CN110551686A - 外周血单个核细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种外周血单个核细胞的分离方法，涉及再生医学领域。本发明的分离方法包括以下步骤：预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。采用本发明的方法，分离的外周血单个核细胞的数量多、纯度高、活性高。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学领域，特别是涉及一种外周血单个核细胞的分离方法及应用。
背景技术
外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，这些细胞是组成机体免疫应答功能的重要细胞。近年对外周血单个核细胞的研究越来越深入，研究发现外周血单个核细胞可以在体外增殖并定向分化。相比于从骨髓抽取免疫细胞，从外周血获取外周血单个核细胞，获取更容易，基本人体带来的痛苦。
2010年有研究显示CD80联合CD28/CpG ODN活化的PBMC对胃癌细胞杀伤作用。2014年另外一项研究从临床和实验方面探讨宫腔灌注外周血单个核细胞对胚胎着床的影响及其机制。可见，外周血单个核细胞有望成为一种新的疾病治疗手段。
目前，外周血单个核细胞的分离方法有很多种，但是制备得到的单个核细胞得率低、活性低，不利于其应用。因此，有必要开发一种新的分离外周血单个核细胞的方法，提高其分离效率和活性。
发明内容
基于此，有必要针对现有分离外周血单个核细胞的方法得率低、活性低的问题，提供一种外周血单个核细胞的分离方法。
一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；
培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。
上述分离方法，采用羟乙基淀粉溶液对血细胞进行沉降，采用红细胞裂解液裂解红细胞，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入肝素抑制血小板的粘附聚集，有利于去除细胞悬液中留存的血小板，加入人血白蛋白维持血液渗透压和转运功能，以上各步骤组合使分离得到的外周血单个核细胞数量多、活性高。
在其中一个实施例中，所述预处理步骤中：离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min。
在其中一个实施例中，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为(3～5):1；沉降的时间为50～70min。
在其中一个实施例中，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为20～40g/mL。
在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，采集外周血时，将外周血放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃。
在其中一个实施例中，所述分离步骤具体为：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，红细胞裂解液与下层沉淀的体积比为(0.8～1.2):1，混合均匀后放置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，离心转速为600～1000rpm，离心18～22min，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合均匀后置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，得到PBMC细胞沉淀。
在其中一个实施例中，所述肝素的工作浓度为0.2～1U/mL，人血白蛋白的工作浓度为10～30g/mL。
在其中一个实施例中，所述淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。
在其中一个实施例中，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:(2～4)。
在其中一个实施例中，所述培养步骤中，培养瓶为75cm2的培养瓶，培养环境中，湿度为饱和湿度，温度为37±0.5℃，CO2浓度为5.0％±0.5％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的分离方法，采用羟乙基淀粉溶液对血细胞进行沉降，采用红细胞裂解液裂解红细胞，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入肝素抑制血小板的粘附聚集，有利于去除细胞悬液中留存的血小板，加入人血白蛋白维持血液渗透压和转运功能，以上各步骤组合配合使分离得到的外周血单个核细胞数量多、活性高。
附图说明
图1为实施例分离的外周血单个核细胞的照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)采集外周血：将抽取70mL人外周血，放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)预处理：外周血运抵实验室后，实验人员在无菌环境下进行操作，将肝素钠采血管放于离心机离心，离心转速为1800rpm，时间为10min，升速度为7降速度为1，分离上层血液和下层血细胞；抽取上层血浆保存，将下层血细胞转移至100mL转移袋中，加入羟乙基淀粉，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为4:1，混合均匀，沉降60min，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
3)分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后4℃保存3min，取出，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min，得到PBMC细胞沉淀；
4)培养：用10mL培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至75cm2培养瓶中进行培养，湿度为饱和湿度，温度为37±1℃，CO2浓度为5.0％±1％，根据需要进行传代培养。
实施例2
一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)采集外周血：将抽取70mL人外周血，放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)预处理：外周血运抵实验室后，实验人员在无菌环境下进行操作，将肝素钠采血管放于离心机离心，离心转速为1700rpm，时间为12min，分离上层血液和下层血细胞；抽取上层血浆保存，将下层血细胞转移至100mL转移袋中，加入羟乙基淀粉，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为3:1，混合均匀，沉降65min，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
3)分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1700rpm，时间为12min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为700rpm，时间为21min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后4℃保存3min，取出，离心，离心转速为1700rpm，时间为12min，得到PBMC细胞沉淀；
4)培养：用10mL培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至75cm2培养瓶中进行培养，湿度为饱和湿度，温度为37±1℃，CO2浓度为5.0％±1％，根据需要进行传代培养。
实施例3
一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)采集外周血：将抽取70mL人外周血，放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)预处理：外周血运抵实验室后，实验人员在无菌环境下进行操作，将肝素钠采血管放于离心机离心，离心转速为1900rpm，时间为8min，分离上层血液和下层血细胞；抽取上层血浆保存，将下层血细胞转移至100mL转移袋中，加入羟乙基淀粉，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为3:1，混合均匀，沉降65min，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
3)分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1900rpm，时间为8min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为600rpm，时间为22min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后4℃保存3min，取出，离心，离心转速为1900rpm，时间为8min，得到PBMC细胞沉淀；
4)培养：用10mL培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至75cm2培养瓶中进行培养，湿度为饱和湿度，温度为37±1℃，CO2浓度为5.0％±1％，根据需要进行传代培养。
对比例1
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入1mL人血白蛋白，混匀后4℃保存3min，取出，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min，得到PBMC细胞沉淀
对比例2
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素，混匀后4℃保存3min，取出，离心，离心转速为1800rpm，时间10min，得到PBMC细胞沉淀。
对比例3
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后1℃保存3min，取出，离心，离心转速为800rpm，时间为10min，得到PBMC细胞沉淀。
对比例4
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1700rpm，时间为12min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后25℃保存3min，取出，离心，离心转速为1700rpm，时间为12min，得到PBMC细胞沉淀。
对比例5
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后5℃保存3min，取出，离心，离心转速为1000rpm，时间为12min，得到PBMC细胞沉淀。
对比例6
一种外周血单个核细胞的分离方法，与实施例1基本相同，区别在于，步骤3)为：
向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后4℃保存3min，离心，离心转速为1800rpm，时间为10min；去除上清液，向细胞沉淀中加入25mL PBS重悬，把细胞悬液沿离心管壁转移至Ficoll淋巴细胞分离液中时，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:3，Ficoll淋巴细胞分离液与水平面垂直，离心，离心转速为800rpm，时间为20min；去除上清液，用移液枪吸取白膜层，加入PBS稀释至100mL，再加入0.5U/mL肝素和1mL人血白蛋白，混匀后5℃保存3min，取出，离心，离心转速为2500rpm，时间为8min，得到PBMC细胞沉淀。
实验例
取实施例和对比例的1ml细胞悬液，用XS-1000i型全自动血液细胞分析仪、Countstar自动细胞计数仪进行计数，检测所得外周血单个核细胞中的红细胞数、血小板数、单个核细胞总数，计算单个核细胞回收率、单个核细胞活率，结果如表1所示：
表1.细胞纯度检测
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；
培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。
2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中：离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min。
3.根据权利要求2所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为(3～5):1；沉降时间为50～70min。
4.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为20～40g/mL。
5.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中，采集外周血时，将外周血放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃。
6.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述分离步骤具体为：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，红细胞裂解液与下层沉淀的体积比为(0.8～1.2):1，混合均匀后放置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，离心转速为600～1000rpm，离心18～22min，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合均匀后置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，得到PBMC细胞沉淀。
7.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述肝素的工作浓度为0.2～1U/mL，人血白蛋白的工作浓度为10～30g/mL。
8.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。
9.根据权利要求8所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:(2～4)。
10.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述培养步骤中，培养瓶为75cm2的培养瓶，培养环境中，湿度为饱和湿度，温度为37±0.5℃，CO2浓度为5.0％±0.5％。
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