CN110511997A

CN110511997A - 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110511997A
Application number: CN201810494478.2A
Authority: CN
Inventors: 刘相林; 赵荣淞; 邹鸿志
Original assignee: Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2019-11-29
Also published as: SG11202011367TA; TW202003543A; AU2019274886A1; RU2770928C1; WO2019223516A1; US20210207222A1; US11884982B2; TWI741299B; JP2021523730A; JP7133039B2; AU2019274886B2; CA3100912C; EP3798314A1; KR20210013103A; CA3100912A1; MY201193A; PH12020551980A1; EP3798314A4

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用。本发明通过研究发现：通过检测COL4A1基因启动子区的甲基化水平，可以很好的从正常人的粪便标本中区分出结直肠癌标本。本发明就是利用含有该基因的甲基化试剂来检测结直肠癌的，并且对肠癌的检测敏感性和特异性非常高。

Description

肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌，又称为大肠癌，是一种常见的消化道恶性肿瘤。其发病率在我国逐年升高，在我国部分沿海地区比如上海和广州，大肠癌发病率已跃居第二位，仅次于肺癌。目前认为肠癌的形成是遗传缺陷和表观遗传缺陷累积的结果。结直肠癌早期发病隐匿，常无明显症状，晚期可出现便血、腹痛、腹泻等症状。而当出现症状就诊时常常是晚期，这给病人带来极大的痛苦和昂贵的治疗费用。因此早发现、早诊断、早治疗是降低结直肠癌发病率和死亡率的一项重要措施。

筛查可以早期发现肠癌和癌前病变，并去除病灶，从而阻止肠癌的发生。目前大肠癌的筛查方法主要有隐血试验和肠镜检查。隐血试验存在易受食物影响或对腺瘤检出率不高的问题。肠镜虽是肠癌诊断金标准，但作为筛查手段使用时人群依从性不高。因此急需一种准确性高、依从性高的肠癌筛查方法。

粪便基因检测作为一种新的肠癌筛查方法，现在越来越受到重视。该方法于2016年纳入美国的肠癌筛查指南。该方法具有方便、无创、对肠癌和癌前病变腺瘤的检出率高等特点。要做成对肠癌检测高性能的粪便基因检测试剂盒，主要需要克服两大障碍：粪便DNA的提取和标志物选择。一方面，粪便中成分复杂，对下游反应的抑制物多，还有许多细菌DNA，要从这样的混合物中提取出人的目标基因，需要一套高敏的基因提取和纯化方法；另一方面，目前和肠癌相关的标志物很多，尤其是DNA甲基化标志物，因为研究表明，DNA甲基化是肿瘤形成的早期事件。但很多甲基化标志物在细胞、组织层面表现很好，当用于粪便、血液等筛查媒介时，其对肠癌的敏感性和特异性就显著降低，比如vimentin基因，其在组织中的敏感性有83％，在粪便标本中就降到了46％，类似的还有SFRP1、SFRP2等基因，这样的标志物无法满足真正用于肠癌临床检测的需求。因此，挑选在粪便中对肠癌有极高检测敏感性和特异性的标志物是肠癌粪便基因检测的关键，并且这样的标志物有望真正用于肠癌的临床检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用。该肿瘤标志物在粪便中对肠癌的敏感性与组织中敏感性接近。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了COL4A1基因在制备肿瘤标志物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为结直肠肿瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，待测样本为组织、体液或排泄物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述体液包括细胞外液、组织液、血液、淋巴液、脑脊液或房水。

在本发明的一些具体实施方案中，所述排泄物为痰液、尿液或粪便。

本发明还提供了COL4A1基因的甲基化试剂，包括针对COL4A1基因的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂包括针对COL4A1基因的启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂中所述捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂中所述上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅴ、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

Ⅵ、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

Ⅶ、与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

Ⅷ、如Ⅴ、Ⅵ或Ⅶ所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂中所述下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅸ、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

Ⅹ、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

Ⅺ、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

Ⅻ、如Ⅸ、Ⅹ或Ⅺ所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂中所述探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

XIV、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

XV、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互补序列。

本发明还提供了所述的甲基化试剂在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂的应用中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂的应用中所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂的应用中待测样本为组织、体液或排泄物。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂的应用中所述体液包括细胞外液、组织液、血液、淋巴液、脑脊液或房水。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化试剂的应用中所述排泄物为痰液、尿液或粪便。

本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒，包括所述的甲基化试剂及试剂盒中常用的试剂。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒所检测的肿瘤为结直肠肿瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒所检测的肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒所检测的待测样本为组织、体液或排泄物。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒所检测的体液包括细胞外液、组织液、血液、淋巴液、脑脊液或房水。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒所检测的排泄物为痰液、尿液或粪便。

本发明还提供了一种肿瘤的检测方法，通过检测COL4A1基因的甲基化水平，区分正常样本和肿瘤样本。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提通过检测COL4A1基因启动子区及启动子区附近区域的甲基化水平，区分正常样本和肿瘤样本。

在本发明的一些具体实施方案中，甲基化水平采用所述的甲基化试剂或所述的试剂盒检测。

在本发明的一些具体实施方案中，检测标准为：根据界值判断肿瘤标本和正常标本，粪便标本中的Ct值的界值为32～42，优选地，粪便标本中的Ct值的界值为35.2，粪便标本的Ct值小于所述Ct值的界值则判断为肿瘤标本，粪便标本的Ct值大于等于所述Ct值的界值则判断为正常标本；组织标本中甲基化水平值的界值为1～10，优选地，组织标本中甲基化水平值的界值为3.9，所述组织标本的甲基化水平值大于所述甲基化水平值的界值则判断为肿瘤标本，所述组织标本的甲基化水平值小于等于所述甲基化水平值的界值则判断为正常标本。该界值可根据实际情况进行调整。

本发明通过研究发现：通过检测COL4A1基因启动子区的甲基化水平，可以很好的从正常人的粪便标本中区分出结直肠癌标本。本发明就是利用含有该基因的甲基化试剂来检测结直肠癌的，并且对肠癌的检测敏感性和特异性非常高。

与现有的检测肠癌的标志物相比，本发明提供的标志物和技术方案能够以很高的敏感性和特异度来检测出结直肠癌，并且在粪便中对结直肠癌的检出率高于组织标本，具体有以下几点：

1、本发明提供的含有COL4A1基因的甲基化试剂在粪便标本中能够在特异性为95.2％时，检测出83.8％的结直肠癌，对结直肠癌的检出率高于组织标本。

2、本发明提供的含有COL4A1基因的甲基化试剂在组织标本中能够在特异性为95.2％时，检测出81.9％的结直肠癌。

3、本发明提供的含有COL4A1基因的甲基化试剂和提取检测方法能非常方便、准确地判断出结直肠癌和正常人，该基因的甲基化试剂有望用于粪便基因检测试剂盒，并服务于肠癌的临床检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1粪便实验中，COL4A1基因检测结直肠癌的ROC曲线；

图2示实施例1粪便实验中，COL4A1基因标准曲线扩增图谱；

图3示实施例2组织实验中，COL4A1基因检测结直肠癌的ROC曲线；

图4示对比例2的19对组织实验中，SFRP1基因检测结直肠癌的ROC曲线；

图5示对比例2的36例粪便实验中，SFRP1基因检测结直肠癌的ROC曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

选取163例粪便标本(80例结直肠癌，83例正常，均经肠镜或病理确诊)，进行研磨离心，加入100ul捕获磁珠(含有COL4A1基因的捕获序列)，并按如下所述技术方案操作：

技术方案如下：

1)收集有肠镜结果的正常人和结直肠肿瘤病人的粪便标本，按1g粪便：4mL保护液混合研磨后5000rpm离心10min，取上清弃沉淀；

2)取出10mL上清再次离心，取上清3.2mL加入2mL裂解液和100ul捕获磁珠M1，92℃孵育10min，然后室温放置1h；

3)置于磁力架上弃部分上清后洗下磁珠转移至2mL离心管，加入800ul洗液W1，室温1300rpm孵育1min，置于磁力架上吸去上清，重复3次；

4)加入55ul洗脱液，92℃ 1300rpm孵育10min，置于磁力架上，3min内转移50ul洗脱液至新的EP管中；

5)用EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)对上一步骤中的DNA片段进行甲基化处理，最后的洗脱液15ul用于qMSP检测。

最后得到Bisulfite转化后的DNA 15ul。然后进行qMSP检测COL4A2的甲基化水平。

qMSP反应体系：25ul(无核酸酶水8.2ul，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer5ul，MgCl2(25mM)5ul，dNTPs(10mM)1ul，GoTaq Hot Start polymerase 0.5ul，Forwardprimer(100uM)0.125ul，Reverse primer(100uM)0.125ul，Probe(100uM)0.05ul，DNA5ul)。反应程序：95℃4min，(95℃20s，56℃30s，72℃30s)×45Cycles，37℃30s。

最后根据标准曲线计算基因在标本中的拷贝数。

COL4A1基因发生甲基化的位点相对恒定，主要位于启动子区或附近的CpG岛上。针对这些区域设计了其中一组捕获序列、引物和探针，并用于COL4A1基因甲基化试剂中。

试剂中含有的捕获序列、引物探针如下：

COL4A1的捕获序列：

5’-CTGCCCGGCGTGCGGGGGCCGCGGCGGACAGCTAGCTCTC-3’

COL4A1的qMSP引物探针：

Forward Primer：5’-CGTTTGGAGTCGTCGTATTC-3’

Reverse Primer：5’-CGACGAACAACTAACTCTCG-3’

Probe：5’-CGTAGCGTTGGAAGTTCGGTTTTT-3’

粪便实验中，COL4A1基因检测结直肠癌的ROC曲线如图1所示：

对于结直肠癌，COL4A1基因的检测敏感性是83.8％(67/80)，特异性为95.2％(79/83)，ROC曲线下面积是0.965(95％CI：0.941-0.989，p<0.0001)。

粪便实验中，COL4A1基因标准曲线扩增图谱如图2所示：

标曲扩增效率为103％，线性度R²＝0.993。

表1

表1注：“无扩增”表示无扩增曲线，无Ct数据，属于大于界值的范围。

实施例2

选取105对结直肠癌与癌旁正常组织标本(均经肠镜或病理确诊)，根据Protocol，分别用QIAamp DNA Kit(QIAGEN)提取组织DNA，然后用EZ DNA Methylation Kit(ZymoResearch)转化DNA。

然后进行qMSP检测COL4A1的甲基化水平。

qMSP反应体系和反应步骤同实施例1的粪便实验。最后根据标准曲线计算基因在标本中的甲基化值：(Target/ACTB)*100。所用的qMSP引物探针同实施例1。

组织实验中，COL4A1基因检测结直肠癌的ROC曲线如图3所示：

对于结直肠癌，COL4A1基因的检测敏感性是81.9％(86/105)，特异性为95.2％(100/105)，ROC曲线下面积是0.884(95％CI：0.829-0.939，p<0.001)。

表2

对比例1

目前有研究用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)对粪便标本的DNA进行提取，然后用甲基化特异性PCR(MSP)或定量甲基化特异性PCR(qMSP)来定性或定量检测标本中标志物的水平。其中通过MSP来检测结直肠癌因需要跑电泳，操作更不方便，且有产物污染风险；通过QIAamp DNA Stool Mini Kit来提取粪便中的DNA为人和细菌的总DNA，真正人的肿瘤DNA极少，不利于后续PCR检测。

对比例2

有研究表明SFRP1基因甲基化与肠癌有关，在粪便中检测该基因的甲基化程度，可以检出结直肠癌。在53例粪便标本(29例肠癌、7例腺瘤、17例正常)实验中，在特异性为86％时，可检出89％的结直肠肿瘤。(Zhang W,Bauer M,Croner RS,Pelz JO,Lodygin D,Hermeking H,Sturzl M,Hohenberger W,Matzel KE.DNA stool test for colorectalcancer:Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1gene.DISEASES OF THE COLON&RECTUM 2007；50(10):1618-26；discussion 1626-7.)

在19对组织和36例粪便标本中同样检测了SFRP1基因的甲基化水平，靶基因提取方法同实施例1和2。19对组织实验中，SFRP1基因检测结直肠癌的ROC曲线如图4所示：

对于结直肠癌组织，SFRP1基因的检测敏感性是89％，特异性为95％，ROC曲线下面积是0.972(95％CI：0.929-1，p<0.001)。

36例粪便实验中，SFRP1基因检测结直肠癌的ROC曲线如图5所示：

对于结直肠癌，SFRP1基因的检测敏感性是67％，特异性为94％，ROC曲线下面积是0.892(95％CI：0.790-0.994，p<0.0001)。

由此可见，SFRP1基因对结直肠癌组织具有较高的检测敏感性和特异性，而在粪便标本中其敏感性就大幅降低了。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司

<120> 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

<130> MP1801594

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcccggcg tgcgggggcc gcggcggaca gctagctctc 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtttggagt cgtcgtattc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacgaacaa ctaactctcg 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtagcgttg gaagttcggt tttt 24

Claims

1.COL4A1基因在制备肿瘤标志物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠肿瘤。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，待测样本为组织、体液或排泄物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述排泄物为痰液、尿液或粪便。

6.COL4A1基因的甲基化试剂，其特征在于，包括针对COL4A1基因的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。

7.如权利要求6所述的甲基化试剂，其特征在于，包括针对COL4A1基因的启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。

8.如权利要求6或7所述的甲基化试剂，其特征在于，所述捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

III、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

9.如权利要求6至8任一项所述的甲基化试剂，其特征在于，所述上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅴ、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

Ⅶ、与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

Ⅷ、如Ⅴ、Ⅵ或Ⅶ所示序列的互补序列；

所述下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅸ、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

Ⅺ、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

Ⅻ、如Ⅸ、Ⅹ或Ⅺ所示序列的互补序列。

10.如权利要求6至9任一项所述的甲基化试剂，其特征在于，所述探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

XV、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的CpG岛获得的功能相近的核苷酸序列；

XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互补序列。

11.如权利要求6至10任一项所述的甲基化试剂在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠肿瘤。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

14.如权利要求11至13任一项所述的应用，其特征在于，待测样本为组织、体液或排泄物。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述排泄物为痰液、尿液或粪便。

16.一种检测肿瘤的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6至10任一项所述的甲基化试剂及试剂盒中常用的试剂。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为结直肠肿瘤。

18.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。

19.如权利要求16至18任一项所述的试剂盒，其特征在于，待测样本为组织、体液或排泄物。

20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述排泄物为痰液、尿液或粪便。

21.一种肿瘤的检测方法，其特征在于，通过检测COL4A1基因的甲基化水平，区分正常样本和肿瘤样本。

22.如权利要求21所述的检测方法，其特征在于，通过检测COL4A1基因启动子区及启动子区附近区域的甲基化水平，区分正常样本和肿瘤样本。

23.如权利要求21或22所述的检测方法，其特征在于，甲基化水平采用如权利要求6至10任一项所述的甲基化试剂或如权利要求16至18任一项所述的试剂盒检测。

24.如权利要求21或22所述的检测方法，其特征在于，其检测标准为：根据界值判断肿瘤标本和正常标本，粪便标本中的Ct值的界值为32～42，所述粪便标本的Ct值小于所述Ct值的界值则判断为肿瘤标本，所述粪便标本的Ct值大于等于所述Ct值的界值则判断为正常标本；

组织标本中甲基化水平值的界值为1～10，所述组织标本的甲基化水平值大于所述甲基化水平值的界值则判断为肿瘤标本，所述组织标本的甲基化水平值小于等于所述甲基化水平值的界值则判断为正常标本。