稳定性分析结果。通过DSC分析自组装产物的热稳定性，可以看到紫外辐射诱导自组装形成的产物具有比温度诱导自组装产物更好的热稳定性，包括更高的热收缩温度和更高的热收缩焓。
图6示出了实施例1与对比例1制得胶原自组装凝胶产物的细胞相容性的分析结果。通过MTT实验分析胶原自组装凝胶产物的细胞相容性，可以看到紫外辐射诱导自组装形成的凝胶具有比温度诱导自组装凝胶更好的细胞相容性。
图7示出了实施例4与对比例4制得胶原自组装凝胶产物的细胞相容性的分析结果。通过MTT实验分析胶原自组装凝胶产物的细胞相容性，可以看到紫外辐射诱导自组装形成的凝胶具有与温度诱导自组装凝胶相近的细胞相容性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (6)

1.一种低温诱导的胶原自组装凝胶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
1）在4℃-20℃低温条件下，以酸性溶液溶解天然胶原，得到胶原溶液；
2）以磷酸盐缓冲溶液对步骤1）所得胶原溶液进行透析，至透析袋内外pH相同；
3）在4℃-20℃低温条件下，对步骤2）所得胶原溶液进行紫外辐射，得到所述胶原自组装凝胶；
步骤1）中，所述酸性溶液选自盐酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液和柠檬酸水溶液中的至少一种；
步骤1）中，所述酸性溶液中，酸的摩尔浓度为0.05mol/L-0.5mol/L；步骤1）中，所述胶原溶液中天然胶原的浓度为0.1mg/mL-10mg/mL；
步骤2）中，所述磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为0.01mol/L-0.2mol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1）中，所述天然胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中的至少一种为原料提取的胶原。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤2）中，采用截留分子量1000~100000道尔顿的透析袋进行透析。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤2）中，透析温度为4℃-20℃，透析时间为24h-96h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤3）中，紫外辐射的波长为200nm-400nm，紫外辐射的时间为30min-240min。
6.由权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制备得到的胶原自组装凝胶。
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