CN110551179A

CN110551179A - 一种经修饰的抗hiv多肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110551179A
Application number: CN201810547641.7A
Authority: CN
Inventors: 李学兵; 程水红; 李明莉; 马丽英; 邵一鸣
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN110551179B

Abstract

本发明涉及一种经修饰的抗HIV多肽。具体而言，在C34多肽的N端、C端或第10位添加半胱氨酸，并通过Michael加成反应将具有马来酰胺修饰的糖基或聚乙二醇基团偶联至该半胱氨酸，对C34多肽进行糖基化修饰或PEG化修饰。该经修饰的C34肽具有明显增加的水溶性和大鼠血浆半衰期，且仍具有抗HIV病毒活性。本发明还涉及该经修饰的抗HIV肽的制备方法及用途。

Description

一种经修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种经修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的具有极高致死率的疾病，给人类生命健康安全造成极大威胁。自1981年首次被发现以来，其防治一直没能获得有效的解决。目前在全球范围内艾滋病已经呈现出了爆发性流行的趋势。据我国卫生部统计估算，截至2011年底，中国存活艾滋病病毒携带者和艾滋病病人(PLHIV)已达到78万人(62～94万人)。由于该病毒的高突变率，目前尚未寻找到有效的防治疫苗。

目前上市的HIV治疗性药物多为针对病毒逆转录酶、整合酶、蛋白酶等的一些小分子酶抑制剂。由于HIV的超高突变率，这些小分子特效药物正在逐渐退化为常效、甚至无效药物。近年来，随着HIV入侵宿主细胞分子机制的逐步阐明，抑制该过程的多肽药物逐渐成为艾滋病防治领域的研究热点。这类多肽药物例如第一代侵入抑制剂C34和T20，其作用机理在于可特异性结合HIV囊膜上的融合蛋白，从而抑制病毒进入宿主细胞。T20是迄今为止市场上惟一的侵入抑制剂类药物，自2003年上市至今已在艾滋病治疗中占有不可替代的位置。但是近年来T20耐药毒株频繁出现，导致该药对某些病毒低效甚至无效。因此，获得新型且长效的HIV抑制多肽对于艾滋病的防治具有重要的意义。

一种全新药物的开发需付出很长的时间和很高的成本，且成功率较低，而对现有药物进行结构改造和结构修饰是得到新药的一个重要途径，这一途径成功率高，还可一定程度上改善药物的性质，提高药效，同时达到对原始药物优化的目的。C34是一种比T20活性更强的抗HIV多肽，但其极差的水溶性使得该多肽未能成为临床药物。本发明提出对C34进行修饰，来获得水溶性获得改善且可有效抑制HIV的新型抗HIV多肽。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有式I的结构：

Ac-B_pWMEWDREINN_cB_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLB_q-NH₂式I；

式I中，c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式I肽链的N端带有乙酰化修饰；NH₂表示式I肽链的C端带有酰胺化修饰；B为式II的基团

式II中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式I肽链中的氨基酸相连；Y为式III或式IV的基团：

mPEG式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

式IV中，m为甲氧基，所述甲氧基连接于PEG连接有N-取代的马来酰胺的相对一端。

在第二方面，本发明提供了制备如第一方面所述的经修饰的C34肽的方法，所述方法包括：

(1)提供式V以及式VI的化合物

Ac-Z_pWMEWDREINN_cZ_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZ_q-NH₂式VI；

式VI中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式VI肽链中的氨基酸相连；c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式VI肽链的N端带有乙酰化修饰；NH₂表示式VI肽链的C端带有酰胺化修饰；

式V中，Y为式III或式IV的基团：

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

式IV中，m为甲氧基，所述甲氧基连接于PEG连接有N-取代的马来酰胺的相对一端；

(2)使得式VI化合物中Z的巯基与式V中的马来酰胺发生加成反应，获得所述经修饰的C34肽。

在第三方面，本发明提供了第一方面所述的经修饰的C34肽在制备抗HIV病毒的药物中的应用。

在第四方面，本发明提供了第一方面所述的经修饰的C34肽在制备抗HIV病毒的药物组合物中的应用。

有益效果

C34与T20作为第一代侵入抑制剂，虽然都含有七残基重复序列结构区，其氨基酸序列以及生物活性功能区并不相同。具体地，C34和T20的活性功能区分别为位于N端的疏水性口袋结合区PBD以及位于C端的脂膜结合区LBD。由于其活性功能区不同，相比T20，C34抗HIV-1感染活性显著提高，但是水溶性极差，因此未能有效应用于临床。发明人首次提出在C34肽的链端或链中引入一个或多个半胱氨酸，从而可以在温和的反应条件(中性体系、较低温度、温和反应试剂)下借助选择性极高的Michael加成反应，将具有马来酰胺修饰的糖基或聚乙二醇基团偶联至C34的至少一个半胱氨酸，获得水溶性增强且抗HIV活性不明显降低的经修饰的C34肽。

本领域已知的大多数多肽类HIV融合抑制剂(如T20)均存在半衰期较短从而需要反复给药或使用较高剂量来维持内体有效的药物浓度的问题。与此不同的是，根据本发明，PEG化修饰和糖基化修饰的C34多肽在动物体内具有延长的血浆半衰期，这表明该修饰使得C34肽的体内长效稳定性得到提升。

附图说明

图1为根据实施例1制备的PEG₅₀₀₀CC34的MALDI-TOF质谱图。

图2A-2B为根据实施例2制备的C34CPEG₂₀₀₀和C34CPEG₅₀₀₀的MALDI-TOF质谱图。

图3A-3B为根据实施例3制备的C34NCPEG₂₀₀₀和C34NCPEG₅₀₀₀的MALDI-TOF质谱图。

图4A-4C为根据实施例4制备的M1-C34、M3-C34和M5-C34的ESI质谱图。

图5A-5C为根据实施例5制备的C34-M1、C34-M3和C34-M5的ESI质谱图。

图6A-6C为根据实施例6制备的NC-M1、NC-M3和NC-M5的ESI质谱图。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解的是，本发明并不局限于本文所述的特定的方法、方案和试剂，因为它们还可有所变化。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅为所附的权利要求所限。

不论在上文或下文中，本文引用的各文献(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明等)均通过引用的方式整体并入本文。

除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

本文使用的术语“C34多肽”、“C34肽”或“C34”是由gp41的PBD和CHR区组成的多肽，通过结合到gp41的NHR区而抑制6-螺旋束的形成，从而阻止病毒的入侵。C34肽是抗HIV的第一代融合抑制剂。本领域中常用的C34肽具有如下的氨基酸序列：Ac-WMEWD REINN YTSLIHSLIE ESQNQ QEKNE QELL-NH₂(SEQ ID NO:1)，其中，Ac和NH₂分别表示在肽链的N端进行乙酰化和在C端进行酰胺化修饰。

根据本发明实施例所证实的，在C34肽的N端、C端或第10位添加一个或多个半胱氨酸，并通过Michael加成反应将具有马来酰胺修饰的糖基或聚乙二醇基团偶联至该半胱氨酸，不影响C34肽的抗HIV活性。

本发明的所述经修饰的C34肽具有式I的结构：

Ac-B_pWMEWDREINN_cB_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLB_q-NH₂ 式I；

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

优选地，式I中，p、q、d不同时为1。优选地，式I中，c、d不同时为1。在一些实施方式中，式I中，d为1，c、p、q为0。

式II中，基团为通过Michael加成反应连接至半胱氨酸(Cys)的巯基。

在一些实施方式中，Y为式IV的基团，即，甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其中，所述甲氧基与PEG的另一端(即与连有N-取代的马来酰亚胺的相对一端)连接。低分子量和高分子量的聚乙二醇均可用于本发明。优选地，本发明所使用的PEG分子量优选为700-5000，优选2000-5000，最优选2000。

在优选的实施方式中，本发明的经修饰的C34肽具有选自于如下的任一种结构：

上述结构中，PEG₂₀₀₀和PEG₅₀₀₀分别指平均分子量为2000和5000的聚乙二醇。

在一些实施方式中，Y为式III的基团；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数。

优选地，所述吡喃糖基为甘露寡糖基或岩藻糖寡糖基。优选地，所述甘露寡糖基为一甘露糖基、三甘露糖基或五甘露糖基。优选地，所述岩藻糖寡糖基为一岩藻糖寡糖基、三岩藻糖寡糖基或五岩藻糖寡糖基。

优选地，a为选自于1-3的整数；b为选自于1-6的整数。

(1)提供式V以及式VI的化合物

Ac-Z_pWMEWDREINN_cZ_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZ_q-NH₂ 式VI；

式V中，Y为式III或式IV的基团：

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

优选地，所述式VI的化合物具有如下的任一序列：

Ac-CWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂

(SEQ ID NO:2)；

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLC-NH₂

(SEQ ID NO:3)；

Ac-WMEWDREINCYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂

(SEQ ID NO:4)。

优选地，所述加成反应在7.2-9.5的pH下进行。在一些方式中，所述加成反应在7.2、8.0或9.5的pH下进行。最优选地，所述加成反应在7.2的pH下进行。

优选地，所述加成反应在室温(例如20-30℃)下进行。

优选地，所述加成反应在缓冲液中进行。优选地，所述缓冲液为弱酸和/或弱碱盐缓冲液、例如为磷酸盐缓冲液。优选地，所述磷酸盐缓冲液为5mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠混合后的水溶液。

本发明的经修饰的C34肽具有抗HIV病毒(例如HIV-1_SF33型病毒或HIV-1_NL4-3型病毒)的活性。可将本发明的经修饰的C34肽用于治疗和/或预防艾滋病。就这一点而言，本发明的经修饰的C34肽可作为药物或疫苗的活性成分。

本发明还提供了根据本发明的经修饰的C34多肽在制备抗HIV病毒药物组合物中的应用，其中所述经修饰的C34肽作为活性成分，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有式I的结构：

Ac-B_pWMEWDREINN_cB_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLB_q-NH₂ 式I；

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

2.如段落1所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式I中，p、q、d不同时为1。

3.如段落1或2所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式I中，c、d不同时为1。

4.如段落3所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式I中，d为1，c、p、q为0。

5.如段落1-4中任一项所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式II中，Y为式IV的基团。

6.如段落5所述的经修饰的C34肽，其特征在于，所述PEG的分子量为700-5000。

7.如段落6所述的经修饰的C34肽，其特征在于，所述PEG的分子量为2000-5000。

8.如段落5所述的经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有如下的任一种结构：

9.如段落1-4中任一项所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式II中，Y为式III的基团。

10.如段落9所述的经修饰的C34肽，其特征在于，所述吡喃糖基为甘露寡糖基或岩藻糖寡糖基。

11.如段落10所述的经修饰的C34肽，其特征在于，所述甘露寡糖基为一甘露糖基、三甘露糖基或五甘露糖基。

12.如段落11所述的经修饰的C34肽，其特征在于，所述岩藻糖寡糖基为一岩藻糖寡糖基、三岩藻糖寡糖基或五岩藻糖寡糖基。

13.如段落9-12中任一项所述的经修饰的C34肽，其特征在于，式III中，a为选自于1-3的整数；b为选自于1-6的整数。

14.如段落9所述的经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有如下的任一种结构：

15.制备如段落1-14中任一项所述的经修饰的C34肽的方法，所述方法包括：

(1)提供式V以及式VI的化合物

Ac-Z_pWMEWDREINN_cZ_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZ_q-NH₂ 式VI；

式V中，Y为式III或式IV的基团：

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

16.如段落15所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2-9.5的pH下进行。

17.如段落16所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2、8.0或9.5的pH下进行。

18.如段落15-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述加成反应在室温下进行。

19.如段落15-18中所述的方法，其特征在于，所述加成反应在磷酸盐缓冲液中进行。

20.如段落15-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述式VI的化合物具有如下的任一序列：

Ac-CWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂；

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLC-NH₂；以及

Ac-WMEWDREINCYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂。

21.如段落15-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述式V的化合物具有如下的

式VII中，n为大于0的整数。

22.如段落15-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述式V的化合物具有如下的结构：

式VIII中，R为吡喃糖基。

23.如段落22所述的方法，其特征在于，式VIII中，所述吡喃糖基选自于如下的任一种基团：一甘露糖基、三甘露糖基、五甘露糖基、一岩藻糖寡糖基、三岩藻糖寡糖基或五岩藻糖寡糖基。

24.如段落1-14中任一项所述的经修饰的C34肽在制备抗HIV的药物组合物中的用途。

25.如段落24所述的用途，其中，所述HIV为HIV-1_SF33型病毒或HIV-1_NL4-3型病毒。

26.如段落1-14中任一项所述的经修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的药物组合物中的用途。

27.如段落24-26中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

28.如段落1-14中任一项所述的经修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的疫苗中的用途。

实施例

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或可参照文献制备的物质。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为分析纯级别。

下述实施例中如无特殊说明，所述液体与液体的比值为体积与体积比；所述固体与液体的比值为物质的量与体积比，所述物质的量以mmol计，所述体积以ml计；所述固体与固体的比值为质量与质量比。

下述实施例中如无特殊说明，所述室温反应具体为将反应温度控制在20-30℃范围内，包括20℃和30℃。

材料：

由多肽合成公司合成以下序列：【Ac-C WMEWD REINN YTSLI HSLIE ESQNQ QEKNEQELL-NH2】(SEQ ID NO:2)(下文称为“多肽CC34”)；【Ac-WMEWD REINN YTSLI HSLIE ESQNQQEKNE QELL C-NH2】(SEQ ID NO:3)(下文称为“多肽C34C”)；【Ac-WMEWD REIN C YTSLIHSLIE ESQNQ QEKNE QELL-NH2】(SEQ ID NO:4)(下文称为“多肽C34NC”)。

平均分子量为2000(PEG₂₀₀₀)和5000(PEG₅₀₀₀)的式VII化合物(mPEG₂₀₀₀Mal和mPEG₅₀₀₀Mal)购自北京凯正生物工程发展有限责任公司。

磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液：5mM磷酸二氢钠，5mM磷酸氢二钠，溶于水，pH为7.2。

质谱采用VG PLATFORM质谱仪，用MALDI-TOF技术进样。

实施例1：PEG化多肽PEG₂₀₀₀CC34和PEG₅₀₀₀CC34的制备

室温下，将20mg(0.01mmol)mPEG₂₀₀₀Mal和mPEG₅₀₀₀Mal分别与10mg(0.002mmol)多肽CC34的混合物溶于10mL的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液(5mM，pH 7.2)中，用5mM的Na₂HPO₄溶液将mPEG₂₀₀₀Mal反应溶液的pH值调节至7.2，将mPEG₅₀₀₀Mal反应溶液的pH值调节至8.0，通过HPLC监测反应，直至多肽反应完全。

采用安捷伦1200反相高效液相色潽仪对所获得的经修饰的多肽进行纯化。色谱柱型号：Angilent Eclipse XDB-C18Semi-Prep，5μm，9.4×250mm。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A(含体积百分浓度为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)和流动相B组成(含体积百分浓度为0.1％三氟乙酸的水溶液)。线性梯度洗脱由40％A到70％A，时间11min，洗脱流速为3ml/min，紫外检测波长220nm。冻干溶剂后得到的蓬松状态的多肽纯品。如图1所示，经MALDI-TOF质谱表征验证所获得的PEG化多肽的结构。

制备得到的PEG₂₀₀₀CC34的结构为：

制备得到的PEG₅₀₀₀CC34的结构为：

采用安捷伦1200分析型高效液相色谱仪检测PEG₂₀₀₀CC34和PEG₅₀₀₀CC34的纯度。色谱柱的型号：Angilent Eclipse XDB-C18Analytical,5μm,4.6×150mm。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A(含体积百分浓度为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)和流动相B(含体积百分浓度为0.1％三氟乙酸的水溶液)组成。线性梯度洗脱由10％A到100％A，时间25分钟，洗脱流速为1mL/min，紫外检测波长220纳米。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得PEG₂₀₀₀CC34的纯度为97.6％，PEG₅₀₀₀CC34的纯度为97.0％。

实施例2：PEG化多肽C34CPEG₂₀₀₀和C34CPEG₅₀₀₀的制备

除了将实施例1中的多肽CC34换成多肽C34C，将mPEG₂₀₀₀Mal反应溶液的pH值调节至9.5，将mPEG₅₀₀₀Mal反应溶液的pH值调节至7.2之外，按照实施例1中的方法制备、纯化以及表征，得到C34CPEG₂₀₀₀(纯度为98.0％)和C34CPEG₅₀₀₀(纯度为97.2％)，质谱结果如图2A-2B所示。

制备得到的C34CPEG₂₀₀₀的结构为：

制备得到的C34CPEG₅₀₀₀的结构为：

实施例3：PEG化多肽C34NCPEG₂₀₀₀和C34NCPEG₅₀₀₀的制备

除了将实施例1中的多肽CC34换成多肽C34NC，将mPEG₂₀₀₀Mal和mPEG₅₀₀₀Mal的反应溶液的pH值均调节至7.2以外，按照实施例1中的方法制备、纯化以及表征，得到C34NCPEG₂₀₀₀(纯度为97.2％)和C34NCPEG₅₀₀₀(纯度为97.2％)，质谱结果如图3A-3B所示。

制备得到的C34NCPEG₂₀₀₀的结构为：

制备得到的C34NCPEG₅₀₀₀的结构为：

实施例4：糖基化多肽M1-C34、M3-C34和M5-C34的制备

根据专利CN105273064A实施例1和2中描述的方法分别制备下列结构式中所示的末端带有马来酰亚胺基团的甘露糖糖链。

其中，R为甘露糖，合成的一甘露糖糖链(M1，其中R为一甘露糖)、三甘露糖糖链(M3，其中R为三甘露糖)和五甘露糖糖链(M5，其中R为五甘露糖)分别具有如下结构：

将0.006mmol制得的糖链(M1、M3、M5)分别与0.002mmol多肽CC34混合物溶于5毫升的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液(5mM，pH 7.2)中，用5mM的Na₂HPO₄溶液将反应溶液的pH值均调节至7.2，HPLC监测反应，直至多肽反应完全。

采用与实施例1相同的方法，对所获得的多肽进行纯化、表征，得到纯度均大于98％的M1-C34、M3-C34和M5-C34，其ESI质谱图如图4A-4C所示。

制得的甘露糖修饰的多肽M1-C34、M3-C34和M5-C34的结构如下：

实施例5：糖基化多肽C34-M1、C34-M3和C34-M5的制备

除了将实施例4中的多肽CC34换成多肽C34C以外，按照实施例4的方法制备、纯化以及表征，得到纯度均大于98％的C34-M1、C34-M3和C34-M5，其ESI质谱图如图5A-5C所示。

制得的甘露糖修饰的多肽C34-M1、C34-M3和C34-M5的结构如下：

实施例6：糖基化多肽NC-M1、NC-M3和NC-M5的制备

除了将实施例4中的多肽CC34换成多肽C34NC以外，按照实施例4的方法制备、纯化以及表征，得到纯度均大于98％的NC-M1、NC-M3和NC-M5，其ESI质谱图如图6A-6C所示。

制得的甘露糖修饰的多肽NC-M1、NC-M3和NC-M5的结构如下：

效果例1：多肽的水溶性

对实施例1-3获得的PEG化的C34肽和实施例4-6获得的糖基化的C34肽进行水溶性评价。

将1mg的C34溶解于1mL的蒸馏水中，溶液中见明显浑浊，超声后仍无变化，可见C34在水中的浓度≤1mg/mL；而分别将1mg的PEG₂₀₀₀CC34、PEG₅₀₀₀CC34、C34CPEG₂₀₀₀、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、C34NCPEG₅₀₀₀、M1-C34、M3-C3、M5-C34、C34-M1、C34-M3、C34-M5、NC-M1、NC-M3、NC-M5溶解于300μL的蒸馏水中，溶液澄清，可见经修饰后的C34在水中的浓度＞3mg/mL。

因此，经PEG或甘露糖修饰后的C34的水溶性明显大于未经修饰的C34。

效果例2：对HIV-1_NL4-3型病毒的抑制作用

为了评估由实施例1-3制备的抗HIV多肽对HIV病毒的抑制作用，对HIV-1_NL4-3型病毒进行测试。HIV-1_NL4-3型病毒从NIH AIDS Research and Reference Reagent Program获得。

将TZM-bl细胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)以10⁴/孔接种于96孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。培养基为DMEM培养基。用DMEM培养基将药物(即实施例1-3制备的PEG化多肽，以及CC34、C34C、C34NC和C34多肽)稀释成8个稀释度。用DEAE培养液(含30μg/ml的DEAE-dextran)将待测病毒(即HIV-1_NL4-3型病毒)稀释成2000TICD50/mL。弃去96孔板中的培养基，依次缓慢加入稀释后的药物，每孔100μL(即200TICD50/孔)并设3个复孔。接着将稀释后的HIV-1_NL4-3病毒缓慢加入各孔中，每孔100μL(即200TICD50/孔)。同时设立病毒对照组(VC，仅加入100μL的DMEM培养基和100μL的稀释后的病毒)和细胞对照组(CC，仅加入200μL的DMEM培养基)。

将96孔板四周贴好封口膜，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时，然后取出96孔板，每孔吸取100μL培养液，加入100μL发光检测液(Perkin Elmer公司)，室温避光放置2min，吸取150μL上清转移至黑色96孔板中，于发光检测仪(1420VICTOR D MultilabelCounter，型号1420-020)中检测，获得各个样品的发光值。

根据Reed and Muench法计算药物的抑制率，其中发光值为使用3个复孔所测发光值的均值：

然后根据获得的抑制率使用GraphPad Prism Software 5.0软件的非线性回归计算每种多肽药物的IC₅₀值和IC₉₀值。结果如表1所示。

表1：各样品的IC₅₀值和IC₉₀值

样品	C34	CC34	C34C	C34NC
					IC<sub>50</sub>(nM)	1.31±0.69	1.38±0.32	1.40±0.12	1.45±0.14
IC<sub>90</sub>(nM)	5.93±1.40	6.93±0.54	6.29±1.21	6.98±0.54
					样品	PEG<sub>2000</sub>CC34	PEG<sub>5000</sub>CC34	C34CPEG<sub>2000</sub>	C34CPEG<sup>5000</sup>
IC<sub>50</sub>(nM)	3.10±2.23	6.28±2.58	2.50±0.54	4.89±0.76
					IC<sub>90</sub>(nM)	19.01±15.93	46.98±25.62	10.21±1.21	15.12±1.67
样品	C34NCPEG<sub>2000</sub>	C34NCPEG<sub>5000</sub>
					IC<sub>50</sub>(nM)	2.10±0.45	6.78±0.58
IC<sub>90</sub>(nM)	8.01±0.93	25.98±1.62

表1的结果表明，CC34、C34C和C34NC的抗病毒活性与C34相当，而PEG化修饰的C34肽的抗病毒活性仅微弱降低。

效果例3：对HIV-1_SF33型病毒的抑制作用

为了评估由实施例4-6制备的抗HIV多肽对HIV病毒的抑制作用，对HIV-1_SF33型病毒进行测试。HIV-1_SF33型病毒已记载在公开文献中(Shuihong Cheng,Xuesong Chang,YanWang,George F.Gao,Yiming Shao,Liying Ma,Xuebing Li*.Glycosylated Enfuvirtide:A Long-Lasting Glycopeptide with Potent Anti-HIV Activity.J.Med.Chem.,2015,58(3),1372-1379)。HIV-1_SF33型病毒从NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program(USA)获得。

除了使用实施例4-6制备的糖基化C34多肽(即，M1-C34、M3-C3、M5-C34、C34-M1、C34-M3、C34-M5、NC-M1、NC-M3、NC-M5)和C34、NVP(奈韦拉平，另一种HIV抑制剂，作为对照)作为药物，使用HIV-1_SF33型病毒作为待测病毒之外，按照效果例2中相同的方法测试药物的IC₅₀值和IC₉₀值，结果如表2所示。

表2：各样品的IC₅₀值和IC₉₀值

样品

C34

NVP

M1-C34

M3-C34

M5-C34

C34-M1

IC50(nM)

0.1±0.1

25.0±2.0

1.3±0.1

1.5±0.1

1.7±0.5

1.6±0.2

IC90(nM)

4.0±0.6

221±1.9

15.7±0.9

19.1±0.8

20.6±2.2

17.2±1.2

样品

C34-M3

C34-M5

NC-M1

NC-M3

NC-M5

IC50(nM)

2.3±0.1

1.1±0.1

0.7±0.1

2.2±0.1

0.7±0.1

IC90(nM)

22.6±1.1

14.5±0.2

12.4±0.8

22.1±0.6

9.8±1.0

表2的结果表明，实施例4-6制备的M1-C34、M3-C34、M5-C34、C34-M1、C34-M3、C34-M5、NC-M1、NC-M3和NC-M5对HIV-1_SF33型病毒的抑制作用与C34基本相当，而明显比NVP对HIV-1_SF33型病毒具有更强抑制作用。

效果例4：对SD大鼠体内血浆半衰期的作用

实验方法：

制作标准曲线：用硼砂缓冲液(pH 9.5)将各待测药物(C34、PEG₂₀₀₀CC34、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、M1-C34、C34-M5、NC-M1、NC-M5)配制为1mg/mL的储液。用50％乙腈水溶液将储液配制成25、37.5、50、75、100、150、250μg/mL的标准曲线工作液。取20μL工作液，加入100μL空白SD鼠血浆，配制成5、7.5、10、15、20、30、50μg/mL的标准曲线样品，然后向其中加入20μL 20％磷酸溶液和300μL甲醇-乙腈(1:1)，涡旋混匀约2min，4000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析。分析所用色谱柱：XSELECT CSH C18，4.6×150mm，5μm；流动相：A相(0.1％TFA水溶液)，B相(0.1％TFA乙腈)；检测波长：220nm；进样体积：20μL。分析获得各待测药物(C34、PEG₂₀₀₀CC34、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、M1-C34、C34-M5、NC-M1、NC-M5)的标准曲线。

药物配制：给药前配制；用50％的0.9％氯化钠注射液和50％的5mM Na₂HPO₄将C34、PEG₂₀₀₀CC34、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、M1-C34、C34-M5、NC-M1、NC-M5分别配制为3.5mg/mL，5.5mg/mL，6mg/mL，5.2mg/mL，4.8mg/mL，4.6mg/mL，4.5mg/mL，4.2mg/mL的终浓度，用于皮下给药。

动物实验：试验动物为来自北京华阜康生物科技股份有限公司的雌雄SD大鼠，体重160-180克。分别对4只SD大鼠(雌雄各两只)皮下注射各待测药物，给药剂量为2mg/kg。

样品采集：给药前记为零时刻，分别在零时刻和给药后30min、1h、2h、4h、6h、10h、12h、24h通过尾静脉取血0.3mL于装有6μL抑肽酶和5μL肝素钠的离心管中，4500rpm离心5min，分离上层血浆并置于-80℃冰箱保存。

样品处理：取100μL待测样品的血浆，加入20μL 20％磷酸溶液、20μL 50％乙腈水溶液和300μL甲醇-乙腈(1:1)溶液。涡旋混匀约2min，4000转/分钟离心10min，取上清液同标准曲线样品进行分析。

实验结果：

由药物C34、PEG₂₀₀₀CC34、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、M1-C34、C34-M5、NC-M1、NC-M5所得的标准曲线所得的药物浓度与峰面积的关系式分别为y＝3.115x+10.84(R²＝0.997)、y＝4.526x-8.52(R²＝0.998)、y＝4.741x-7.34(R²＝0.998)、y＝3.721x-8.34(R²＝0.997)、y＝4.518+48.56(R²＝0.998)、y＝5.625x+65.72(R²＝0.998)、y＝4.647x+60.98(R²＝0.998)、y＝6.182x+63.24(R²＝0.998)。其中y为峰面积，x为浓度。

各时间点各药物浓度依据标准曲线得到，药动力学参数由Winnonlin药动力学软件中的非房室模型计算得出。药物的SD大鼠体内血浆半衰期T_1/2(h)：C34为0.95±0.12，PEG₂₀₀₀CC34为18.34±3.6，C34CPEG₅₀₀₀为22.50±5.0，C34NCPEG₂₀₀₀为20.10±4.5，M1-C34为4.64±0.32，C34-M5为5.78±0.46，NC-M1为4.05±0.14，NC-M5为6.34±0.28，由此可知，PEG₂₀₀₀CC34、C34CPEG₅₀₀₀、C34NCPEG₂₀₀₀、M1-C34、C34-M5、NC-M1、NC-M5在SD大鼠体内的血浆半衰期比C34要显著延长。

因此，本发明所提供修饰后的C34肽(包括PEG化C34肽和糖基化C34肽)能够明显增加C34肽的水溶性，并且具有显著延长的大鼠体内的血浆半衰期，且其抗HIV活性与C34肽活性相当或仅稍微减弱。本发明提供的C34有望成为水溶性好且长效的抗HIV多肽药物。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心

<120> 一种经修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His

1 5 10 15

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

20 25 30

Leu Leu

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile

1 5 10 15

His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln

20 25 30

Glu Leu Leu

35

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His

1 5 10 15

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

20 25 30

Leu Leu Cys

35

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Cys Tyr Thr Ser Leu Ile His

1 5 10 15

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

20 25 30

Leu Leu

Claims

1.一种经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有式I的结构：

Ac-B_pWMEWDREINN_cB_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLB_q-NH₂ 式I

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

式IV中，m为甲氧基，所述甲氧基连接至PEG的与连接有N-取代的马来酰胺的一端相对着的另一端。

2.如权利要求1所述的经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有如下的任一种结构：

3.如权利要求1所述的经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有如下的任一种结构：

4.制备如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的C34肽的方法，所述方法包括：

(1)提供式V以及式VI的化合物

Ac-Z_pWMEWDREINN_cZ_dYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZ_q-NH₂ 式VI；

式V中，Y为式III或式IV的基团：

mPEG 式IV；

式III中，R为吡喃糖基，a和b各自独立地为大于零的整数；

式IV中，m为甲氧基，所述甲氧基连接至PEG的与连接有N-取代的马来酰胺的一端相对着的另一端；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述式VI的化合物具有如下的任一序列：

Ac-CWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂；

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLC-NH₂；

Ac-WMEWDREINCYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂。

6.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的C34肽在制备抗HIV的药物组合物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其中，所述HIV为HIV-1_SF33型病毒或HIV-1_NL4-3型病毒。

8.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的药物组合物中的用途。

9.如权利要求6-8中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。