CN110637086A

CN110637086A - Rna分子与肽的复合体的制造方法及其利用

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Publication number: CN110637086A
Application number: CN201880018535.8A
Authority: CN
Inventors: 上田泰己; 清水义宏; 原田颂子; 松本桂彦
Original assignee: Cobistas Co Ltd
Current assignee: Cobistas Co Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2038-03-15
Also published as: DK3597746T3; JPWO2018168999A1; CA3056756A1; WO2018168999A1; EP3597746A4; US11286481B2; AU2018236568A1; EP3597746A1; CA3056756C; JP6852917B2; EP3597746B1; SG11201908579PA; US20200283761A1; AU2018236568B2; CN110637086B

Abstract

本发明提供一种高效地获得复合体的方法及其利用，所述复合体是将基因(mRNA)与作为其翻译产物的肽经由肽受体分子而连结。本发明的方法中，在模板DNA的反义链的5'末端侧导入至少一个2'‑修饰核苷衍生物。

Description

RNA分子与肽的复合体的制造方法及其利用

技术领域

本发明涉及一种制造核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分子与编码于所述RNA分子中的肽的复合体的方法及其利用等。

背景技术

近年来，正在积极开展以抗体药物为代表的分子靶向药物的开发，其市场规模也不断扩大。但是，为了进一步的发展，谋求一种高效地筛选特异性、或对抗原的亲和性更高的“优质抗体”的方法。另外，尽管目前有许多原因不明的疑难病症或慢性疾病，但由于其原因调查未取得进展，故而也指出了“药物开发靶标枯竭”的问题。

与基因分析相比较，蛋白质的分析通常更困难。关于基因，已开发出聚合酶链反应(polymerase chain reaction method，PCR)法等多种基因扩增法，容易大量地制备试样，另一方面，关于蛋白质，不存在直接扩增的方法也是其原因之一。

因此，作为使蛋白质的分析变得更容易的方法的一例，已经开发出利用蛋白质、与对所述蛋白质进行编码的基因直接结合的复合体的方法。

例如，专利文献1及非专利文献1～2中公开了如下方法：使用将基因(信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA))及作为其翻译产物的肽，经由嘌呤霉素(puromycin)而以共价键连结的复合体，来选择功能肽。更具体而言，通过在基因(mRNA)的3'末端侧，经由既定的连结体来连结嘌呤霉素，将所述基因进行翻译，由此，基因(mRNA)及作为其翻译产物的肽经由嘌呤霉素而连结。这些方法也称为mRNA展示法、或者体外病毒(Invitro virus)法等，是能够使用包含10¹³～10¹⁴个左右的所述复合体的非常大的文库的方法。另外，作为从所述方法派生出的方法，还开发出将mRNA转变为互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)后再使用的cDNA展示法、或可利用非天然氨基酸的RAPID展示等方法。

所述mRNA展示法中，基因(mRNA)与嘌呤霉素或嘌呤霉素的代替物(统称为肽受体分子或肽受体)的连结方法中已开发出若干方法。最初开发出mRNA展示法时，使用称为夹板DNA的DNA来作为支架的方法为主流。更具体而言，所述方法使包含肽受体分子的所述连结体、与所述基因(mRNA)的3'末端侧，相对于相同夹板DNA而杂交，将所述连结体与基因(mRNA)的3'末端侧进行酶促连接(非专利文献3等)。

但是，目前，作为基因(mRNA)与肽受体分子的连结方法，成为主流的是使用在一端具有与mRNA的3'末端侧的碱基序列配对的侧链碱基、且在另一端具有肽受体分子的连结体的方法(也参照专利文献2等)。在使用如上所述的连结体的情况下，所述连结体的所述一端与mRNA的3'末端侧的碱基序列进行杂交，继而，连结体的一端与mRNA的3'末端酶促连结而形成发夹(hairpin)结构。

[现有技术文献]

[专利文献]

[专利文献1]WO98/31700(1998年7月23日国际公开)

[专利文献2]WO2011/049157(2011年4月28日国际公开)

[非专利文献]

[非专利文献1]用于肽及蛋白质的体外选择的RNA-肽融合体(RNA-peptidefusions for the in vitro selection of peptides and proteins)。《美国国家科学院院刊》(Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94:12297-12302,1997。

[非专利文献2]体外病毒：体外核糖体上的在3'-末端带有嘌呤霉素的mRN与其所编码的蛋白质的C-末端的结合(In vitro virus:Bonding of mRNA bearing puromycinat the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on theribosome in vitro)。《欧洲生化学会联合会快报》(Federation of EuropeanBiochemical Societies letters，FEBS Letters)，414:405-408,1997。

[非专利文献3]用于体外蛋白质选择的RNA-蛋白质融合体的优化合成(OptimizedSynthesis of RNA-Protein Fusions for in Vitro Protein Selection)。《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)，VOL.318,P268-293,2000.

发明内容

[发明所要解决的问题]

非专利文献3等中记载的使用夹板DNA的方法若不严格控制所述基因(mRNA)的3'末端侧的碱基序列、以及包含嘌呤霉素的所述连结体的碱基序列这两者，则存在两者的连接效率大幅度下降的问题。

另一方面，专利文献2等中还记载的基因(mRNA)与肽受体分子的连结方法(发夹结构的形成)在以下方面更优于使用夹板DNA的方法：1)不需要夹板DNA，2)连结体的所述一端的碱基序列、与mRNA的3'末端侧的碱基序列的杂交的严密度也存在一定的容限(即便具有一个～数个碱基的偏差，也能够进行酶促连结)。

但是，mRNA展示法是除了基因(mRNA)与肽受体分子的连结步骤以外，还包括各种步骤的方法，因此从高效地获得将基因(mRNA)与作为其翻译产物的肽连结而成的复合体的观点而言，认为仍然存在很大的改善余地。

本发明的一形态的目的为提供一种高效地获得将基因(mRNA)与作为其翻译产物的肽经由肽受体分子而连结的复合体的方法及其利用。

[解决问题的手段]

本申请案发明者们对所述课题进行了积极研究。其结果为发现如下可能性，即，令人意外的是，使用夹板DNA将基因(mRNA)与肽受体分子连结的方法在高效地获得基因(mRNA)与作为其翻译产物的肽的复合体的观点上优异。而且，基于所述见解而再次着眼于使用夹板DNA的方法，结果想到本申请案发明。

为了解决所述课题，本发明的一形态为如以下所述。

(1)一种RNA分子与肽的复合体的制造方法，其制造对肽进行编码的RNA分子、与编码于所述RNA分子中的肽的复合体，其包括：

步骤(i)：其是通过包含启动子区域以及对位于其下游的肽进行编码的区域的DNA分子进行转录反应来制作RNA分子的步骤，且为在所述DNA分子的最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物的步骤；

步骤(ii)：其是在步骤(i)中所获得的所述RNA分子的3'末端，使用夹板多核苷酸作为支架来结合肽受体分子的步骤；以及

步骤(iii)：其是通过将步骤(ii)中所获得的结合有肽受体分子的所述RNA分子进行翻译，来制作所述RNA分子、与编码于所述RNA分子中的肽经由所述肽受体分子而连结的RNA分子与肽的复合体的步骤。

(2)一种DNA文库，其用于mRNA展示法，其包含多个不同的候选DNA分子，所述候选DNA分子包含启动子区域以及对位于其下游的候选肽进行编码的区域，且在最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物。

[发明的效果]

依据本发明的一形态，起到的效果是能够提供一种高效地获得将基因(mRNA)与作为其翻译产物的肽经由肽受体分子而连结的复合体的方法及其利用。

附图说明

图1是对现有方法的一例与本发明的方法的一例的差异进行说明的图。

图2是表示实施例1中的结果的图。

图3是表示实施例2中的结果的图。

图4是表示实施例3中的结果的图。

图5是对实施例4中的使用蛋白酶的cDNA的溶出方法进行说明的图。

图6是表示实施例4中的结果的图。

图7是对本发明的方法的另一例进行说明的图。

图8是表示实施例5中的结果的图。

具体实施方式

本发明所涉及的对肽进行编码的RNA分子、与编码于所述RNA分子中的肽的复合体的制造方法包括：

步骤(iii)：通过将步骤(ii)中所获得的结合有肽受体分子的所述RNA分子进行翻译，来制作所述RNA分子与编码于所述RNA分子中的肽经由所述肽受体分子而连结的RNA分子与肽的复合体的步骤。

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

(定义)

本说明书中所谓“文库”，是指多个(两个以上)的不同分子(例如多个不同的DNA分子、多个不同的RNA分子、或者多个不同的RNA-肽复合体)的集合，例如是指分类为相同范畴(例如DNA分子的范畴、RNA分子的范畴、或者RNA-肽复合体的范畴)的多个不同分子的集合。关于分子的范畴的名称，有时也称为DNA文库(DNA分子的文库)、RNA文库(RNA分子的文库)、RNA-肽复合体文库(RNA-肽复合体分子的文库)等。本实施方式所涉及的方法中，视需要，由于从多数个候选分子出发的挑选容易，故而本实施方式中的“文库”可包含优选为10⁹个以上，更优选为10¹⁰个以上、10¹¹个以上、或者10¹²个以上，进而优选为10¹³个以上的不同分子。

所谓“挑选/选择”，意指将某分子实质上与集团中的其他分子加以区分，例如意指从分类为相同范畴的多个不同分子的集合中实质上地区分出某分子。在本说明书中所使用的情况下，通过“挑选/选择”，所需的分子在挑选后与文库中的并非所需分子的分子相比较，可浓缩至至少2倍、优选为30倍以上、更优选为100倍以上、进而优选为1000倍以上。如本说明书中所示，挑选阶段在既定的方法可反复进行任何次数，另外，也可将不同类型的挑选阶段加以组合。

(现有方法)

在对本实施方式所涉及的方法进行说明之前，参照图1的(A)，对使用夹板多核苷酸(DNA)的现有mRNA展示法的一例进行简单说明。

现有mRNA展示法的一例中，进行以下的步骤。

(1)首先，准备对候选肽进行编码的候选DNA分子的文库。候选DNA分子通常为双链，具有在步骤(2)中的转录反应所使用的RNA聚合酶所识别的启动子区域的下游配置有对肽进行编码的区域的结构。在对肽进行编码的区域的上游侧，存在适合于所使用的无细胞翻译系统的翻译起始序列(例如起始密码子)。

(2)继而，使RNA聚合酶作用于候选DNA分子而进行转录反应，来制作所对应的候选RNA分子的文库。然后，将所制作的候选RNA分子从其他转录反应成分中分离。

(3)继而，将在3'末端结合有肽受体分子(例如嘌呤霉素)的连结体，连接于候选RNA分子的3'末端。连结体包含核苷酸，且在核苷酸的3'末端结合有肽受体分子。在核苷酸与肽受体分子之间也可以插入聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。为了候选RNA分子与连结体的结合，也可使用称为“夹板多核苷酸”的寡核苷酸(例如“夹板DNA”)。在所述情况下，将包含可在候选RNA分子的3'末端侧杂交的序列、以及可在连结体的核苷酸的5'末端侧杂交的序列的夹板多核苷酸作为支架。即，夹板多核苷酸中包含与连结体的5'末端侧的序列互补的序列以及与邻接于其的候选RNA分子的3'末端侧的序列互补的序列。通过例如使用T4 DNA连接酶的反应，将经由夹板多核苷酸而连结的候选RNA分子与连结体加以连接(结合)。此外，由于步骤(2)中使用的RNA聚合酶的特性，而以任意的频率(例如50％左右)，在候选RNA分子的3'末端添加一个～数个碱基。因此，所制作的文库中有在3'末端添加有一个～数个碱基的候选RNA分子。由于所述3'末端序列的不均匀性，连接效率可下降。继而，进行纯化，将未连接的候选RNA分子去除。此处，若将未连接的候选RNA分子去除，则生成在步骤(4)中不与RNA形成复合体的肽，当与步骤(6)中的结合配偶体接触时，获得目标的候选RNA-肽复合体的效率下降。

(4)继而，在无细胞翻译系统中将候选RNA分子加以翻译，来制作所述候选RNA分子与对应的候选肽经由所述连结体而连结的候选RNA-肽复合体。继而，为了可进行步骤(5)的逆转录反应而将无细胞翻译系统中的夾雑物(高浓度的Mg或K等)去除，为此进行纯化。

(5)继而，以防止由核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)所引起的分解等为目的，而进行逆转录反应，将候选RNA-肽复合体中的候选RNA分子部分设为与DNA(cDNA)分子的双链。借此制作候选RNA-肽复合体的文库。

(6)继而，使候选RNA-肽复合体的文库与结合配偶体(例如固定于固体支持体上的抗体等)接触，来进行结合反应。未与结合配偶体结合的候选RNA-肽复合体利用例如缓冲剂等进行洗涤而去除。

(7)继而，使候选RNA-肽复合体与结合配偶体解离，将候选RNA-肽复合体回收。如上所述，从候选RNA-肽复合体的文库中挑选出所需的RNA-肽复合体。

(8)继而，利用PCR法来进行cDNA的扩增。使用所述扩增产物，返回至步骤(2)，重复同样的操作，将目标的候选RNA-肽复合体加以浓缩。

(本实施方式的方法)

参照图1的(B)，对使用本实施方式所涉及的方法的mRNA展示法进行详细说明。

[步骤1]

步骤1中，准备候选DNA分子的文库，其包含多个不同的候选DNA分子，所述候选DNA分子包含启动子区域以及对位于其下游的候选肽进行编码的区域，且在最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物。

本说明书中所谓“肽”，是指两个以上的氨基酸通过肽键而结合的化合物。氨基酸的数量并未限定，例如可以是2个～1000个，优选为4个～200个，更优选为6个～100个，进而优选为7个～10个。肽可以是例如蛋白质的片段或全长。一例中，肽可以是抗体(scFv等)或者其片段。

候选DNA分子可以是序列已知的分子，也可以是序列未知的分子。所述序列可以是以作为基因组信息而存在于自然界中的序列为基础的序列(例如将存在于自然界中的mRNA进行逆转录而成的cDNA)，也可以是人为设计的序列。例如，可具有通过有机合成而随机合成的序列，也可以是通过利用PCR法的随机变异的插入，将序列未知的蛋白质进行编码而成的序列。

候选DNA分子包含对候选肽进行编码的区域。另外，候选DNA分子视需要而包含用以将反义链作为模板来进行转录的区域(转录控制区域)。转录控制区域例如可列举启动子区域。这些转录控制区域只要根据步骤2的转录反应中使用的RNA聚合酶的种类来适当选择即可。一例中，启动子区域可以是T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶所识别的启动子(T7启动子、SP6启动子或T3启动子)。

包含启动子区域以及对位于其下游的候选肽进行编码的区域的候选DNA分子只要通过转录反应来生成对肽进行编码的候选RNA分子，则可为单链，也可为双链，它们也可以混合存在(一部分为双链，此外为单链)。

详细而言，候选DNA分子中的启动子区域只要从对位于下游的候选肽进行编码的区域，来转录对候选肽进行编码的候选RNA分子，则可为单链，也可为双链，它们也可以混合存在，例如启动子区域的一部分可由单链(有义链或者反义链)构成，其以外的部分可为双链。如上所述，一部分由单链(有义链或反义链)构成的启动子区域也包含于本说明书的“启动子区域”中。若启动子区域不显示启动子活性，则转录对候选肽进行编码的候选RNA分子。启动子活性可利用所述领域中公知的方法来测定。另外，对候选肽进行编码的候选RNA分子被转录，这能够通过利用所述领域中的公知方法来检测RNA分子或者对通过翻译而生成的肽进行检测等来确认。

进而，候选DNA分子中的对候选肽进行编码的区域只要利用位于上游的启动子区域的作用，来转录对候选肽进行编码的候选RNA分子，则可为单链，也可为双链，它们也可以混合存在，例如，也可以是编码区域的整体为单链(有义链或反义链)。由于将反义链的序列作为模板来转录候选RNA分子，故而对候选肽进行编码的区域优选为至少包含反义链。如上所述的一部分或全部由单链(有义链或反义链)构成的区域也包含于本说明书的“对肽进行编码的区域”中。对候选肽进行编码的区域至少包含反义链，由于在候选DNA分子的最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物，因此也优选。

候选DNA分子视需要包含用以将候选RNA分子进行翻译的序列。用以将候选RNA分子进行翻译的序列只要根据步骤4中使用的核糖体的种类来适当选择即可。在利用源自大肠杆菌的核糖体来作为无细胞翻译系统的情况下，通过在起始密码子的上游包含作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno(SD)序列，翻译反应的效率上升。在使用源自真核生物的无细胞翻译系统的情况下，也可具有促进翻译的起始的Kozak序列。另外，在步骤2的转录反应时，也能够在5'末端添加7-甲基化鸟苷帽结构。除此以外，用以进行转录的序列以及用以进行翻译的序列可由本领域技术人员来适当选择。

后述的步骤2中，进行候选DNA分子的转录。转录的方法并无特别限定，于在一个反应系统内进行候选DNA分子的文库中的所有候选DNA分子的转录的情况下，转录控制区域的序列优选为在候选DNA分子的文库中的所有候选DNA分子间相同。另外，在后述的步骤4中，进行候选RNA分子的翻译。翻译的方法并无特别限定，于在一个反应系统内进行候选RNA分子的文库中的所有候选RNA分子的翻译的情况下，用以将候选RNA分子进行翻译的序列优选为在候选DNA分子的文库中的所有候选DNA分子间相同。另外，在后述的步骤3中，将夹板多核苷酸作为支架，将候选RNA分子的3'末端与连结体的寡核苷酸的5'末端连接。于在一个反应系统内进行候选RNA分子的文库中的所有候选RNA分子的连接的情况下，与用以与夹板多核苷酸杂交的候选RNA分子的3'末端侧的序列对应的序列优选为在候选DNA分子的文库中的所有候选DNA分子间相同。因此，候选DNA分子的文库中的所有候选DNA在优选的一例中，(a)转录控制区域的序列、(b)用以将候选RNA分子进行翻译的序列、以及(c)与用以与夹板多核苷酸杂交的候选RNA分子的3'末端侧的序列对应的序列中的一个、两个、或三个全部相同。

另外，候选DNA分子的文库中的所有候选DNA在更优选的一例中，开放阅读框(openreading frame，ORF)区域以外的序列相同。在将存在于自然界中的mRNA进行逆转录的cDNA的文库的制备中，在人工设计的DNA的文库的制备中，均可使用共通的引物对来进行DNA的扩增、使用共通的转录系统而由DNA转录为RNA、以及/或者使用共通的翻译系统而由RNA翻译为肽，因此在文库中所包含的所有候选DNA间，较ORF区域而言，在5'末端侧设置共通序列，且在3'末端侧设置其他共通序列的技术已公知。

本实施方式的方法中的特征之一为在候选DNA分子的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物。优选为包含连续的两个2'-修饰核苷衍生物。2'-修饰核苷衍生物之一优选为位于候选DNA分子的反义链的从5'末端起的第二个位置，在存在两个以上的2'-修饰核苷衍生物的情况下，优选为其中一个位于5'末端。或者，2'-修饰核苷衍生物之一也可位于候选DNA分子的反义链的5'末端。

反义链的5'末端是夹持着对肽进行编码的区域而与启动子区域相反的一侧。因此，反义链中，从3'末端侧起，以(启动子区域)-(对候选肽进行编码的区域)-(2'-修饰核苷衍生物)的顺序来配置(但，中间也可包含其他序列)。因此，2'-修饰核苷衍生物位于转录方向上的下游。

2'中的修饰并无特别限定，例如可列举：碳数1～10的烷氧基、卤素、以及碳数1～10的酯基等。

2'-修饰核苷衍生物优选为：2'-O-甲基核苷(例如2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基尿苷、以及2'-O-甲基肌苷等)，更优选为2'-O-甲基鸟苷。2'-O-甲基鸟苷(Gm)是由下述结构式所表示。

[化1]

如上所述的候选DNA的制造方法并无特别限定，但作为一例，可列举：使用5'末端侧的至少一个核苷取代为2'-修饰核苷衍生物的反向引物以及通常的正向引物，对未取代为2'-修饰核苷衍生物的候选DNA分子的文库进行PCR反应。所述反向引物优选为5'末端的核苷以及从5'末端起第2个的核苷均取代为2'-修饰核苷衍生物。

[步骤2]

步骤2中，将所述候选DNA分子作为模板进行转录，来制作所对应的候选RNA分子的文库(“步骤(i)”的一形态)。

转录只要利用公知的方法来进行即可。通常，转录在原位或体外进行，优选为在体外进行。于在体外进行的情况下，RNA聚合酶的种类并无特别限定，例如，优选为可列举T7RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶等来自噬菌体的RNA聚合酶，更优选为T7 RNA聚合酶。

此处，本实施方式中，在成为RNA的模板的反义链的5'末端侧，存在至少一个2'-修饰核苷衍生物。借此，与DNA模板不对应的一个～数个碱基添加于RNA的3'末端的现象减少。因此，依据本实施方式，即便使用如上述所列举的容易产生碱基添加的RNA聚合酶，也能够有效地减少碱基添加。优选的一例中，候选RNA分子的文库中的60％以上、70％以上、80％以上、或者90％以上的候选RNA分子未添加碱基。

在优选的一例中，候选RNA分子的文库中的所有候选RNA的(a)转录控制区域的序列、以及(b)用以与夹板多核苷酸杂交的3'末端侧的序列中的一者或两者相同。

现有方法中，由于所使用的RNA聚合酶的特性，而于候选RNA分子的3'末端添加一个～数个碱基，因此存在步骤3中的连结体的结合效率下降的问题。为了解决所述问题而开发出如下方法：使在3'末端结合有嘌呤霉素的连结体互补地杂交于候选RNA的3'末端周边部分，接着通过使用T4 RNA连接酶的连接，将两者连结而形成发夹结构。另外，还考虑通过分辨率高的电泳来进行文库的纯化，将添加有一个～数个碱基的候选RNA分子去除。另一方面，本实施方式的方法中，即便不进行纯化，也能够在后述的步骤3中更简便且高效率地结合肽受体分子。

[步骤3]

步骤3中，在候选RNA分子的3'末端，使用夹板多核苷酸作为支架来结合肽受体分子(“步骤(ii)”的一形态)。

“肽受体分子”只要是能够与经翻译的肽连结的分子，则并无特别限定，例如可列举：嘌呤霉素、嘌呤霉素衍生物、寡RNA·氨基酸复合体(例如WO2011/049157中记载的肽受体区域)等公知的分子。嘌呤霉素(Pu)是由下述结构式所表示。

[化2]

候选RNA分子的3'末端与嘌呤霉素通常经由包含寡核苷酸的连结体来结合。对寡核苷酸的长度并无特别限定，例如包含10个～30个左右、优选为15个～20个的核苷酸。寡核苷酸中的核苷酸可列举DNA、RNA、PNA、LNA等。连结体除了寡核苷酸以外，也可以进而插入其他物质(例如聚乙二醇(PEG))。PEG的长度并无特别限定，一例中，优选为将主链的原子数为6个～18个的PEG连结3个～10个而成。连结体在一例中可以是5'-(寡核苷酸)-(PEG)-(肽受体分子)-3'的结构。这种连结体只要利用公知的方法来制作即可。

夹板多核苷酸包含：可与候选RNA分子的3'末端侧杂交的序列、以及可与连结体的寡核苷酸的5'末端侧杂交的序列。因此，若使候选RNA分子、包含肽受体分子及寡核苷酸的连结体、以及夹板多核苷酸共存，则在夹板多核苷酸的5'末端侧杂交候选RNA分子的3'末端侧，且在夹板多核苷酸的3'末端侧杂交寡核苷酸的5'末端侧。而且，例如使用DNA连接酶(T4DNA连接酶等)或者RNA连接酶(T4 RNA连接酶等)等，将候选RNA分子的3'末端与寡核苷酸的5'末端连接。

夹板多核苷酸中的核苷酸可列举DNA、RNA、PNA、LNA等。从还能够作为逆转录时的引物来使用的观点而言，一例中优选为DNA。

夹板多核苷酸例如是包含14个～40个左右的连续的核苷酸而构成。一例中，夹板多核苷酸的5'末端侧的例如7个～20个左右、优选为9个～15个的连续的核苷酸与候选RNA分子的3'末端侧的序列杂交，夹板多核苷酸的3'末端侧的例如7个～20个左右、优选为9个～15个的连续的核苷酸与连结体的寡核苷酸的5'末端侧的序列杂交。特别优选的一例中设计为：在杂交于夹板多核苷酸中的状态下，在候选RNA分子的3'末端、与连结体的寡核苷酸的5'末端之间不存在核苷酸的缺口。

本实施方式中，如上所述，由于候选RNA中的碱基的添加减少，故而连接效率提高。因此，不需要进行用以将不与肽受体分子结合的候选RNA分子去除的纯化。另一方面，现有方法中连接效率低，必须将未连接的候选RNA分子去除。若去除，则在翻译时生成不与RNA形成复合体的肽，然后与结合配偶体接触时，获得目标的候选RNA-肽复合体的效率下降。通过省略这种纯化步骤，能够降低比较不稳定的RNA分子分解的可能性。

[步骤4]

步骤4中，通过将步骤3中所获得的结合有肽受体分子的候选RNA分子进行翻译，来制作候选RNA分子、与编码于所述候选RNA分子中的候选肽经由肽受体分子而连结的候选RNA分子与候选肽的复合体(候选RNA-肽复合体)的文库(“步骤(iii)”的一形态)。

翻译优选为在无细胞翻译系统中进行。无细胞翻译系统可列举：使用小麦胚芽或兔网织红细胞等的提取液的无细胞翻译系统、以及在使用大肠杆菌的核糖体的系统中将翻译所需的因子分别纯化而混合的再构成型的无细胞翻译系统等(H.F.Kung、B.Redfield、B.V.Treadwell、B.Eskin、C.Spears及H.Weissbach(1977)，“DNA指导的β-半乳糖苷酶的体外合成，利用纯化因子的研究(DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase.Studies with purified factors)”，《生物化学杂志》(The Journal ofBiological Chemistry)Vol.252,No.19,6889-6894；M.C.Gonza、C.Cunningham及R.M.Green(1985)，“由重建翻译所需的大肠杆菌而来的因子的分离及作用点(Isolationand point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstructtranslation)”，《美国国家科学院院刊》(Proceeding of National Academy of Sciencesof the United States of America)Vol.82,1648-1652；M.Y.Pavlov及M.Ehrenberg(1996)，“优化的体外系统中的天然mRNAs的翻译率(Rate of translation of naturalmRNAs in an optimized in Vitrosystem)”，《生物化学与生物物理文献》(Archives ofBiochemistry and Biophysics)Vol.328,No.1,9-16；Y.Shimizu、A.Inoue、Y.Tomari、T.Suzuki、T.Yokogawa、K.Nishikawa及T.Ueda(2001)，“用纯化的组分重建的无细胞翻译(Cell-free translation reconstituted with purified components)”，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)Vol.19,No.8,751-755；H.Ohashi、Y.Shimizu、B.W.Ying及T.Ueda(2007)，“基于利用纯化组分的核糖体展示系统的高效蛋白质选择(Efficientprotein selection based on ribosome display system with purifiedcomponents)”，《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochemical and BiophysicalResearch Communications)Vol.352,No.1,270-276)。所谓再构成型的无细胞翻译系统，是指通过将主要使用大肠杆菌提取液的无细胞翻译系统加以细分，再构成各因子，从而去除与翻译无关的成分的系统，较使用现有的细胞提取液的无细胞翻译系统而言，能够容易防止核酸酶或蛋白酶等抑制物质的混入。优选的无细胞翻译系统可列举PURE系统。

无细胞翻译系统优选为实质上不包含核酸酶(特别是RNase)。本说明书中所谓“实质上不包含核酸酶”，是指在测定核酸酶活性的情况下，表示核酸酶活性的数值为一定程度以下。核酸酶活性的测定方法公知，例如，可将荧光强度的变化作为指标，来检测经荧光标记的RNA基质的利用RNase的分解。一例中，无细胞翻译系统优选为实质上不包含RNase。通过实质上不包含核酸酶(特别是RNase)，RNA分子被分解的顾虑减少，因此不需要进行先前在步骤4之后进行的逆转录反应。

另外，无细胞翻译系统优选为实质上不包含对候选DNA分子具有活性的RNA聚合酶。本说明书中所谓“对候选DNA分子具有活性的RNA聚合酶”，是指能够对候选DNA分子进行转录反应的RNA聚合酶。例如可列举与候选DNA中所含的启动子对应的RNA聚合酶，且其未失去活性。通过实质上不包含对候选DNA分子具有活性的RNA聚合酶，不需要在步骤4之前去除候选DNA分子以及未经连接的候选RNA分子。

另外，无细胞翻译系统优选为实质上不包含蛋白酶。本说明书中所谓“实质上不包含蛋白酶”，是指在测定蛋白酶活性的情况下，表示蛋白酶活性的数值为一定程度以下。蛋白酶活性的测定方法公知，例如可将荧光强度的变化作为指标，来检测经荧光标记的酪蛋白的利用蛋白酶的分解。通过实质上不包含蛋白酶，经翻译的肽被分解的情况减少。

构成候选肽的氨基酸可以是天然型的氨基酸，也可以是非天然型的氨基酸。

本实施方式中，一例中，在从候选RNA分子翻译而来的候选肽的C末端连结肽受体分子，来制作候选RNA分子与所对应的候选肽经由肽受体分子而连结的候选RNA-肽复合体。在肽受体分子为嘌呤霉素的情况下，嘌呤霉素作为核糖体中的转肽反应的基质而连结于伸长中的肽链的C末端。一例中，可以是RNA分子-(任意的连结体)-肽受体分子-候选肽的结构。

在使用不包含RNase及/或蛋白酶的无细胞翻译系统的优选一例中，不需要在步骤4之后进行纯化。

一例中，步骤4中制作的候选RNA-肽复合体未提供给逆转录反应，因此候选RNA-肽复合体的文库的候选RNA为单链。

[步骤5]

步骤5中，使候选RNA-肽复合体的文库与结合配偶体接触，进行结合反应。

结合反应可基于以下结合，例如：抗原与抗体的结合、蛋白质受体与配体的结合、粘附分子与对方分子的结合、酶于基质的结合、核酸与结合于其中的蛋白质的结合、信号转导系统中的蛋白质彼此之间的结合、糖蛋白质与蛋白质的结合、或者糖链与蛋白质的结合等。结合配偶体只要根据选择的目的来适当选择即可。结合配偶体例如可固定为固相，也可由俘获为固相的物质来标记。固相只要是能够与结合配偶体结合者即可，固相的形状科列举板状、棒状、粒子状、或者珠粒状等。固相能够使用对筛选时所使用的介质即水或有机溶剂不溶的原材料。例如可列举：塑料、玻璃、聚苯乙烯等树脂、金属薄膜等将金属用于固相的原材料。也能够使用磁珠等。此外，一个反应系统中所包含的结合配偶体可以是1种，也可以是多种。

不与结合配偶体结合的候选RNA-肽复合体只要利用例如缓冲剂等进行洗涤而去除即可。

[步骤6]

步骤6中，进行逆转录反应，将候选RNA-肽复合体中的候选RNA分子部分设为与DNA(cDNA)分子的双链。本实施方式中，逆转录反应能够在通过溶出等而从结合配偶体中解离后进行，也能够以结合于结合配偶体中的状态来进行。通过以结合于结合配偶体中的状态来进行，具有能够抑制通过RNA(适体)而结合的cDNA的优点。逆转录反应只要利用例如通常的方法来进行即可。本实施方式中，由于在步骤5之后进行逆转录反应，故而具有不需要在步骤5之前进行用于逆转录反应的纯化的优点。因此，不会产生现有方法中的问题，即，通过纯化，候选RNA分子的多样性减少。

[步骤7]

步骤7中，使候选RNA-肽复合体与结合配偶体解离，将候选RNA-肽复合体回收。解离的方法只要根据与结合配偶体的结合的种类来适当选择即可。例如可利用：无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶，或者IdeS、IdeZ等抗体序列特异性蛋白酶。如上所述进行步骤5～步骤7，从候选RNA-肽复合体的文库中挑选所需的RNA-肽复合体(“步骤(iv)”的一形态)。

[步骤8]

然后，挑选出的RNA-肽复合体也可进行RNA及/或肽的序列等。分析能够利用通常的氨基酸序列测序仪来进行，也能够通过从如上所述结合于肽上之RNA来逆转录DNA，将所获得的cDNA的碱基序列进行分析来进行。另外，也可适当进行纯化或定量。

另外，也能够使用此处所获得的cDNA来进行所述步骤1。例如，使用5'末端的至少一个核苷取代为2'-修饰核苷衍生物的反向引物以及通常的正向引物，对此处所获得的cDNA或者其扩增产物进行PCR反应。接着，使用其中获得的DNA分子来再次进行步骤2～步骤7。通过如上所述反复进行多次步骤1～步骤7的循环，则具有所需性质的候选RNA-肽复合体浓缩。然后，使用其进行分析。

(其他实施方式的方法)

其他实施方式所涉及的方法中，也可将所述实施方式的步骤5与步骤6的顺序加以调换。即，在现有mRNA展示法的步骤4中，将步骤3中所获得的结合有肽受体分子的候选RNA分子翻译后，接着进行相当于步骤6的逆转录反应，将候选RNA-肽复合体中的候选RNA分子部分设为与DNA(cDNA)分子的双链。然后，进行相当于步骤5的使候选RNA-肽复合体的文库与结合配偶体接触的结合反应。

此处，逆转录反应中，通过在试样中添加乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)后进行加热处理，能够提高逆转录反应效率。

(应用例)

可列举：与药物开发的靶标分子相互作用的蛋白质的鉴定、药剂靶标蛋白质的分析、抗体分子的取得或其改变、抗体所识别的抗原蛋白质及其抗原部位的确定、各种功能性蛋白质或肽的改变、疫苗的活性确认等。

尤其，本实施方式是将作为肽选择法之一的mRNA展示法加以改良而成，通过以2'-O-甲基鸟苷对DNA文库的反义链的5'末端进行修饰，来抑制碱基的添加，使mRNA文库的3'末端一致，使与肽受体分子(例如嘌呤霉素)的连结效率飞跃性提高(从约50％至约90％)。进而，通过从无细胞翻译系统(PURE系统)中去除RNA聚合酶，在翻译前，不需要通过纯化·核酸酶处理等来去除模板DNA或不包含嘌呤霉素的mRNA。进而，通过使用不包含RNase的PURE系统，则RNA比较稳定，不再需要在翻译后立即进行的纯化或逆转录反应。因此，可在阳性选择时进行纯化或逆转录，肽选择变得简便。借此，可使用多通道的自动移液器来进行高通量的肽筛选。另外，整体的步骤数少，在作业中可减少RNA的分解及吸附，因此可更高效地进行肽筛选。进而通过并行化，则成本削减。

借此，可通过筛选抗体医药或确定原因不明的疾病的原因来发掘新的药物开发靶标、通过将由疫苗产生的有效抗体定量化来支持高效疫苗的开发、通过免疫分析来确认健康状态、将疾病分类等。另外，还促进少数疾病的研究。如此一来，本实施方式的方法可应用于广泛的用途。

(本发明所涉及的具体形态的例示)

步骤(i)：其是通过包含启动子区域以及对位于其下游的肽进行编码的区域的DNA分子进行转录反应来制作RNA分子的步骤，且在所述DNA分子的最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物的步骤；

(2)如(1)所述的方法，其中所述翻译是在实质上不包含RNase的体外翻译系统中进行。

(3)如(1)或(2)所述的方法，其中所述翻译是在实质上不包含对所述DNA分子具有活性的RNA聚合酶的体外翻译系统中进行。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的方法，其中所述DNA分子包含连续的两个2'-修饰核苷衍生物。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的方法，其中所述2'-修饰核苷衍生物为2'-O-甲基鸟苷。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的方法，其中所述肽受体分子为嘌呤霉素。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的方法，其中使用多个不同的所述DNA分子，来制作多个不同的RNA分子与肽的所述复合体。

(8)一种mRNA展示法，其包括如(1)～(7)中任一项所述的方法，

其包括步骤(iv)，即，从步骤(iii)中所获得的RNA分子与肽的复合体中挑选所需的复合体。此外，在进行步骤(iv)之前，所述RNA分子与肽的复合体中的RNA分子部分的其至少一部分也可与互补的DNA(cDNA)分子形成双链结构。

(9)如(8)所述的方法，其中将步骤(i)～步骤(iv)作为一个循环，反复进行多个循环。

(10)一种DNA文库，其用于mRNA展示法，

其包含多个不同的候选DNA分子，所述候选DNA分子包含启动子区域以及对位于其下游的候选肽进行编码的区域，且在最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物。

(11)如(10)所述的DNA文库，其中包含10¹³个以上的不同的候选DNA分子。

以下示出实施例，对本发明的实施方式进一步进行详细说明。当然，本发明并不限定于以下的实施例，且毋庸置疑，在细节处可为各种形态。进而，本发明并不限定于所述实施方式，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，将分别公开的技术手段适当组合而获得的实施方式也包含于本发明的技术范围内。另外，本说明书中所记载的文献全部作为参考来引用。本申请案主张在2017年3月17日提出的日本专利申请：日本专利特愿2017-053621的优先权的利益，且参照其，其内容全部包含于本说明书中。

[实施例]

[实施例1：从实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)模型小鼠的血清中探索抗原肽]

[方法]

(1)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠抗体磁珠的制作

使用完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)，用MOG35-55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)来免疫C57B6小鼠(10周龄)。免疫后20天～22天回收全血，与等量的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)混合，使用菲可(ficoll)来分离血清成分。在4℃下以1小时使100μL的血清结合于100μL的蛋白质G磁珠(dynabeads)。将其以500μL的洗涤缓冲剂(50mM Tris-HCl(pH值为7.5)、300mM NaCl、0.1％的曲通X-100)来洗涤5次，来制作固定有EAE小鼠抗体的磁珠。

(2)文库DNA的制作

将包含随机ORF区域的10nM的随机文库DNA：GCTGCCGCTGCCGCTGCC(MNN)nCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG(n＝8)或者下述(7)中回收的cDNA(第2个循环以后)，使用1μM的正向引物(CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG)以及反向引物(GmGmTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA(Gm：2'-O-甲基鸟苷))，进行PCR(94℃：10秒，58℃：10秒，72℃：30秒，8个循环)。借此，制作包含T7启动子序列、夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno sequence，SD序列)以及随机ORF区域的模板DNA文库：CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(NNK)nTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACC(n＝8)。使用快速基因凝胶/PCR提取试剂盒(FastGene Gel/PCR Extraction Kit)将其纯化。

(3)转录反应

从10nM的模板DNA文库中，以50μL规模(0.086ng的T7 RNA聚合酶、4.5mM的NTP、40mM的HEPES-KOH(pH 7.6)、20mM的MgCl₂、2mM的亚精胺(spermidine)、5mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT))，在37℃下进行1小时转录，制作RNA文库。

(4)嘌呤霉素(Pu)添加

在所获得的RNA文库3μL中，添加10mM的ATP 1μL、100μM的Pu-DNA(CTCCCGCCCCCCGTCC[间隔区18]₅CC[嘌呤霉素])2μL、100μM的夹板-DNA(GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA)2μL、以及x1 T4 DNA连接酶缓冲液13μL，在95℃下加热3分钟。在室温下冷却后，添加0.5μL的T4 DNA连接酶(70U/μL)，在37℃下反应1.5小时。

(5)翻译反应/mRNA-肽文库的制作

使用20μL规模的PURE系统(14μL的溶液A、2μL的溶液B(RNA聚合酶、RF1负)、2μL的50mM Hepes-KOH(pH值为7.6)、100mM的KCl、10mM的MgCl₂、30％的甘油)，使2.4μL的添加嘌呤霉素的RNA文库在37℃下反应1小时。继而，在其中添加30μL的结合缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH值为8.0)、61mM的EDTA)。

(6)肽选择

将(5)中所获得的mRNA-肽文库，添加于固定有来自健康小鼠的抗体的蛋白质G磁珠(dynabeads)10μL中，在4℃下反应30分钟。将上清液添加于结合有来自EAE小鼠的抗体的磁珠10μL中，在4℃下反应30分钟。将磁珠以50μL的洗涤缓冲剂(50mM的Tris-HCl(pH值为7.5)、300mM的NaCl、0.1％的曲通X-100)来洗涤8次。

(7)逆转录反应

在磁珠中添加包含200μM的三磷酸脱氧核苷酸(deoxyribonucleotidetriphosphate，dNTP)、1mM的DTT、200nM的引物P2(GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA)0.5μL、ProtoScriptII RTase 200 U的1x ProtoScript缓冲液，在37℃下反应30分钟。去除上清液，以50μL的洗涤缓冲液来洗涤1次。

(8)溶出

添加50μL的溶出缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH值为8.0)、75mM的KCl、0.1％的曲通X-100、10mM的DTT)。将其在97℃下加热3分钟，回收上清液。

使用biomek FX，将所述(3)～(8)进行5个循环，使用引物-F2：CCGAAGGAGATATACATATG、引物-R2：ANNCTGCCGCTGCCGCTGC(N＝A,G,C,T)来进行PCR，使用HiSeq2500，以single reed 80base来进行定序。

[结果]

将结果示于图2中。(A)表示在肽选择中获得的肽序列与针对MOG蛋白质的评分。等级2的第7个为终止密码子，推定为仅第1个～第6个的序列被翻译。(B)表示EAE小鼠抗体的MOG蛋白质的识别部位。(C)表示EAE小鼠抗体的抗原的基元序列。从图2中了解到，由所获得的氨基酸序列来获得与MOG35-55肽的一部分的相同性高的基元序列。另外，为检测出针对MOG蛋白质的其他部位的序列，成功地特异性获得成为疾病原因的肽。

[实施例2：利用2'-O-甲基鸟苷的肽选择的效率化]

(1)DNA的制作

制作在10nM的FLAG肽模板双链DNA：GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGAAGTACTCCCCAACCGACTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACC的反义链的5'末端的两个碱基上导入有鸟苷(WT)或者2'-O-甲基鸟苷(Gm)的模板DNA。

(2)转录反应

以20μL规模(0.086ng的T7 RNA聚合酶、4.5mM的NTP、40mM的HEPES-KOH(pH值为7.6)、20mM的MgCl₂、2mM的亚精胺、5mM的DTT)，使各个模板DNA(10nM)在37℃下反应1小时，使用Qubit，将经转录的mRNA定量。

(3)肽选择

使用抗FLAG(注册商标)M2抗体磁珠(西格玛M8823)，以与实施例1相同的方式，对各为1μM的mRNA、固相载体进行使用Biomek FX的选择，使用qPCR将所获得的cDNA定量。

[结果]

将结果示于图3中。(A)表示利用模板DNA的肽回收效率。(B)表示利用qPCR的cDNA的标准曲线。如根据图3所算出，确认到，通过使用导入有2'-O-甲基鸟苷(Gm)的模板DNA，肽选择的效率提高10倍左右。

[实施例3：与现有方法的比较]

制作对终止密码子的下游的仅与Pu-DNA的连结中所使用的序列(下线部)不同的3种FLAG肽进行编码的双链DNA，来验证使用各种FLAG肽的肽选择的效率。

[表1]

实验1：mRNA/Pu-DNA的连接效率的验证

使用T7 RNA聚合酶，由所述模板DNA来制作mRNA。使用Qubit(注册商标)RNA HS分析试剂盒，将RNA定量，分别制备为7μM。来自模板DNA 1的RNA是与包含10μM的Pu-DNA(CTCCCGCCCCCCGTCC[间隔区18]₅CC[嘌呤霉素])、1mM的ATP的x0.6 T4RNA连接酶缓冲液(附加)15μL混合，在95℃下进行2分钟加热，在室温下冷却。然后，添加1μL(10U)的T4 RNA连接酶1(NEB公司制造)，在37℃下反应1.5小时。来自模板DNA 2、3的RNA(3μL)是与包含5μM的Pu-DNA、5μM的夹板-DNA(GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA)的x0.6 T4 DNA连接酶缓冲液(附加，含有1mM的ATP)15μL混合，在95℃下加热2分钟，在室温下冷却。然后，添加1μL(400U)的T4DNA连接酶(NEB公司制造)，在37℃下反应1.5小时或者在16℃下反应一晩(16小时)。分别将0.5μL，在7M的脲10％PAGE中进行电泳(180V，45min)。mRNA/Pu-DNA连结部位的结构是如图4的(A)所示。

将结果示于图4的(B)及(C)中。(B)表示在37℃下反应1.5小时的情况下的mRNA/Pu-DNA的连接效率。(C)表示在16℃下反应一晩的情况下的mRNA/Pu-DNA的连接效率。如图4的(B)及(C)所示，可知不论为哪一种条件，mRNA/Pu-DNA的连接效率均为模板DNA 3＞模板DNA 1＞模板DNA 2，在模板DNA中使用Gm者的效率最佳。由于模板DNA 3的效率高于模板DNA1，故而在模板1中的发夹结构形成时，嘌呤霉素的配置不在分子的末端侧，而是在内侧，这暗示着引起效率下降的可能性。

实验2：肽回收效率的验证

在实验1中使用的各个mRNA(7μM)、固相载体中使用10μL的抗FLAG(注册商标)M2抗体磁珠(西格玛M8823)，以与实施例2相同的方式来进行使用Biomek FX的选择，使用qPCR将所获得的cDNA定量。此外，使用模板DNA 1来进行肽选择时，使用T4 RNA连接酶1(NEB公司制造)。

将结果示于图4的(D)中。(D)表示使用各模板DNA的肽选择效率。已知，在模板DNA中使用Gm者(模板DNA 3)的肽回收率最高，对于RNA聚合酶的流失(run-off)(对末端添加碱基)产物，较通过发夹结构形成(模板DNA 1)来进行mRNA/Pu-DNA的连接而言，非常高效的是使用Gm来进行连接。mRNA的回收率以模板DNA 1～3的顺序，分别为1.3％、1.4％、11.8％。

[实施例4：使用蛋白酶的肽回收方法]

[方法]

以与实施例2相同的条件，来制作FLAG肽-cDNA，对从抗FLAG(注册商标)M2抗体磁珠(西格玛M8823)中回收cDNA的方法进行研究。

对磁珠添加10μL的无花果蛋白酶缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH值为6.8)、10mM的EDTA、5mM的半胱氨酸)、0.1mg～2mg的无花果蛋白酶(西格玛：F4125)，在37℃下静置1小时。将上清液在98℃下加热5分钟，使无花果蛋白酶失去活性，利用qPCR将溶出的cDNA定量。另外，残留于珠粒上的cDNA量是通过在无花果蛋白酶缓冲液中，以98℃加热5分钟而回收，利用qPCR进行定量。图5是对实施例4中的使用蛋白酶的cDNA的溶出方法进行说明的图。

将结果示于图6中。从图6中获知，确认通过使用0.1mg以上的无花果蛋白酶，且通过使用95％以上、0.75mg，能够将99％以上的cDNA溶出。同样，也可利用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶，或者IdeS、IdeZ等抗体序列特异性的蛋白酶。

[实施例5：解码法的另一例]

[方法]

使用与实施例2相同的模板DNA，以20μL规模来制作FLAG肽-mRNA复合体。将其分割为1/4量，在3个样品中添加0.23μL的EDTA(0.5M)，在25℃下静置10分钟或者在50℃下静置10分钟，或者在95℃下静置1分钟。向其中添加0.33μL的MgCl₂(0.5M)，添加包含20μL的逆转录混合物(1mM的dNTP、10mM的DTT 0.2μM引物P2(GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA)0.125μL、ProtoScriptII RTase 100μL的1x ProtoScript缓冲液)，在37℃下反应40分钟。使其在1μL的抗FLAG M2抗体磁珠(西格玛：M8823)中，在室温下进行30分钟结合反应，以50μL的洗涤缓冲剂来洗涤10次。向其中添加30μL的溶出缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH值为8.0)、75mM的KCl、0.1％曲通X-100、10mM的DTT)，在97℃下加热3分钟，迅速回收上清液，利用qPCR进行定量。剩余的1个样品是添加20μL的结合缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH值为8.0)、61mM EDTA)，与1μL的抗FLAG M2抗体磁珠(西格玛：M8823)在室温下进行30分钟结合反应，利用50μL的洗涤缓冲剂来洗涤10次。向其中添加30μL的溶出缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH值为8.0)、75mM的KCl、0.1％曲通X-100、10mM的DTT)，在97℃下加热3分钟，迅速回收上清液，利用qPCR进行定量(对照(control))。

将本实施例中进行的解码法作为图7来图示。

[结果]

将结果示于图8中。从图8中获知，也可利用如下程序的解码法，即，在翻译后立即进行cDNA合成，然后进行与抗体的结合反应；通过在添加EDTA后以高温进行处理，能够期待若干的效率化。

[产业上的可利用性]

本发明例如可在以抗体药物为代表的分子靶向药物等的药物开发领域中利用。

序列表

<110> 珂璧斯塔斯株式会社

<120> RNA分子与肽的复合体的制造方法及其利用

<130> FSP1V191825ZX

<150> JP2017-053621

<151> 2017-03-17

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 1

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys

20

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机文库DNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(42)

<223> n = a, g, c或t ； m = a或c

<400> 2

gctgccgctg ccgctgccmn nmnnmnnmnn mnnmnnmnnm nncatatgta tatctccttc 60

ttaaag 66

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

cctaatacga ctcactatag ggttaacttt aagaaggaga tatacatatg 50

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 经修饰的碱基

<222> (1)..(2)

<223> gm

<400> 4

ggtcggcgga tcaaagtagc tgccgctgcc gctgccgca 39

<210> 5

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 随机DNA文库

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(74)

<223> n = a, g, c或t；k = g或t

<400> 5

cctaatacga ctcactatag ggttaacttt aagaaggaga tatacatatg nnknnknnkn 60

nknnknnknn knnktgcggc agcggcagcg gcagctactt tgatccgccg acc 113

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pu-DNA

<400> 6

ctcccgcccc ccgtcc 16

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 夹板DNA

<400> 7

gggcgggagg gtcggcggat caa 23

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggtcggcgga tcaaagtagc tgccgctgcc gctgccgca 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccgaaggaga tatacatatg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n is a, g, c或t

<400> 10

annctgccgc tgccgctgc 19

<210> 11

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Flag DNA

<400> 11

ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaacaagga gaaaaacatg aagtactccc 60

caaccgactg cggcagcggc agcggcagct actttgatcc gccgacc 107

<210> 12

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板DNA 1

<400> 12

cctaatacga ctcactatag ggttaacttt aagaaggaga tatacatatg aagtactccc 60

caaccgactg caagaaggac tacaaggacg acgacgacaa gtgcggcagc ggcagcggca 120

gctaggacgg ggggcggaaa 140

<210> 13

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板DNA 2及3

<400> 13

cctaatacga ctcactatag ggttaacttt aagaaggaga tatacatatg aagtactccc 60

caaccgactg caagaaggac tacaaggacg acgacgacaa gtgcggcagc ggcagcggca 120

gctactttga tccgccgacc 140

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 14

Lys Ser Pro Phe Ser Arg Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 15

Arg Ser Pro Phe Asn Arg

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 16

Tyr Ser Ser Pro Phe Asn Arg Lys

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 17

His Arg Ser Pro Phe Asn Arg Lys

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 18

Ile Ser Glu Tyr Lys Leu Arg Leu

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 19

Lys Ser Pro Phe Ser Arg Leu Thr

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 20

Ser Pro Phe Ser Arg Leu Thr Cys

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 21

Tyr Arg Ser Pro Phe Asn Arg Lys

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 22

Lys Ser Pro Phe Ser Arg Leu Thr

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从随机DNA导出的肽

<400> 23

Ser Pro Phe Ser Arg Leu Thr Ser

1 5

Claims

1.一种RNA分子与肽的复合体的制造方法，其制造对肽进行编码的RNA分子、与编码于所述RNA分子中的肽的复合体，其特征在于包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述翻译是在实质上不包含核糖核酸酶的体外翻译系统中进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

所述翻译是在实质上不包含对所述DNA分子具有活性的RNA聚合酶的体外翻译系统中进行。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，

所述DNA分子包含连续的两个2'-修饰核苷衍生物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，

所述2'-修饰核苷衍生物为2'-O-甲基鸟苷。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，

所述肽受体分子为嘌呤霉素。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，

使用多个不同的所述DNA分子来制作多个不同的RNA分子与肽的所述复合体。

8.一种mRNA展示法，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，

包括步骤(iv)，其从步骤(iii)中所获得的RNA分子与肽的复合体中选出所需的复合体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

将步骤(i)～步骤(iv)作为一个循环，反复进行多个循环。

10.一种DNA文库，其用于mRNA展示法，其特征在于，

包含多个不同的候选DNA分子，所述候选DNA分子包含启动子区域以及对位于其下游的候选肽进行编码的区域，且在最下游的反义链的5'末端侧包含至少一个2'-修饰核苷衍生物。

11.根据权利要求10所述的DNA文库，其特征在于，

包含10¹³个以上不同的候选DNA分子。