CN110499665A - 碳酸钙包裹dna-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法 - Google Patents
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Abstract
碳酸钙包裹DNA‑荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，先将DNA和荧光染料与明胶溶液混合，交联剂交联固化使DNA和荧光染料包裹在明胶纳米凝胶网格中，再将碳酸钙包裹纳米凝胶得到碳酸钙包裹DNA‑荧光染料复合纳米凝胶，使DNA和荧光染料与外界隔绝，制备得到一种保存周期长、结构稳定、易于检测的明暗双防伪涂料；明防伪由荧光染料实现；暗防伪由DNA实现；由于DNA的未知性和可扩增性，只有知道DNA序列并设计出特定引物，通过聚合酶链式反应扩增和电泳分析才能检测出DNA，从而实现暗防伪；本发明实现了难易搭配、协同防伪的目标，大大增强了防伪效果和假冒难度。
Description
技术领域
本发明涉及一种防伪涂料制备方法，具体涉及一种碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法。
背景技术
近年来，制假售假行为日渐猖獗，严重损害了正常的商业行为和消费者利益，也严重制约了国民经济的健康发展和国家形象。因此，防伪技术随之应运而生。所谓防伪，即一物一码，利用特定的技术措施、材料、技术装备识别真伪并防止假冒、仿造产品。传统的防伪技术包括：激光防伪，数码防伪，纹理防伪，荧光防伪等。这些防伪技术都是明防伪，不需要破坏样品。但随着技术水平的提升，由于上述防伪编码不够复杂，破译难度低，导致假冒产品也能配备同样的防伪标识，防伪标识达不到防伪目的。
DNA是人类遗传信息的存储分子，极富变化性，具有高度保密性，是一种天然防伪原料。由此，基于DNA序列的防伪技术受到人们的广泛关注。DNA防伪技术具有保密性高，安全性好，保存期长，适用范围广等优点，是一种重要的暗防伪技术，在不知道DNA序列的条件下难以破译。近年来，基于DNA的防伪技术有了明显的发展，如孟庆飞等人将聚乙二醇等聚合物包裹dDNA片段和近红外染料掺入墨水中制备形成适用于压电式高速喷墨打印机的隐形红外吸收喷墨墨水(专利号：CN104371423A),但这两种防伪体系并不在同一纳米体系中；张毅设计了一种基于DNA和纳米颗粒的基因示踪与防伪纳米颗粒，将带负电的DNA吸附在带正电的纳米颗粒上，再在纳米颗粒表面生成SiO2壳，得到SiO2包埋的纳米颗粒以保护DNA(专利号：CN107699609A)；刘永春等人则利用生物材料明胶包裹DNA再交联固化得到一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料(专利号：CN103289468B)。虽然上述专利已经实现有效的DNA防伪，但由于DNA防伪是暗防伪，测定时需要破坏样品并提取扩增DNA，需要电泳甚至测序仪等专业的仪器设备，操作比较复杂耗时，测定以后样品不能再次使用，缺乏一种简单、不破坏样品的明防伪方法与之配合。如果在DNA暗防伪检测上增加荧光染料用于明防伪就可以实现明暗两种防伪技术一体化，达到既可以不破坏样品的简单荧光明防伪功能，又可以通过破坏样品实现精确的DNA暗防伪目的。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，实现对产品的荧光和DNA明暗双重防伪，并通过碳酸钙壳保护DNA和荧光染料不被外部环境干扰；将DNA和荧光染料通过静电相互作用吸附在明胶纳米颗粒中，通过交联剂交联明胶分子形成微凝胶网格将DNA和荧光染料包裹在纳米颗粒中，并在微凝胶孔隙中填入碳酸钙矿化材料保护DNA，避免DNA与涂料和空气的直接接触；该技术保护效果好，成本低廉、材料绿色环保无毒害，适用于各类商品的防伪。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，包括以下步骤：
步骤一、从生物体DNA中采集DNA序列，根据采集到的DNA序列设计相对应的引物，使用聚合酶链式反应(以下简称PCR)截取长度为200-1000bp的DNA片段并扩增。
步骤一所述的引物使用Primer Pemier5.0软件设计。
DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μL Taq DNA聚合酶混合液Taq DNAmaster mix,1μL 1mg/mL DNA模板，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；最后72℃再延伸5分钟，使引物延伸完全，终止反应。
所述生物体DNA包括鱼精DNA，质粒DNA，λ-DNA或pUC18DNA中的一种。
步骤二、按5％-10％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL明胶溶液滴加到40℃下预热的50mL纯水中，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为100转/分；依次滴加1mL冰乙酸，0.5-1mL 0.5mg/mL荧光染料，0.1-1mL的步骤一所得DNA扩增溶液，调整温度至25℃，持续搅拌0.5-4小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除大颗粒明胶颗粒，得到上清液。
荧光染料为曙红-B，酸性红-94，荧光素，四氯荧光素，异硫氰酸荧光素中的一种。
步骤三、往步骤二所得上清液中滴入20-80μL交联剂，在25℃恒温水浴环境下持续搅拌4-12小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络以包裹荧光染料和DNA，反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中用纯水持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子，透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
所述交联剂分子包括戊二醛、环氧氯丙烷、氰酸酯、甲醛中的一种或任意两种混合物。
步骤四、取10mL步骤三产物上清液于玻璃瓶中，滴加0.24mol/L的50-200μL钙离子溶液,室温下按300转/分搅拌4-12小时，然后再滴加等体积的0.24mol/L碳酸根溶液，搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。
所述碳酸根溶液包括碳酸钠溶液，碳酸钾溶液，碳酸铵溶液中的一种；所述钙离子溶液包括氯化钙溶液，硝酸钙溶液，乙酸钙溶液，溴化钙溶液中的一种。
步骤五、取0.005-0.05g上清液冻干粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料。
本发明的优点：
1、本发明利用明胶包裹DNA和荧光染料并交联制成DNA-荧光染料纳米微凝胶，并在其表面包裹一层碳酸钙壳层，最后将该体系分散在涂料中，即制得防伪涂料。该体系不仅同时实现荧光防伪和DNA防伪搭配的明暗双重防伪，同时碳酸钙保护壳和天然产物明胶的使用，可以最大限度地保护DNA不被破坏。不仅如此，该体系所用材料均具有较高生物相容性，绿色环保，完全适用于各类商品的防伪。
2、荧光防伪检测：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯辐射滤纸，能够显现出“DNA”字样，即所得产物能够实现荧光防伪。
3、DNA防伪检测：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。利用异丙醇沉淀提取DNA。根据特定的PCR引物，扩增提取所得的DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察到目标条带，即所得产物能够实现DNA防伪。
附图说明
图1为碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的制备流程。
图2为碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的透射电镜图片，其中：图2A为实施例一结果，图2B为实施例二结果。
图3为实施例一中碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的水溶液照片和荧光照片；其中：图3A为水溶液照片，图3B为荧光照片。
图4为实施例一中碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的荧光防伪效果图。
图5为碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的DNA防伪效果图，其中：图5A为PCR流程图；图5B为琼脂糖凝胶成像照片(第1,2条带为实施例一结果，第2,3条带为实施例二结果)。
具体实施方式
本发明提供了一种碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料的制备流程，下面结合附图与具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例一
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶明暗双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从质粒DNA采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计引物并通过PCR截取得到长度为720bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μLTaq DNA聚合酶混合液,1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序参照图5A：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按10％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加到40℃下预热的50mL纯水中，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，1mL 0.5mg/mL曙红-B荧光染料溶液，0.2mL的步骤一所得DNA扩增溶液到上述体系，缓慢降温至25℃，持续搅拌4小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、往上述上清液中滴入20μL 25％(w/v)戊二醛交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌12小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹荧光染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中用纯水持续透析12小时以上，除去未反应的戊二醛分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加100μL氯化钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(300转/分)12小时，然后再缓慢滴加相同体积的碳酸钠溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，上清液冻干得到粉末。该纳米颗粒体系透射电镜结果如图2A所示(81.1±16.8nm)。其水溶液明场照片和紫外灯激发荧光照片如图3A、B所示。
步骤五、取0.005g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯辐射滤纸，观察是否显现出“DNA”字样。荧光防伪结果如图4所示，可以清晰地看到“DNA”字样的荧光图片。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。根据软件设计所得引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，DNA防伪结果如图5B第1，2条带所示，特定序列引物PCR扩增目标DNA后，凝胶电泳分离得到较为清晰的720bp目标DNA条带。
实施例二
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从λ-DNA采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计引物并通过PCR截取得到长度为200bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μL TaqDNA聚合酶混合液，1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按10％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加到50mL 40℃下预热的纯水，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，0.5mL 0.5mg/mL酸性红-94荧光染料溶液，0.2mL的步骤一所得DNA扩增溶液到上述体系，缓慢降温至25℃，持续搅拌0.5小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、往上述上清液中滴入50μL 25％(w/v)戊二醛交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌6小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加200μL氯化钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(300转/分)12小时，然后再缓慢滴加相同体积的碳酸钠溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。该纳米体系透射电镜结果如图2B所示(562.3±64.7nm)，可以看见清晰的核壳结构纳米颗粒。
步骤五、取0.05g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶明暗双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯辐射滤纸，观察到“DNA”字样的出现。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。根据设计所得引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察是否存在目标条带。DNA防伪结果如图5B第3，4条带所示，使用特定引物序列PCR扩增目标DNA后，凝胶电泳分离得到较为清晰的200bp的目标DNA条带。
实施例三
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶明暗双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从质粒DNA采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计引物并通过PCR截取得到长度为350bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μLTaq DNA聚合酶混合液,1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按5％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加40℃下预热的50mL纯水，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，1mL0.5mg/mL酸性红-94荧光染料溶液，0.50mL的步骤一所得DNA扩增液到上述明胶溶液中，缓慢降温至25℃，持续搅拌4小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、上述上清液滴入80μL环氧氯丙烷交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌4小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加50μL溴化钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(300转/分)12小时，然后再缓慢滴加相同体积的碳酸钾溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。
步骤五、取0.05g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯照射滤纸，观察到“DNA”字样的出现。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。设计合适引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察目标条带。
实施例四
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从鱼精DNA采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计引物并通过PCR截取得到长度为1000bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μLTaq DNA聚合酶混合液,1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按8％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加50mL 40℃下预热的纯水，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，0.8mL 0.5mg/mL荧光素溶液，0.1mL的步骤一所得DNA扩增液到上述明胶溶液中，缓慢降温至25℃，持续搅拌1小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、往上述上清液中滴入50μL戊二醛/环氧氯丙烷(质量比为1:1)混合交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌4小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加100μL乙酸钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(200转/分)4小时，然后再缓慢滴加100μL的碳酸钾溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。
步骤五、取0.01g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶子双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯辐射滤纸，观察到“DNA”字样的出现。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。根据设计所得引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察目标条带。
实施例五
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从鱼精DNA中采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计引物并通过PCR截取得到长度为1000bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μL Taq DNA聚合酶混合液,1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按10％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加50mL 40℃下预热的纯水，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，1mL0.5mg/mL四氯荧光素溶液，1mL的步骤一所得DNA扩增液到上述明胶溶液中，缓慢降温至25℃，持续搅拌0.5小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、上述上清液滴入50μL氰酸酯交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌4小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加100μL硝酸钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(200转/分)4小时，然后再缓慢滴加100μL的碳酸氨溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。
步骤五、取0.01g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶明暗双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯辐射滤纸，观察到“DNA”字样的出现。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。根据设计所得引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察目标条带。
实施例六
按照图1所示路线制备碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料，具体步骤如下：
步骤一、从pUC18DNA中采集DNA序列，使用Primer Pemier5.0软件设计恰当引物并通过PCR截取300bp的DNA片段并扩增。DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μL TaqDNA聚合酶混合液(Taq DNA master mix),1μL 1mg/mL模板DNA，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；72℃再延伸5分钟，使扩增DNA序列延伸完全，终止反应。
步骤二、按8％(w/v)的浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL上述溶液滴加到50mL 40℃下预热的纯水中，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为300转/分。依次滴加1mL冰乙酸，1mL 0.5mg/mL异硫氰酸荧光素溶液，0.5mL的步骤一所得DNA扩增液到上述明胶溶液中，缓慢降温至25℃，持续搅拌0.5小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除聚集的大颗粒明胶颗粒。
步骤三、上述上清液滴入50μL甲醛交联剂，在25℃恒温水浴环境下搅拌4小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络包裹染料和DNA。反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子。透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液。
步骤四、取10mL上述上清液于玻璃瓶中，滴加150μL氯化钙溶液(0.24mol/L),室温下快速搅拌(200转/分)6小时，然后再缓慢滴加相同体积碳酸氨的溶液(0.24mol/L)，快速搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干。
步骤五、取0.01g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹的DNA-荧光染料复合纳米凝胶明暗双防伪涂料。
本实施例防伪测试：
荧光防伪：将防伪涂料均匀在滤纸上涂抹成“DNA”字样，自然挥发干燥。在较暗环境下，用紫外灯照射滤纸，观察到“DNA”字样的浮现。
DNA防伪：将防伪涂料均匀涂抹在滤纸上制成防伪标签，自然挥发干燥。将该纸片投入烧杯中并加入0.1mol/L的盐酸除去碳酸钙保护壳，再加入等体积氯仿萃取DNA荧光明胶纳米颗粒。异丙醇沉淀提取DNA。根据设计所得引物，PCR扩增所得DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，凝胶成像仪观察存在目标条带。
Claims (7)
1.碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、从生物体DNA中采集DNA序列，根据采集到的DNA序列设计相对应的引物，使用聚合酶链式反应截取长度为200-1000bp的DNA片段并扩增；
步骤二、按5％-10％的质量体积比浓度配置明胶溶液，40℃下完全溶解；取1mL明胶溶液滴加到40℃下预热的50mL纯水中，40℃下恒温搅拌，搅拌速度为100转/分；依次滴加1mL冰乙酸，0.5-1mL0.5mg/mL荧光染料，0.1-1mL的步骤一所得DNA扩增溶液，调整温度至25℃，持续搅拌0.5-4小时，3000转/分转速下离心10分钟，去除大颗粒明胶颗粒，得到上清液；
步骤三、往步骤二所得上清液中滴入20-80μL交联剂，在25℃恒温水浴环境下持续搅拌4-12小时，明胶分子相互交联形成纳米凝胶网络以包裹荧光染料和DNA，反应结束后，将上述溶液转移到7000道尔顿透析袋中用纯水持续透析12小时以上，除去未反应的交联剂分子，透析内液在3000转/分转速下离心10分钟，收集上清液；
步骤四、取10mL步骤三产物上清液于玻璃瓶中，滴加0.24mol/L的50-200μL钙离子溶液,室温下按300转/分搅拌4-12小时，然后再滴加等体积的0.24mol/L碳酸根溶液，搅拌20分钟，3000转/分下离心5分钟，取上清液冻干；
步骤五、取0.005-0.05g上清液冻干粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即制成碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料。
2.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，步骤一所述DNA扩增条件如下：50μL体系中，其中包括25μL Taq DNA聚合酶混合液Taq DNA master mix,1μL1mg/mL DNA模板，20μmol/L上下游引物各1μL和22μL去离子水；扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，重复25个循环；最后72℃再延伸5分钟，使引物延伸完全，终止反应。
3.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，步骤一所述的引物使用Primer Pemier5.0软件设计。
4.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，所述生物体DNA包括鱼精DNA，质粒DNA，λ-DNA或pUC18 DNA中的一种。
5.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，荧光染料为曙红-B，酸性红-94，荧光素，四氯荧光素，异硫氰酸荧光素中的一种。
6.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，所述交联剂分子包括戊二醛、环氧氯丙烷、氰酸酯、甲醛中的一种或任意两种的混合物，混合比例任意。
7.根据权利要求1所述的碳酸钙包裹DNA-荧光染料复合纳米凝胶双防伪涂料制备方法，其特征在于，所述碳酸根溶液包括碳酸钠溶液，碳酸钾溶液，碳酸铵溶液中的一种；所述钙离子溶液包括氯化钙溶液，硝酸钙溶液，乙酸钙溶液，溴化钙溶液中的一种。
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