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CN110526991A - 靶向fap的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

靶向fap的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110526991A
CN110526991A CN201810532071.4A CN201810532071A CN110526991A CN 110526991 A CN110526991 A CN 110526991A CN 201810532071 A CN201810532071 A CN 201810532071A CN 110526991 A CN110526991 A CN 110526991A
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fap
cell
chimeric antigen
antigen receptor
encoding gene
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万晓春
李欣
唐超
刘绿艳
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Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种靶向FAP的嵌合抗原受体CAR‑FAP及靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞。所述CAR‑FAP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FAP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑FAP可以专一性地靶向表达FAP的肿瘤细胞，并以CD27信号区作为共刺激信号区，激活T细胞发挥细胞免疫作用，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤FAP阳性肿瘤细胞，具有持久的细胞活力和杀伤力。本发明还提供了该靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备方法、带该CAR‑FAP编码基因的重组病毒载体等。

Description

靶向FAP的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向FAP的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势。举例来说，卵巢恶性肿瘤目前死亡率居妇科生殖道恶性肿瘤的首位，当被确诊时60-70％的卵巢恶性肿瘤患者已属晚期。成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein，FAP)的异常表达可能与卵巢癌的发生、发展有关，其可促进卵巢癌细胞的增殖，侵袭和迁移，FAP常表达于卵巢癌间质成纤维细胞中。放疗、化疗等传统疗法对卵巢癌的治疗效果不佳，存在肿瘤易复发和副反应严重等问题。
CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，可以弥补传统疗法的弊端。然而目前还未有靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备和研究。因此，结合CAR-T技术，有望靶向性地治愈卵巢癌等疾病。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向FAP的嵌合抗原受体，以及包括所述靶向FAP的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向FAP的嵌合抗原受体可以专一性地靶向表达FAP的肿瘤细胞，并以CD27信号区作为共刺激信号区，激活T细胞发挥细胞免疫作用，并促进其在体内扩增，高效且特异性地杀伤FAP阳性肿瘤细胞，更好地维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力。
第一方面，本发明提供了一种靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP，所述CAR-FAP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FAP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向FAP的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述共刺激信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，包括如本发明第一方面所述的靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向FAP的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述CD27信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述CD27信号区的氨基酸序列的羧基端与所述第一信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
可选地，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
可选地，所述靶向FAP的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
所述靶向FAP的单链抗体，能够特异性识别肿瘤细胞上的FAP蛋白，并与其发生特异性结合，对恶性肿瘤细胞，特别是对表达FAP的卵巢癌间质成纤维细胞具有较强的亲和活性及内化活性。
本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向FAP的单链抗体与肿瘤上的FAP结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD27胞内共刺激信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。可选地，所述CD27胞内共刺激信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:2。
可选地，所述第一信号区包括CD3ζ信号区和FcεRIγ信号区中的一种或多种。进一步可选地，所述第一信号区为CD3ζ信号区。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:11。
可选地，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述CD27信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述CD27信号区的氨基酸序列的羧基端与所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
此种情况下，CD3ζ信号区作为所述T细胞的信号传导结构域(即，第一信号区)，CD27信号区作为所述T细胞的共刺激结构域，在它们的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。特别地，选用如SEQ ID NO：10的CD27信号区作为共刺激结构域，可以更好地提升后续T细胞的扩增能力、杀伤活力。
可选地，所述CAR-FAP的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-FAP的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-FAP的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:4。
本发明第一方面提供的所述靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP以及本发明第二方面提供的所述靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，受体CAR-FAP可供所述CAR-T细胞专一性地靶向表达FAP的肿瘤细胞，在CAR-FAP与FAP蛋白结合后，激活所述CAR-T细胞的免疫作用，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤表达FAP的恶性肿瘤。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第一方面所述的靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的编码基因。
可选地，所述CAR-FAP的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-FAP的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。如SEQID NO：13所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列相比，多了下述连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-FAP表达到细胞表面。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
更进一步可选地，所述慢病毒载体包括pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个。具体地，当所述慢病毒载体为pWPXLD载体时，所得重组病毒载体中，CAR-FAP的编码基因位于pWPXLD载体的BamHⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体为一安全可靠的载体工具，可以高效地转移所述CAR-FAP的编码基因。所述重组病毒载体可用于制备携带有所述CAR-FAP编码基因的病毒，及制备靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞，使所述T细胞持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。进一步可选地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第四方面提供的所述宿主细胞用于提供将如第二方面所述的重组病毒载体进行组装并制备生成相应病毒的场所，由宿主细胞制备的病毒携带有所述CAR-FAP的遗传信息，具有强侵染性。
第五方面，本发明提供了一种靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向FAP的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述共刺激信号区的5’端相连，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-FAP重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-FAP重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向FAP的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述CD27信号区的编码基因的5’端相连，所述CD27信号区的编码基因的3’端与所述第一信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-FAP表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:14。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-FAP的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。
进一步可选地，所述CAR-FAP的编码基因序列如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列相比，多了所述连接肽的编码基因，但在所述嵌合抗原受体CAR-FAP表达到细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的所述嵌合抗原受体CAR-FAP的氨基酸序列中并未带有如SEQ ID NO：14所示的信号肽的氨基酸序列。
所述CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-FAP的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)，与pWPXLD载体中BamH1酶切位点(ggatcc)相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点(gaattc)相连，这样就使所述CAR-FAP的编码基因位于BamH1和EcoR1酶切位点之间。
可选地，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选地，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体地，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向FAP的单链抗体、如第二方面所述的靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞或如第五方面所述的制备方法制得的靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备诊断和/治疗恶性肿瘤的药物中的应用。特别地，可用于诊断和/或治疗表达FAP的恶性肿瘤，例如卵巢癌。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向FAP的单链抗体、如第二方面所述的靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-FAP重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的基因序列
分别制备信号肽、靶向FAP的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：15所示，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述CD27信号区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向FAP的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的编码基因，所述CAR-FAP的编码基因如SEQ ID NO：5所示。
(2)构建pWPXLd-CAR-FAP重组质粒
将CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-FAP的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-FAP重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-FAP重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-FAP重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
本发明提供的靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞对表达FAP的肿瘤细胞的杀伤力较高，并能够较好地保护患FAP阳性的肿瘤(例如成熟T细胞淋巴瘤)的小鼠免于肿瘤导致的死亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 靶向FAP的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Asp Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr
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Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
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Arg Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn
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Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser
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Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
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Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu
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Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro
20 25 30
Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacattgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagtca gagcctttta tattctagaa atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtatcagc agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tcttttggga tagcactagg 180
gaatctgggg tacctgatag gttcagtggc agtgggtttg ggacagactt caccctcacc 240
attagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttagctat 300
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Asp Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
165 170 175
Arg Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn
180 185 190
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser
195 200 205
Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
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Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
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Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
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Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
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Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
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Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Ala Ala Arg Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
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Leu Pro Pro Arg

Claims (10)

1.一种靶向FAP的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FAP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向FAP的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述共刺激信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向FAP的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的靶向FAP的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述第一信号区包括CD3ζ信号区。
4.如权利要求3所述的靶向FAP的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR-FAP的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
5.一种靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的靶向FAP的嵌合抗原受体。
6.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求1-4任一项所述的靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的编码基因。
7.如权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-FAP的编码基因包括如SEQID NO：5所示的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求7所述的重组病毒载体。
9.一种靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向FAP的嵌合抗原受体CAR-FAP的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向FAP的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向FAP的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述共刺激信号区的5’端相连，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-FAP的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-FAP重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-FAP重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的靶向FAP的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的或如权利要求9所述的制备方法制得的靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求6-7任一项所述的重组病毒载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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