CN110665050B

CN110665050B - 一种生物粘合剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110665050B
Application number: CN201911087311.5A
Authority: CN
Inventors: 赖佳惠; 周娟; 陈敬华; 方诗莹; 杨陈; 王攀琛; 曾以妍; 张羲和
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Shanghai Zechong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110665050A

Abstract

本发明公开了一种生物粘合剂及其制备方法，属于生物粘合剂技术领域。该粘合剂是在氧化条件下由结构蛋白(胶原蛋白、明胶等)和单宁酸进行迈克尔加成反应，经过后续处理，再通过转谷氨酰胺酶(TG)交联制得。本发明提供的生物粘合剂所用的原料均具有良好的生物相容性，替代了传统生物粘合剂中所用的有毒化学组分；同时，原料之间的协同作用可使本产品以凝胶状态更长时间稳定地粘附于伤口处，并使单宁酸本身具有的抗菌和修复皮损伤的效果更持久地作用于伤口处，从而更好地促进伤口修复愈合；该生物粘合剂还能用注射器精准定位，能牢固粘连结合部位，具有重要的生物医药领域的应用价值。

Description

一种生物粘合剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物粘合剂及其制备方法，属于生物粘合剂技术领域。

背景技术

传统的外科手术缝合可以提供很好的抗张强度，以及相对较低的事故率等，但同时存在复杂费时、缝合对伤口造成二次机械损伤、产生细胞排斥免疫、体内残留时间较长时会造成肉芽肿瘤、拆线会带来一定的不适和痛苦等缺点。生物粘合剂是利用生物相容性优异的材料制备而成的无菌、无免疫原性且在一定的时间内能够抑制细菌的生物医学材料。其组分中无溶剂或者溶剂为水，在湿态环境下(即有水、组织液、血液等存在情况下)仍可与机体组织产生一定强度的粘接。生物粘合剂的溶出物等不对机体细胞产生毒性，不影响机体组织的伤口愈合，并且材料自身可降解，满足使用要求后能够被人体组织吸收，并最终被代谢出人体。

目前，临床上常用的生物粘合剂有纤维蛋白粘合剂和贻贝粘蛋白粘合剂，但这些粘合剂仍存在很多缺陷。如纤维蛋白粘合剂存在着粘合强度低、制备时间长、价格昂贵的缺点以及潜在的病毒感染风险；贻贝粘蛋白粘合剂价格昂贵，美国售价达到115美元/mg。

因此，研究人员一直在研究这两类生物粘合剂的替代品。近年来明胶基粘合剂成为一类重要的生物粘合剂，其粘合强度高，成本低，生物相容性好。如专利CN105879109A公开了一种价格低廉、粘合性强、适用于外科手术的生物粘合剂，该粘合剂由明胶水溶液和戊二醛水溶液混合生成。虽然该专利公开的粘合剂可以满足粘附性和胶化时间的要求，但戊二醛易产生细胞毒性反应，用于患者创面极不安全，因此，达到理想要求的生物粘合剂仍未出现。

发明内容

本发明拟解决现有生物粘合剂价格高昂、生物相容性及可降解性不优良、无抗菌性等缺点，目的提供一种可注射型抗菌性生物粘合剂及其制备方法，本发明提供的生物粘合剂能用注射器精准定位，能牢固粘连结合部位，具有抗水性、抗菌性、封闭止血和无细胞毒性的特点，且该生物粘合剂及其降解产物都具有良好的生物相容性。

本发明的第一个目的是提供一种制备可注射型抗菌性生物粘合剂的方法，该方法包括以下步骤：

1)：在氧化条件下将结构蛋白和单宁酸进行迈克尔加成反应，得到单宁酸修饰的结构蛋白；

2)：将步骤1)制备的单宁酸修饰的结构蛋白溶于缓冲液中，加入转谷氨酰胺酶，混合均匀后即得该生物粘合剂。

在一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

在一种实施方式中，所述结构蛋白包括明胶或胶原蛋白。

在一种实施方式中，步骤1)中结构蛋白和去离子水质量比(w/w)为(0.005～0.1)：1，单宁酸和结构蛋白质量比(w/w)为(0.01～0.1)：1。

在一种实施方式中，步骤1)单宁酸和结构蛋白质量比(w/w)为(0.01～0.1)：1。

在一种实施方式中，步骤1)中迈克尔加成反应的过程具体为：将结构蛋白与去离子水混合，搅拌溶解，反应时间0.5～3.0h，调节溶液pH为碱性，pH＝8.0～9.0；加入单宁酸，持续搅拌并通氧气进行反应，维持溶液pH与上述pH一致，于50～70℃反应1.0～4.0h，反应结束后把溶液pH调回中性偏碱性，pH＝7.0～7.8。

在一种实施方式中，步骤1)迈克尔加成反应后还进行透析、干燥；所述透析是指使用分子量截止值为3500Da的透析管对溶液进行去离子水透析；所述干燥是指冷冻干燥。

在一种实施方式中，步骤2)中缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5～9.5。

在一种实施方式中，所述单宁酸修饰的结构蛋白溶于浓度为1～15g/100mL的Tris-HCl缓冲液中；所述转谷氨酰胺酶在Tris-HCl缓冲液中的终浓度为0.1％～5g/100mL，在该范围内，产品结构更稳定，成凝胶时间更短，外观更好。

在一种实施方式中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为7.5g/100mL，每100mL Tris-HCl缓冲液中含有1～15g的单宁酸修饰的结构蛋白。

在一种实施方式中，所述转谷氨酰胺酶的添加量为3g/100mL，转谷氨酰胺酶的酶活力为200U/g)。

本发明的第二个目的是保护应用上述任一方法制备的经转谷氨酰胺酶交联的基于结构蛋白和单宁酸的生物粘合剂。

在一种实施方式中，所述结构蛋白包括但不限于明胶、胶原蛋白。

本发明还要求保护所述方法或所述生物粘合剂在制备活性生理组织间的粘合、生理性管道的填塞补漏、损伤创面的封闭止血或修复的药物，或医疗器械中的应用。

有益效果：本发明提供了一种可注射型抗菌性生物粘合剂及其制备方法，与现有技术相比：

(1)本发明采用结构蛋白、单宁酸、转谷氨酰胺酶等作为原料，具有良好的生物相容性，及良好的抑菌效果(对10⁶CFU细菌具有100％的抑菌率)，替代了传统生物粘合剂中所用的有毒化学组分，三者协同作用可使本产品以凝胶状态长时间稳定地粘附于伤口处从而更好地促进伤口修复愈合。

(2)本发明具有可注射功能，可填充和粘合任何形状的伤口，使粘合剂紧紧地贴合伤口，从而更好的促进伤口愈合。

(3)本发明有利于促进湿润环境伤口愈合，有相当强的湿组织黏附强度。

(4)本发明有良好的生物活性，对生物体组织刺激小。

(5)本发明有良好的力学性能，粘合强度可达5.528KPa，不会因为伤口变形而发生胶体断裂。

(6)本发明可生物降解，可有效避免因除去药物而造成的二次伤害。

(7)本发明生产过程无污染，最终产物对环境和人体均无污染，绿色环保。

(8)本发明制备方法简单，对设备要求不高，原料易得，成本低廉，适合大规模生产。

附图说明

图1为本发明的技术路线；

图2为本发明制备的生物粘合剂的抗菌试验效果图；

图3为本发明粘合强度测试的结构示意图；

图4为本发明制备的生物粘合剂的粘合强度测试结果；

图5为本发明制备的生物粘合剂的细胞毒性试验结果；

图6为本发明制备的生物粘合剂的体外降解实验结果；

图7为本发明实施例3制备的生物粘合剂的SEM图。

具体实施方式

本发明首先将结构蛋白在去离子水中溶解后将pH调为碱性。本发明对所述结构蛋白的来源无特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品或实验室自制品均可。

粘合强度测试方法：经处理的猪皮于37℃水浴锅中解冻，切成1×4cm²样品，表面水分用吸水纸充分吸收，37℃保温。将制得的生物粘合剂涂在猪皮表面(1×3cm²)后，将两块猪皮粘合，用手指轻按30s，于水浴中保温，待样品凝胶化后将样品在万能机械试验机上用50N称重传感器以十字头速率5mm/min进行单轴拉伸应力-应变试验。每次拉伸至断开作为最终的最大粘合力，计算出相应的粘合强度。

为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

(1)称取明胶1g，加入100mL去离子水在60℃加热搅拌的条件下溶解明胶2.0h，最终得到质量分数为1％的明胶溶液。

(2)用12mol/L的氢氧化钠溶液调节步骤(1)制备的明胶溶液的pH至8.5，称量34mg单宁酸充分溶解在少量去离子水中，将上述的单宁酸溶液缓慢滴加到调好pH的明胶溶液中，再次用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，在60℃搅拌的条件下加热3.0h，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH使之保持8.5，并连续导入空气。

(3)步骤(2)反应结束后用0.5mol/L的稀盐酸调节pH至7.4，并让上述反应物冷却至室温，再利用分子量截止值为3500Da的透析袋对反应物进行去离子水透析3次，最后再将透析后的物质冷冻干燥。

(4)取100mg步骤(3)冻干后样品，与1ml Tris-HCL缓冲液混合均匀得到溶液，加入10mg转谷氨酰胺酶并混合均匀，即得粘合剂。

实施例2

(4)取100mg步骤(3)冻干后样品，与1ml Tris-HCL缓冲液混合均匀得到溶液，加入20mg转谷氨酰胺酶并混合均匀，即得粘合剂。

实施例3

(4)取100mg步骤(3)冻干后样品，与1mlTris-HCL缓冲液混合均匀得到溶液，加入30mg转谷氨酰胺酶并混合均匀，即得粘合剂。

实施例4成凝胶时间测试

对实施例1～3制备过程中步骤(4)加入转谷氨酰胺酶后的成凝胶时间进行测定，分别在室温(25℃)和体温(37℃)条件下测定该生物粘合剂的成凝胶时间。结果如表1所示。在25℃下凝胶时间可低至9min。

表1不同实施例制备获得的粘合剂的成凝胶时间结果

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				酶浓度(％，w/v)	1	2	3
25℃成凝胶时间(分钟)	30	20	9
				37℃成凝胶时间(分钟)	＞60	50	30

实施例5抑菌试验

采用菌落计数法测定该生物粘合剂对大肠杆菌ATCC 8739的抑菌效果。

活化菌种：取1mL菌液置于20mL液体培养基中，摇床培养12h(37℃，100r/min)。

将50uL活化后菌液转接到20mL液体培养基中，摇床培养2h(37℃，100rpm)，分别取20uL菌液(约1×10⁶CFU/mL)加入到放有100uL由实施例1、2和3中制得的生物粘合剂样品的孔板中(3组平行以及3组空白对照)，摇床培养2h(37℃，100r)后将菌液稀释10⁴倍，将稀释后的菌液取100uL涂抹于固体培养基上，放入恒温培养箱(37℃)中培养12h，计算菌落总数。

抑菌率(％)＝(空白对照菌落总数-生物粘合剂菌落总数)÷空白对照菌落总数×100

实验结果：本发明的生物粘合剂对大肠杆菌的抑菌结果如表2和图2所示，实施例1～3的方法制备的生物粘合剂抑菌率均为100％。

表2不同实施例制备获得的粘合剂的抑菌效果

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				TA/gelatin(％，w/w)	3.4	3.4	3.4
酶浓度(％，w/v)	1	2	3
				抑菌率(％)	100	100	100

实施例6粘合强度测试

粘合强度测试方法：经处理的猪皮于37℃水浴锅中解冻，切成1×4cm²样品，表面水分用吸水纸充分吸收，37℃保温。将由实施例1、2、3中制得的生物粘合剂涂在猪皮表面(1×3cm²)后，将两块猪皮粘合，用手指轻按30s，于水浴中保温，待样品凝胶化后将样品在万能机械试验机上用50N称重传感器以十字头速率5mm/min进行单轴拉伸应力-应变试验。每次拉伸至断开作为最终的最大粘合力，计算出相应的粘合强度。结果如表3和图4所示。

表3不同实施例制备获得的粘合剂的粘合强度结果

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				酶浓度(％，w/v)	1	2	3
粘合强度(KPa)	2.857	3.773	5.528

实施例7细胞毒性试验

细胞毒性试验方法：采用MTT法测定该生物粘合剂对3T3成纤维细胞的细胞毒性。

具体操作为：将由实施例3制得的生物粘合剂冷冻干燥，冻干后的粘合剂紫外灭菌0.5h后以10mg/mL的浓度浸泡在细胞培养基中，浸提液用于培养细胞；取生长状态良好的3T3细胞，按3000/孔的密度铺于96孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；细胞贴壁后加入100μL不同浓度的粘合剂浸提液(0.25，0.5，1，5mg/mL)，每个浓度设置6个平行，且每块孔板设置一组空白对照。细胞继续培养24、48、72小时后，弃培养基，加入100μL 0.5mg/ml的MTT，放入细胞培养箱中继续培养4小时终止培养。吸去孔板内上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，静置15分钟，用酶标仪检测其在570nm处的吸收值。

实验结果：本发明的生物粘合剂的细胞毒性试验结果如图5所示。实施例3制备的生物粘合剂在0.25、0.5mg/mL的浓度下对细胞生长无抑制作用，在1、2mg/mL的浓度下对细胞生长的影响不显著。

实施例8体外降解实验

用胶原酶Ⅰ在PBS中对该生物粘合剂的体外生物降解性进行研究。

具体操作为：将由实施例1、2和3制得的生物粘合剂冷冻干燥，冻干后的粘合剂浸泡在胶原酶Ⅰ(1U/ml)的PBS(pH7.4)中，在37℃、100rpm/min条件下下摇匀。离心溶液，定期(1d、3d、7d、14d)去除未反应的酶，将沉淀冻干并称重。另外，设无酶对照组。

生物降解率(％)＝(W0-W1)/W0×100，式中，W0是原始冻干粘合剂的重量，W1是在预定时间冻干后样品的重量。

实验结果：本发明的生物粘合剂的体外降解实验结果如图6所示，在七天后实施例1、2和3的降解率分别达到了60.2％、48.9％和21.3％；在十四天后分别达到了78.7％、67.5％和40.7％。

实施例9表观形貌检测

表观形貌检测方法：用扫描电镜(SEM)观察该生物粘合剂的孔隙形态。

具体操作为：(1)附着面检测：经处理的猪皮于37℃水浴锅中解冻，切成1×4cm2样品，表面水分用吸水纸充分吸收，37℃保温。将由实施例3中制得的生物粘合剂涂在猪皮表面(1×3cm2)后，将两块猪皮粘合，用手指轻按30s，于水浴中保温，待样品凝胶化后将样品冷冻干燥。将冷冻干燥后的两块猪皮撕开，样品用于附着面检测。

(2)非粘附表面检测：将由实施例3制得的生物粘合剂冷冻干燥后直接对其表面进行非粘附表面检测。

(3)内部横截面检测：将由实施例3制得的生物粘合剂冷冻干燥，断裂后获得内部横截面，用于内部形貌的研究。

实验结果：本发明的生物粘合剂的表观形貌检测结果如图7所示，从图中可以看出，该生物粘合剂具有良好的孔隙结构和较高的孔隙率，不但有利于伤口渗出液的吸收，还可以透湿透气、为细胞增殖创造空间。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种制备可注射型抗菌性生物粘合剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取明胶1g，加入100mL去离子水在60℃加热搅拌的条件下溶解明胶2.0h，最终得到质量分数为1％的明胶溶液；

(2)用12mol/L的氢氧化钠溶液调节步骤(1)制备的明胶溶液的pH至8.5，称量34mg单宁酸充分溶解在少量去离子水中，将上述的单宁酸溶液缓慢滴加到调好pH的明胶溶液中，再次用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，在60℃搅拌的条件下加热3.0h，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH使之保持8.5，并连续导入空气；

(3)步骤(2)反应结束后用0.5mol/L的稀盐酸调节pH至7.4，并让上述反应物冷却至室温，再利用分子量截止值为3500Da的透析袋对反应物进行去离子水透析3次，最后再将透析后的物质冷冻干燥；

2.应用权利要求1方法制备的生物粘合剂。

3.权利要求1所述方法或权利要求2所述生物粘合剂在制备活性生理组织间的粘合、生理性管道的填塞补漏、损伤创面的封闭止血或修复的药物，或医疗器械中的应用。