CN110551137B - 一种光甘草定的提取纯化方法以及在化妆品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光甘草定的提取纯化方法以及在化妆品中的用途，提取纯化方法包括步骤：(1)甘草渣的提取：用95％乙醇提取甘草渣得到甘草渣粗提物；(2)高速逆流色谱一步法制备富含光甘草定的甘草渣富集物：溶剂体系为二氯甲烷:丙酮:正丁醇:水(7:5:8:4，V/V)，以上相为流动相，下相为固定相，将上述甘草渣粗提物用等体积比混合的上相、下相混合溶剂溶解，作为上样溶液，流动相流速3mL/min、温度25℃、转速850r/min，得富含光甘草定的甘草渣富集物；(3)重结晶。本发明方法可以从甘草渣中精制得到纯度在98％以上的光甘草定，步骤精简，无需借助于柱层析，适合于工业化。

Description

一种光甘草定的提取纯化方法以及在化妆品中的用途

技术领域

本发明涉及光甘草定、富含光甘草定的甘草提取物的制备和应用，具体涉及一种光甘草定的提取纯化方法、富含光甘草定的甘草提取物的制备方法和美白用途。

背景技术

随着科学技术和生活水平的提高，人们对美白类化妆品的需求已从单纯的物理性遮盖向功能性转化。祛斑/美白类产品在我国及亚洲市场均占有很大的份额。美白功效成分中天然成分种类较多，植物提取物达50种，占56.7％，主要为黄酮类化合物，如光果甘草根提取物、牡丹根提取物、茶提取物、熊果苷等，可通过清除活性氧和螯合金属离子抑制酪氨酸酶活性达到美白作用。此外天然成分还有酵母提取物和小雨燕窝提取物。有些美白成分例如珍珠粉、水解珍珠、阿魏酸、小雨燕窝提取物等仅在国产产品中使用。

据调查，烟酰胺在祛斑/美白类产品使用频率最高，占31.4％；其次为抗坏血酸葡糖苷和熊果苷，占比分别为18.9％和17.9％。进口产品与国产产品中美白功效成分的使用频率存在差异。进口产品中使用频率前10位的美白功效成分为抗坏血酸葡糖苷、烟酰胺、熊果苷、光果甘草根提取物、3-O-乙基抗坏血酸、苯乙基间苯二酚、黄芩根提取物、牡丹根提取物、甲氧基水杨酸钾、抗坏血酸磷酸酯镁；国产产品中使用频率前10位的美白功效成分为烟酰胺、熊果苷、3-O-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸磷酸酯钠、光果甘草根提取物、苯乙基间苯二酚、抗坏血酸磷酸酯镁、珍珠粉、水解珍珠。

其中，光甘草定因其优异的美白祛斑活性，在国内外美白产品中均广泛使用。

长期以来，甘草提取甘草浸膏后的甘草渣被当作废渣遗弃。研究表明，剩余的甘草渣中仍含有大量的光甘草定，重新回收提取有利于解决工业上生产废物处理的难题，更有利于保护和合理利用甘草植物资源，具有良好的经济效益和环境效益。

陈军明等发表了文章“甘草渣中光甘草定提取工艺的研究”，综合考察了多种树脂对光甘草定的吸附性能，其中Celite树脂吸附甘草渣中光甘草定的量高，且易洗脱，提取纯度达50％以上。但是，其依赖于大孔树脂，而大孔树脂等柱层析方法的回收率通常不会很高，浪费严重(甘草渣中光甘草定提取工艺的研究，新疆中医药，2014年第32卷第4期)。

吴迪强等发表了文章“甘草渣中光甘草定提取工艺的研究”，但是该方法仅为常规的溶剂提取法，并没有后续的浓缩和富集步骤，无法得到高纯度的光甘草定(甘草渣中光甘草定提取工艺的研究，科技论坛)。

胡海涛发表了文章“甘草渣中光甘草定提取工艺的研究”，但是该方法也仅为常规的溶剂提取法，并没有后续的浓缩和富集步骤，无法得到高纯度的光甘草定(甘草渣中光甘草定提取工艺的研究，科技论坛)。

综合现有的研究可以发现，目前还没有成熟可应用的利用甘草渣制备光甘草定的工艺。

发明内容

本发明旨在克服现有技术不足，提供光甘草定的提取纯化方法以及在化妆品中的用途。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种光甘草定的提取纯化方法，包括如下步骤：

(1)甘草渣的提取

将干燥的甘草渣粉碎过筛，加入体积百分浓度为95％的乙醇水溶液，超声破碎提取；抽滤，滤液浓缩至干，得到甘草渣粗提物。

(2)高速逆流色谱一步法制备富含光甘草定的甘草渣富集物

溶剂体系为二氯甲烷:丙酮:正丁醇:水(7:5:8:4，V/V)，以上相为流动相，下相为固定相；将上述甘草渣粗提物用等体积比混合的上相、下相混合溶剂溶解，作为上样溶液；流动相流速3mL/min、温度25℃、转速850r/min；具体操作方法为：先将固定相以30mL/min流速泵满HSCCC螺旋管，打开色谱仪，调节螺旋管转速，洗脱模式调为反接正转，转速850r/min，转速稳定后将流动相以3mL/min泵入螺旋管中，待流动相从螺旋管流出后，继续泵入流动相平衡30min，然后将上样溶液通过进样阀注入螺旋管，并开始计时，收集120～150min流出液，浓缩至干即得富含光甘草定的甘草渣富集物。

(3)重结晶法制备光甘草定

取适量甘草渣富集物溶于1,2-丙二醇，再加入四倍于1,2-丙二醇体积的水，轻轻振荡均匀，4℃放置，收集析出物，洗涤，重结晶1次，洗涤，吹干，即得光甘草定。

优选地，步骤(1)粉碎后过40目筛。

优选地，步骤(1)料液比为1g:20mL。

优选地，步骤(1)超声破碎提取的参数为：频率30kHz，超声功率400W，提取60min。

优选地，步骤(2)上样浓度为20mg/mL。

优选地，步骤(2)上样体积为10mL。

优选地，步骤(3)取甘草渣富集物溶于1,2-丙二醇配成浓度为20mg/mL的溶液。

优选地，步骤(3)中用4℃预冷的丙酮洗涤。

上述提取纯化方法制备的光甘草定用于祛斑美白的用途。

有益的效果：

本发明方法可以从甘草渣中精制得到纯度在98％以上的光甘草定，步骤精简，无需借助于柱层析，适合于工业化。

附图说明

图1为光甘草定标准品、甘草渣富集物、光甘草定的高效液相色谱图；

图2为实施例1制备的甘草渣富集物对酪氨酸酶的抑制活性；

图3为实施例1制备的光甘草定对酪氨酸酶的抑制活性。

具体实施方式

实施例1：光甘草定提取物的制备、重结晶纯化

一、实验材料

甘草渣自制，为光果甘草提取生产甘草浸膏后的废弃物(取光果甘草，润透，切片，加水煎煮三次，每次2小时)，晾干备用。

光甘草定标准品，成都普利斯生物科技有限公司。

HSCCC-300C高速逆流色谱、TBP-5002恒压恒流泵、DC-0506低温恒温槽、TBD-2000紫外检测器，上海同田生物技术股份有限公司。

乙醇等化学试剂，分析纯，南京化学试剂股份有限公司。

二、实验方法

1、甘草渣的提取

将干燥的甘草渣粉碎后过40目筛，按1:20(g/mL)的料液比加入体积百分浓度为95％的乙醇水溶液，超声破碎提取，参数为：频率30kHz，超声功率400W，提取60min；抽滤，滤液浓缩至干，得到甘草渣粗提物。

2、高速逆流色谱(HSCCC)一步法制备富含光甘草定的甘草渣富集物

HSCCC溶剂体系为二氯甲烷:丙酮:正丁醇:水(7:5:8:4，V/V)，以上相为流动相，下相为固定相。将上述甘草渣粗提物用等体积比混合的上相、下相混合溶剂溶解，作为上样溶液。流动相流速3mL/min、温度25℃、转速850r/min、上样量10mL，上样质量浓度20mg/mL。具体操作方法为：先将固定相以30mL/min流速泵满HSCCC螺旋管，打开色谱仪，调节螺旋管转速，洗脱模式调为反接正转，转速850r/min，转速稳定后将流动相以3mL/min泵入螺旋管中，待流动相从螺旋管流出后，继续泵入流动相平衡30min，然后将10mL 20mg/mL的上样溶液通过进样阀注入螺旋管，并开始计时，收集120～150min流出液，浓缩至干即得富含光甘草定的甘草渣富集物。

3、重结晶法制备光甘草定

取甘草渣富集物100mg溶于5mL 1,2-丙二醇，再加入20mL水，振荡均匀后，4℃放置12h，收集析出物，用4℃预冷的丙酮洗涤，重结晶1次，丙酮洗涤，氮气吹干，即得光甘草定。ESI-MS确定分子式为C₂₀H₂₀O₄。HPLC色谱保留时间与光甘草定标准品一致。

4、高效液相色谱法测定甘草渣富集物和光甘草定的纯度

采用Agilent ZORBAX Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，梯度洗脱，流动相组成及洗脱梯度为：A相为乙腈，B相为水，0～5min 50％～70％A，5～25min 70％～100％A，25～40min 100％A，流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长280nm，进样量10μL。

分别取光甘草定标准品、甘草渣富集物、光甘草定用乙腈溶解，配制成浓度约为0.8mg/mL的标准品溶液和供试品溶液，按照上述色谱参数注入液相色谱仪分析。

三、实验结果

经计算，1kg干燥的甘草渣可以制备得到4.5g甘草渣富集物。

经计算，1g甘草渣富集物可以制备得到792mg光甘草定。

光甘草定标准品、甘草渣富集物、光甘草定的HPLC色谱图如图1所示，甘草渣富集物中光甘草定的HPLC归一化纯度为87.8％，光甘草定的HPLC归一化纯度为98.4％。

可见，上述HSCCC可以从甘草渣粗提物中一步法制备得到富含光甘草定的甘草渣富集物，其中光甘草定的含量在85％以上，该甘草渣富集物既可以用作化妆品原料，又可以作为精制光甘草定的原料。进一步地，本发明重结晶方法可以从上述甘草渣富集物中精制得到纯度在98％以上的光甘草定，步骤精简，无需借助于柱层析，适合于工业化。

实施例2：甘草渣富集物的祛斑美白活性

溶液配制：

L-酪氨酸溶液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解L-酪氨酸制成浓度为0.4mg/mL的溶液；

酪氨酸酶溶液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解稀释酪氨酸酶制成100U/mL的溶液；

待测液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解稀释实施例1制备的甘草渣富集物，制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液。

反应体系及反应参数：

按照表1组成构建反应体系，先准确移取1.0mL L-酪氨酸溶液于10mL试管中，再加入待测液，于30℃水浴保温20min，再准确移取1.0mL酪氨酸酶溶液，混匀，在30℃下反应10min，空白对照以磷酸缓冲液(pH＝6.8)代替，重复实验3次。反应后迅速将反应液移至石英比色皿中，于475nm下测定溶液的吸光度值。

表1反应体系组成

根据如下公式计算待测液对酪氨酸酶活性的抑制率I。

式中，A1为未加待测液但加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A2为未加待测液且未加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A3为加待测液并加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A4为加待测液而未加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值。

不同浓度甘草渣富集物对酪氨酸酶活性的抑制率曲线如图2所示，可见甘草渣富集物对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，且呈现浓度依赖性。

实施例3：光甘草定的祛斑美白活性

溶液配制：

L-酪氨酸溶液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解L-酪氨酸制成浓度为0.4mg/mL的溶液；

酪氨酸酶溶液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解稀释酪氨酸酶制成100U/mL的溶液；

待测液：用磷酸缓冲液(pH＝6.8)溶解稀释实施例1制备的光甘草定，制成浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/mL的溶液。

反应体系及反应参数：

按照表2组成构建反应体系，先准确移取1.0mL L-酪氨酸溶液于10mL试管中，再加入待测液，于30℃水浴保温20min，再准确移取1.0mL酪氨酸酶溶液，混匀，在30℃下反应10min，空白对照以磷酸缓冲液(pH＝6.8)代替，重复实验3次。反应后迅速将反应液移至石英比色皿中，于475nm下测定溶液的吸光度值。

表2反应体系组成

根据如下公式计算待测液对酪氨酸酶活性的抑制率I。

式中，A1为未加待测液但加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A2为未加待测液且未加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A3为加待测液并加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值；A4为加待测液而未加酪氨酸酶时的反应体系的吸光值。

不同浓度光甘草定对酪氨酸酶活性的抑制率曲线如图3所示，可见光甘草定对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，且呈现浓度依赖性。

Claims (7)

1.一种光甘草定的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）甘草渣的提取

将干燥的甘草渣粉碎过筛，加入体积百分浓度为95%的乙醇水溶液，超声破碎提取；抽滤，滤液浓缩至干，得到甘草渣粗提物；

（2）高速逆流色谱一步法制备富含光甘草定的甘草渣富集物

溶剂体系为体积比7:5:8:4的二氯甲烷:丙酮:正丁醇:水，以上相为流动相，下相为固定相；将上述甘草渣粗提物用等体积比混合的上相、下相混合溶剂溶解，作为上样溶液；流动相流速3mL/min、温度25℃、转速850r/min；具体操作方法为：先将固定相以30mL/min流速泵满HSCCC螺旋管，打开色谱仪，调节螺旋管转速，洗脱模式调为反接正转，转速850r/min，转速稳定后将流动相以3mL/min泵入螺旋管中，待流动相从螺旋管流出后，继续泵入流动相平衡30min，然后将上样溶液通过进样阀注入螺旋管，并开始计时，收集120~150min流出液，浓缩至干即得富含光甘草定的甘草渣富集物；

（3）重结晶法制备光甘草定

取适量甘草渣富集物溶于1, 2-丙二醇，再加入四倍于1, 2-丙二醇体积的水，轻轻振荡均匀，4℃放置，收集析出物，用4℃预冷的丙酮洗涤，重复结晶1次，用4℃预冷的丙酮洗涤，吹干，即得光甘草定。

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（1）粉碎后过40目筛。

3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（1）料液比为1g:20mL。

4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（1）超声破碎提取的参数为：频率30 kHz，超声功率400 W，提取60min。

5.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（2）上样浓度为20mg/mL。

6.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（2）上样体积为10mL。

7.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（3）取甘草渣富集物溶于1,2-丙二醇配成浓度为20mg/mL的溶液。

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