CN110623975B - 调节TERT基因表达的microRNA328及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调节TERT基因表达的microRNA328及其应用。本发明提供了microRNA328或抑制其表达的物质的用途。本发明发现miR328对Hela细胞TERT mRNA表达水平有显著的抑制作用，miR‑328的寡核苷酸抑制剂对Hela细胞TERT基因mRNA表达水平有显著的上调作用。miR‑328的inhibitor具有显著增加EPC的成血管能力。miR‑328的inhibitor转染的EPC明显抑制NSC向神经胶质细胞分化。研究表明以miRNA为靶点或工具增强端粒酶的活性，为血管性痴呆(vascular dementia,VD)等神经系统疾病治疗提供理论依据，具有潜在的临床应用价值。

Description

调节TERT基因表达的microRNA328及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及调节TERT基因表达的microRNA328及其应用。

背景技术

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指由脑血管疾病引起的脑功能障碍从而产生大脑智能及认知功能障碍的临床综合征，主要表现为学习、记忆、思维等障碍，是继阿尔茨海默病(AD)之后引起痴呆的第二大原因。随着世界人口老龄化进程的加快，VD的患病人数显著增加，流行病学统计，65岁以上老年人患病率达1％-4％，85岁老年人患病率则高达14％-16％。VD在内的老年性痴呆疾病已成为继肿瘤、心脏病、脑中风之后引起老年人死亡的第四大疾病。故寻找抗VD药物及治疗方法成为医学工作者刻不容缓的任务。

神经干细胞(neural stem cells,NSC)的发现，为神经损伤修复带来了新的希望，也有研究表明EPC与NSC共培养，能够为神经发生提供了良好的微环境，提高了NSC 的增殖并促进其向神经元分化。而EPC活性及数量与EPC衰老有关。细胞衰老是由于细胞周期的停滞，细胞复制过程中存在的端粒缩短是最常见的引发衰老的原因。端粒由 DNA和蛋白质组成，位于真核细胞染色体末端，其DNA由特定的重复序列构成。DNA重复序列在不同物种间表达各异。随着染色体复制，端粒长度会缩短，但缩短到一定长度后不会进一步缩短，细胞不能再分裂，呈现出衰老、凋亡改变。端粒酶是一种核糖核蛋白，由3部分组成：端粒酶RNA(telomerase RNA，hTR或TRC)模板、端粒酶相关蛋白(TPI)和端粒酶逆转录酶(telomerasereverse transcriptase，TERT)，具有调节端粒长度、功能和逆转录的活性。而TERT是端粒酶中蛋白成分之一，是端粒酶的催化亚单位，在端粒酶的激活和端粒DNA特异性扩增过程中起重要作用。TERT可通过影响端粒酶活性并进一步延长端粒长度抑制细胞凋亡。当TERT高表达时，可激活端粒酶活性，抑制端粒缩短或者减缓其缩短的速度甚至促进端粒延长，实现抗细胞衰老、凋亡改变效果。EPCs在体外培养条件下存在扩增能力有限，随分化次数增加而再生能力下降，易于衰老的特点。因而调节EPC端粒酶活性进而阻止EPC的衰老，增强其体内外增殖及成血管的功能是值得深思和探讨的问题。

miRNA是一类高度保守的单链非编码小RNA，由约20-22个单核苷酸组成，广泛存在于真核生物中，参与转录后调控。

发明内容

为了治疗由TERT蛋白或基因的表达提高或降低导致的疾病，本发明提供如下技术方案：

本发明一个目的是抑制microRNA328或其编码基因表达的物质的用途。

本发明提供的抑制microRNA328或其编码基因表达的物质在如下A1)-A6)中至少一种或在制备具有如下如下A1)-A6)中至少一种功能的产品中的应用：

A1)提高TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

A2)提高细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

A3)治疗由TERT蛋白活性降低或TERT蛋白编码基因的表达量降低导致的疾病；

A4)提高内皮祖细胞成血管能力；

A5)抑制神经干细胞向神经胶质细胞分化；

A6)治疗神经神经系统疾病；

所述microRNA328为如下B1)或B2)：

B1)序列1所示的核酸；

B2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的核酸分子。

上述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

上述应用中，所述物质为microRNA328抑制剂或microRNA328抑制寡核酸；

在本发明实施例中，microRNA328抑制寡核酸为序列2所示的核苷酸序列(miRNA328的inhibitor),购于广州锐博生物技术有限公司锐博公司，公知该序列是miRNA328的抑制剂。

上述应用中，A2中，所述细胞为肿瘤细胞或神经干细胞；

所述肿瘤细胞具体为宫颈癌细胞，在本发明的实施例为hela细胞；

所述神经神经系统疾病为血管性痴呆病。

本发明第2个目的是提供抑制microRNA328或其编码基因表达的物质。

本发明提供的一种抑制microRNA328或其编码基因表达的物质，为microRNA328抑制剂或microRNA328抑制寡核酸。

在本发明的实施例中，上述microRNA328抑制寡核酸为如下C1)或C2)：

C1)为序列2所示的核酸；

C2)为将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的核酸分子；

C3)含有C1)或C2)所示核酸的编码基因的重组载体、重组微生物或转基因细胞。

本发明第3个目的是提供一种提高细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制细胞中microRNA328或其编码基因的表达，实现提高细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达。

本发明第4个目的是提供一种产品，其包括上述抑制microRNA328或其编码基因表达的物质；

所述产品具有如下A1)-A6)中至少一种功能：

A1)提高TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

A2)提高细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

A3)治疗由TERT蛋白活性降低或TERT蛋白编码基因的表达量降低导致的疾病；

A4)提高内皮祖细胞成血管能力；

A5)抑制神经干细胞向神经胶质细胞分化；

A6)治疗神经神经系统疾病。

上述产品中，所述神经神经系统疾病为血管性痴呆病。

上述抑制神经干细胞向神经胶质细胞分化为在内皮祖细胞与神经干细胞共培养时抑制神经干细胞向神经胶质细胞分化。

本发明第5个目的是提供microRNA328或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、重组微生物或转基因细胞的用途。

本发明提供了microRNA328或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、重组微生物或转基因细胞在如下D1)-D5)中至少一种或在制备具有如下如下D1)-D5)中至少一种功能的产品中的应用：

D1)降低TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

D2)降低细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

D3)治疗由TERT蛋白活性提高或TERT蛋白编码基因的表达量提高导致的疾病；

D4)降低内皮祖细胞成血管能力；

D5)促进神经干细胞向神经胶质细胞分化；

所述microRNA328为如下B1)或B2)：

B1)序列1所示的核酸；

B2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的核酸分子。

上述促进神经干细胞向神经胶质细胞分化为在内皮祖细胞与神经干细胞共培养时促进神经干细胞向神经胶质细胞分化。

本发明第6个目的是提供一种降低细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达的方法。

本发明该目的的方法，包括如下步骤：提高细胞中microRNA328或其编码基因的表达，实现降低细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达。

miRNA328作为靶点或工具在制备或筛选由TERT蛋白或其基因表达降低或提高所导致的疾病药物中的应用也是本发明保护的范围。

或，miRNA328为靶点或工具在制备或筛选神经神经系统疾病药物中的应用也是本发明保护的范围。

上述神经神经系统疾病为血管性痴呆病。

为了寻找出EPC内高度表达的并与TERT基因mRNA序列中作用位点特异结合的miRNA，然后用抑制剂(inhibitor)与miRNAs结合，阻止其与TERT作用位点结合，从而上调TERT的表达，增强端粒酶的活性，促进EPC的再生，并与NSC共移植入血管性痴呆大鼠模型体内，诱导NSC向神经元分化，为血管性痴呆等神经系统疾病治疗提供理论依据，具有潜在的临床应用价值。

本发明发现miR328对Hela细胞TERT mRNA表达水平有显著的抑制作用。miR-328的寡核苷酸抑制剂对Hela细胞TERT基因mRNA表达水平有显著的上调作用。为验证 miR-328对EPC成血管能力的影响实验结果表明，本实验观察了miR-328的inhibitor作用，结果发现具有显著增加EPC的成血管能力，与对照组相比，管状结构增加至 (9.33±2.08)。实验进一步观察了miR-328inhibitor对EPC共培养NSC分化的影响， miR-328的inhibitor转染的EPC明显抑制NSC向神经胶质细胞分化。研究表明以miRNA 为靶点或工具增强端粒酶的活性，为血管性痴呆(vascular dementia,VD)等神经系统疾病治疗提供理论依据，具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为Hela细胞瞬时转染pEZX-MT01-TERT-3'UTR质粒分析microRNA抑制活性。

图2为microRNA对TERT mRNA水平的影响。

图3为microRNA寡核苷酸抑制剂对TERT mRNA水平的影响。

图4为大鼠骨髓来源内皮细胞形态学观察；A.大鼠骨髓单个核细胞在Fn包被的培养皿在内皮细胞培养体系中培养7天后形成的贴壁生长细胞，呈卵园形或多边形；B. 为贴壁细胞Wright‘s Giemsa染色(×200)。

图5为microRNA的mimic和inhibitor对EPC成血管能力的影响(×100)。A、B为microRNA的mimic(Control、miR-328)转染EPC成血管能力观察。C、D为microRNA的inhibitor(Control、miR-328)转染EPC成血管能力观察。E.各组成血管数据统计。 **P<0.01，与对应的mimic组比较。#P<0.5，与control inhibitor比较。

图6为免疫荧光检测microRNA对EPC共培养NSC分化的影响(×100)；**P<0.01，与EPC/miRNA+NSC比较。#P<0.5，与control和EPC+NSC比较。

图7为miRNA328对EPC共培养NSC中TERT蛋白表达的影响(**:P<0.01，***:P<0.001, 与control比较)。

图8为各组逃避潜伏期比较；*与Sham组比较p<0.01。

图9为各组目的象限活动时间比较；*与Sham组比较p<0.01。

图10为各组穿越原站台次数比较；*与Sham组比较p<0.01。

图11为治疗后各组逃避潜伏期比较；*与Sham组比较p<0.01，#与其他治疗组组比较p<0.05。

图12为治疗后各组原站台象限活动时间比较；*与Sham组比较p<0.01，#与其他治疗组比较p<0.05。

图13为治疗后各组穿越原站台次数比较；*与Sham组比较p<0.01，#与其他治疗组比较p<0.05。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中miRNA328的mimic为序列1所示的miRNA328核苷酸序列；

下述实施例中miRNA328的inhibitor为序列2所示的核苷酸序列(购于广州锐博生物技术有限公司，公知该序列是miRNA328的抑制剂)。

实施例1、miRNA328对荧光素酶报告基因表达的活性分析

重组质粒pEZX-MT01-3'UTR为将TERT基因(序列3)插入pEZX-MT01质粒(购于广州复能基因有限公司，货号：CmiT000001-MT01)中海肾荧光素酶报告基因hLuc上游的多克隆位点XhoI与EcoRI之间得到的质粒。

先用转染试剂Lipofecta-mine 2000将重组质粒pEZX-MT01-3'UTR转染Hela细胞，得到转染pEZX-MT01-3'UTR的Hela细胞，6小时后用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX 将50nM的miR328溶液(溶剂为水，溶质为miR328)转染pEZX-MT01-3'UTR的Hela细胞， 48h，得到转pEZX-MT01-3'UTR+miR328的Hela细胞。

酶标仪检测检测转pEZX-MT01-3'UTR+miR328的Hela细胞中荧光素酶报告基因的表达，海肾荧光素酶基因作报告基因，萤火虫荧光素酶基因作为归一化内参，分析 miR328对目的基因的作用。

结果如图1所示，以其他miRNA做对照，发现50nM的miR328在pEZX-MT01-3'UTR报告基因质粒瞬时转染对荧光素酶基因表达活性表现出明显的抑制作用(p<0.01)，表明miR328可以抑制Hela细胞中TERT基因mRNA表达。

实施例2、miRNA328对Hela细胞TERT基因mRNA水平的影响

分别用miRNA328的mimic和inhibitor检测对Hela细胞TERT基因mRNA水平的影响，以不添加任何miRNA328的mimic和inhibitor为对照组。

对照组：hela细胞正常培养至80％融合。

miRNA组：hela细胞培养至80％融合后用Lipofectamine RNAiMAX转染50nMmiRNA328的mimic溶液(溶剂为水，溶质为miRNA328的mimic)，培养48h。

miRNA的抑制剂组：培养至80％融合后用Lipofectamine RNAiMAX转染50nMmiRNA328的inhibitor溶液(溶剂为水，溶质为miRNA328的inhibitor)，培养48h。

PCR检测上述各组中转染48小时后Hela细胞中TERT基因的mRNA水平，所用引物如下：

TERT上游引物：5’AGCATTTCACCCAGCGTCTA3’；

下游引物：5’CTTCAACCGCAAGACCGACA3’。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min后，40个循环(94℃30s，57℃30s，72℃ 60s)，随后72℃10min，4℃1h。

以对照组中TERT基因表达量作为1，其余组的TERT基因表达量为相对于对照组的结果。

miR328的作用下Hela细胞TERT基因mRNA水平检测结果如图2所示(纵坐标TERT基因mRNA表达的改变为相对于对照组中TERT基因表达量的改变量)，可以看出，与对照组相比，miR-328的mimic作用下Hela细胞的TERT基因mRNA水平下降0.42。

miR328的inhibitor作用下Hela细胞TERT基因mRNA水平检测结果如图3所示；可以看出，与对照组相比，miR328的inhibitor对Hela细胞TERT基因mRNA表达水平有显著的上调作用，与对照组相比，miR328的inhibitor作用下Hela细胞TERT基因 mRNA水平能够增加至1.24。

上述结果表明，miR-328可抑制Hela细胞中TERT基因mRNA的表达水平，miR-328的寡核苷酸抑制剂(miR328的inhibitor)可以显著上调Hela细胞中TERT基因mRNA表达的作用。

实施例3、miRNA328对大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)成血管能力的影响

1、分离鉴定大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)

无菌条件下取成年SD大鼠(购于广东省医学实验动物中心，使用许可证号： SYXK(粤)2010-0106)股骨，冲出骨髓，分离单个核细胞。用EGM-2培养基悬浮细胞培养，48h弃去未贴壁细胞。每3天换一次液，10-14天细胞长满后，消化细胞爬片做 EPC免疫荧光染色，鉴定培养的EPC(图4；A.大鼠骨髓单个核细胞在Fn包被的培养皿在内皮细胞培养体系中培养7天后形成的贴壁生长细胞，呈卵园形或多边形；B.为贴壁细胞Wright‘s Giemsa染色(×200))，证明得到EPC。

2、miRNA328对大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)成血管能力的影响

将上述1得到的EPC细胞铺于12孔板，细胞长至80％后，将miRNA328的mimic 和miRNA328 inhibitor分别转入该细胞，转染6h换液。

上述转染分为如下几组：

上述转染分为如下几组：

microRNA的mimic(Control)转染EPC：将50nM Control的mimic溶液(溶剂为水，溶质为Control的mimic)(Control的mimic，广州锐博生物技术有限公司，产品目录号：miR1N0000001-1-5，序列5'-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3')转染EPC，得到转染mimic(Control)的EPC；

microRNA328的mimic转染EPC：将50nM microRNA328的mimic溶液(溶剂为水，溶质为microRNA328的mimic)转染EPC，得到转染microRNA328 mimic的EPC；

microRNA的inhibitor(Control)转染EPC：将50nM Control的inhibitor溶液(溶剂为水，溶质为Control的inhibitor)(Control的inhibitor的序列：5‘-ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3‘)转染EPC，得到转染inhibitor(Control)的EPC；

microRNA328的inhibitor转染EPC：将50nM microRNA328的inhibitor溶液(溶剂为水，溶质为microRNA328的inhibitor)转染EPC，得到转染microRNA328 inhibitor 的EPC。

第二天(转染24小时后)消化上述各组中的转染各种物质的EPC,先用钙黄绿素5uM染色15min，再将消化后的转染各种物质的EPC(1万/孔)种于铺有Matrigel胶 (50ul)的96孔板中，共3个复孔；孵育20小时后观察管状结构的形成。

结果如图5所示，A、B为microRNA的mimic(Control、miR-328)转染EPC成血管能力观察。C、D为microRNA的inhibitor(Control、miR-328)转染EPC成血管能力观察。E.各组成血管数据统计。**P<0.01，与control的mimic组相比，miR-328 的mimic显著降低了EPC的成血管能力。#P<0.5，与control inhibitor比较，miR-328 的inhibitor显著增加了EPC的成血管能力，与对照组相比，管状结构增加至 9.33±2.08。

实施例4、miRNA328对EPC共培养NSC分化的影响

1、miRNA328对EPC共培养NSC分化的影响

将实施例3的2中转染各种物质的EPC孵育20小时后与NSC细胞分别打成单细胞悬液，将NSC细胞以密度为1×10⁶个/cm²接种于Transwell下层，孵育20小时转染各种物质的EPC以同样的密度接种于Transwell上层)共培养7天后，进行免疫荧光检测。

上述共培养分为如下组：

A.对照组：NSC细胞培养7天后，进行免疫荧光检测。

B.EPC+NSC组：EPC和NSC细胞(两种细胞的数量比为1：1)共培养7天后，进行免疫荧光检测。

C.EPC/miRNA328+NSC组：转染microRNA328的mimic的EPC和NSC细胞(两种细胞的数量比为1：1)共培养7天后，进行免疫荧光检测。

D.EPC/inhibitor+NSC组：转染microRNA328的inhibitor的EPC和NSC细胞(两种细胞的数量比为1：1)共培养7天后，进行免疫荧光检测。

免疫荧光检测的方法如下：将上述NSC细胞经4％多聚甲醛固定后，加入GFAP一抗(购于Cell Signaling Technology公司，货号：3670S)孵育,4℃过夜,PBS洗三次，再加入二抗(购于Abcam公司，货号：ab150079)，室温暗盒中孵育1h,PBS洗3次,封片,荧光显微镜下观察并拍照。

结果如图6所示，各组成血管数据统计，**P<0.01，与EPC/miRNA+NSC比较；# P<0.5，与control和EPC+NSC比较。转染miR-328的inhibitor的EPC明显抑制NSC的向神经胶质细胞分化，EPC/inhibitor+NSC组与其他组相比，均有显著性差异(**P<0.01，与EPC/miRNA+NSC比较。#P<0.5，与control和EPC+NSC比较)。

表明，miR-328的inhibitor在EPC和NSC细胞共培养时抑制NSC向神经胶质细胞分化，miR-328的mimic在EPC和NSC细胞共培养时促进NSC向神经胶质细胞分化。

2、miRNA328对EPC共培养NSC中TERT蛋白表达的影响

将实施例3转染各种物质的EPC孵育20小时后分别与NSC共培养(两种细胞的数量比为1：1)7天后，进行酶联免疫(ELISA)实验。

上述共培养分为如下组：

microRNA328的mimic组：转染microRNA328的mimic的EPC和NSC细胞共培养7天后，进行酶联免疫(ELISA)实验。

control的mimic组：转染mcontrol的mimic的EPC和NSC细胞共培养7天后，进行酶联免疫(ELISA)实验。

microRNA328的inhibitor组：转染microRNA328的inhibitor的EPC和NSC细胞共培养7天后，进行酶联免疫(ELISA)实验。

control的inhibitor组：转染control的inhibitor的EPC和NSC细胞共培养7天后，进行酶联免疫(ELISA)实验。

酶联免疫(ELISA)实验的方法如下：用含1％PMSF的蛋白裂解液提取Transwell 下层NSC细胞蛋白，并按BCA蛋白测定说明书对每组蛋白含量进行测定。将上述各组蛋白样品稀释4倍，按照ELISA试剂盒产品说明书操作测定各组TERT的含量。待测样本孔每个孔加入待测样本100μl，并行设置3个复孔。用酶标仪于450nm波长测量各孔的光密度(OD)值。根据标准品的浓度与OD值得到标准曲线的直线回归方程式，并计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中TERT浓度，并计算出样品中TERT蛋白含量。

结果如图7所示，与对照组比较，miR-328mimic转染的EPC明显抑制NSC中TERT蛋白的表达水平(P<0.001)；而miR-328inhibitor转染的EPC与其对照组比较则明显上调 NSC细胞中TERT蛋白表达水平(P<0.01)。

实施例5、EPC与NSC共移植对VD大鼠模型治疗效果的观察

一、建立大鼠VD模型

采用改良2-VO法(吴章福,高晓平,李光武.改良双侧颈总动脉结扎法与传统法制备的大鼠慢性脑缺血模型比较.中国康复医学杂志.2012,27(3):201-210)制建立VD大鼠模型。术后12周进行行为学检查，证实造模成功。

Sham组为对照组(n＝15)：用10％(质量比体积，g:ml)水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉后,仰卧位,颈部正中切口,在显微镜下分离双侧颈总动脉，缝合切口，饲养备用；

其余为模型组(n＝90)：用10％(质量比体积，g:ml)水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉后,仰卧位,颈部正中切口,在显微镜下分离双侧颈总动脉，用线将其永久性结扎。于术后12周行Morris迷宫检测定、位航行和空间探索行为功能，判断模型大鼠学习记忆和空间记忆的认知能力，证明VD模型大鼠建立成功。模型组动物随机进一步分为：Model组、NSC组、EPC+NSC组、EPC/miRNA328+N、EPC/inhibitor+N组和M+E/i+N 组，每组15只。

行为学检查为Morris水迷宫实验,各组大鼠进行Morris水迷宫定向航行实验。训练5天后，第6天各组平均逃避潜伏期如图8所示，可以看出，其他各模型组与对照组 (Sham组)比较,平均逃避潜伏期均明显延长(P<0.01)。

在第7d撤去站台后,进行大鼠空间探索实验,以在原站台象限(第Ⅲ象限)的活动时间和穿越原站台所在位置次数为指标,各模型组与Sham组比较,第Ⅲ象限活动时间明显缩短(P<0.01),穿越原站台次数明显减少(P<0.01)(图9，图10)。

通过Morris水迷宫定检测大鼠定向航行实验与空间探索实验,模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，原站台象限活动时间明显缩短(P<0.01)，穿越原站台次数明显减少(P<0.01)，证明VD大鼠模型建立成功。

二、各组处理后对VD大鼠模型行为学的影响

模型建立好后，按照Sham组，Model组，EPC组，NSC组，EPC+NSC组，EPC/miRNA+NSC组,EPC/inhibitor+NSC组及M+E/i+N组各组要求进行治疗处理。

Sham组：正常大鼠，用脑立体定位仪定位海马区，脑内注射生理盐水5uL；

Model组：VD大鼠模型；

NSC组：NSC细胞培养7天后，用脑立体定位仪定位海马区，VD大鼠模型脑内注射NSC(细胞浓度1×10⁶个/uL)5uL；

EPC+NSC组：EPC细胞和NSC细胞(细胞数量比为1:1)共培养7天后，用脑立体定位仪定位VD大鼠模型海马区，脑内注射共培养后的NSC细胞(浓度1×10⁶个/uL)5uL；

EPC/miRNA328+N组：实施例3转染microRNA328的mimic的EPC和NSC细胞共培养(细胞数量比为1:1)7天后，用脑立体定位仪定位VD大鼠模型海马区，脑内注射共培养后的NSC细胞(浓度1×10⁶个/uL)5uL；

EPC/inhibitor+N组：实施例3转染microRNA328的inhibitor的EPC和NSC细胞共培养(细胞数量比为1:1)7天后，用脑立体定位仪定位VD大鼠模型海马区，脑内注射共培养后的NSC细胞(浓度1×10⁶个/uL)5uL；

M+E/i+N组：经尾静脉注射微泡与细胞(细胞为转染microRNA328的inhibitor的EPC 和NSC细胞共培养7天后的NSC细胞，细胞浓度为5×10⁴个/uL)100uL，MRI引导的低频聚焦超声联合微泡作用于大鼠左侧海马，开放BBB进行细胞移植。

处理后1个月后，通过Morris水迷宫定再次检测大鼠向航行实验与空间探索实验。大鼠向航行实验显示其他各模型组与Sham组比较,平均逃避潜伏期均明显延长 (P<0.01)，而EPC/inhibitor+NSC组与其他治疗组比较，平均逃避潜伏期明显缩短 (P<0.05)(图11)。空间探索实验中EPC/inhibitor+NSC组与其他各治疗组比较原站台象限活动时间明显延长(P<0.05)，穿越原站台次数明显增多(P<0.05)(图12，图13)。

上述行为学观察利用表明miR-328的inhibitor转染的EPC与NSC共移植组与其他治疗组比较，平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索实验中EPC/inhibitor+NSC 组与其他各治疗组比较原站台象限活动时间明显延长(P<0.05)，穿越原站台次数明显增多(P<0.05)。

研究表明将EPC与NSC共移植入VD大鼠模型体内，移植细胞之间的相互作用、 NSC向神经元分化率及其与周围细胞建立神经网络联系，通过行为学评价VD大鼠学习、记忆功能的恢复，为VD等神经系统疾病治疗提供理论依据，具有潜在的临床应用价值。

上述表明，miR-328的inhibitor能够治疗VD等神经系统疾病。

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡医学院

<120> 调节TERT基因表达的microRNA328及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cuggcccucu cugcccuucc gu 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acggaagggc agagagggcc ag 22

<210> 3

<211> 3399

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 3280

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

Claims (2)

1.microRNA328抑制剂在制备治疗血管性痴呆病药物中的应用，所述microRNA328抑制剂为序列2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用是通过如下至少一种实现：

A1）提高TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达；

A2）提高细胞中TERT蛋白活性或TERT蛋白编码基因的表达。

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