CN110484575A - 一种发酵制备氨基酸碳酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵制备氨基酸碳酸盐的方法，在碳源和氮源存在下，利用菌株发酵制备含有氨基酸碳酸盐的发酵液。所述的氮源为碳酸铵、碳酸氢氨和尿素中的任意一种或者几种的组合，并采用流加氮源的方式进行发酵。本发明方法整个过程实现固废零排放，减少原辅料消耗，简化提取工艺，降低生产成本，且不影响氨基酸的生产能力。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种发酵制备氨基酸碳酸盐的生产方法。
背景技术
氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称，是构成蛋白质大分子的基础结构，几乎一切生命活动都与之有关。氨基酸在饲料、食品、医药工业以及人类健康、保健、化妆品行业等方面发挥着越来越广泛的作用。发酵产品中诸如赖氨酸、谷氨酸等是以玉米淀粉或淀粉糖为原料经发酵法制得，是玉米淀粉产业链上增值较大的产品。我国氨基酸需求量较大的氨基酸有谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和色氨酸等。
其中，赖氨酸是谷物中最缺乏的氨基酸，因此，一般来说它是第一限制性氨基酸，是限制猪、肉禽蛋白质沉积的主要氨基酸。工业生产的赖氨酸发挥着以下作用：(1)补充动物赖氨酸需要的不足；(2)改善饲料氨基酸的平衡，提高动物的生长速度；(3)改善谷物饲料的营养价值，降低动物饲粮蛋白质含量，配制低蛋白质日粮。近几年我国赖氨酸产能高速增长，2011年以来我国成为世界最大的赖氨酸生产国。谷氨酸是目前我国生产量最大的氨基酸品种，主要以谷氨酸钠(商品名味精)的形式为食品增鲜剂存在。国内苏氨酸主要使用在高档乳猪饲料中，常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸，国内苏氨酸需求量已超过2万吨。蛋氨酸由于无法在动物体内合成，需从食物中摄取，将它加入饲料中，可以促进禽畜生长、增加瘦肉量和缩短饲养周期。色氨酸是人体重要的神经递质，5-羟色胺的前体，可用作烟酸缺乏症(糙皮病)治疗药，作为安神药，调节精神节律、改善睡眠。
但是传统发酵以硫酸铵，或者氯化铵为氨基酸合成的氮源，形成的氨基酸盐易造成环境污染。具体来讲，硫酸根可以与环境中的许多金属离子结合成稳定的硫酸盐，大气中的硫酸盐形成气溶对材料有腐蚀破坏作用，危害动植物健康，而且可以起到催化作用，加重硫酸雾毒性。硫酸盐随雨水降落，是地面水和土壤中硫酸盐的重要来源，饮用水中硫酸盐含量过多可使人腹泻。扩散到水体底部沉积层的硫酸盐，由沉积层的厌氧环境导致其在还原菌的作用下可转化为S2-，形成的含硫化合物有很强的毒性，危害动植物生存环境，除了导致水发臭外，对混凝土和金属都有侵蚀破坏作用。盐酸盐的首要危害表现在对钢铁管道的腐蚀上，使管道的耐久性受到影响；此外，高浓度的含氯废水如不加治理直接排入江河，会破坏水体的自然生态平衡，使水质恶化，导致渔业生产、水产养殖和淡水资源的破坏，严重时还会影响地下水和饮用水源；当水中的氯离子达到一定浓度时，常常与对应的阳离子(钠、镁、钙离子)共同作用，使水发生不同的味觉变化，水质也会产生感官性恶化。
因此，开发绿色环保的氨基酸发酵工艺是发酵企业亟需解决的关键问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中氨基酸发酵工艺的清洁度低，酸碱消耗量大，尤其是产生大量难处理的液废与固废，成本高等缺陷，提供一种绿色环保的发酵制备氨基酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种发酵制备氨基酸碳酸盐的方法，在碳源和氮源存在下，利用菌株发酵制备含有氨基酸碳酸盐的发酵液。
其中，待初始培养液的氮源即将耗尽，通过控制补加氮源的流加速率，维持发酵液中的氮元素的浓度为0.1～10g/L，优选为0.1～2g/L。初始培养液的氮源含量为18～40g/L，优选为20～35g/L。初始培养液中氮源的种类没有特殊要求，以适合培养菌株为目标，优选氮源是蛋白胨、酵母抽提物、硫酸铵、碳酸氢铵和尿素。补加氮源优选为补加碳酸铵、碳酸氢氨和尿素中的任意一种或者几种的组合。
其中，所述的菌株为具有发酵生产氨基酸能力的菌株，例如可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)，乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，毕赤酵母菌(Pichia.pastoris)，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，本发明对菌株的种类没有特别的限定，只要是现有技术可以用于发酵生产氨基酸的菌株都适用于本发明。
其中，待初始培养液的碳源即将耗尽，通过控制补加碳源的流加速率，维持发酵液中的还原性糖的浓度为1～10g/L，优选为1～5g/L。初始培养液的还原糖浓度为20～40g/L，优选为25～35g/L。初始培养液中碳源的种类没有特殊要求，以适合培养菌株为目标，优选碳源是葡萄糖、酵母抽提物和蛋白胨。所述的补料碳源优选为葡萄糖、蔗糖或糖蜜中的任意一种或者几种的组合。
所述的补料氮源和补料碳源可根据实际情况，同时分别流加。
其中，发酵过程中，优选的方式是，调控发酵液pH值，当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5，当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得7.5≤pH值≤10。优选的，利用二氧化碳水溶液、或通入二氧化碳气体调控发酵液的pH值。
其中，本发明所述的氨基酸为赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨酸或组氨酸中的任意一种或几种的组合，其中，赖氨酸、精氨酸、组氨酸为碱性氨基酸，当发酵液中含有这些碱性氨基酸时，碱性氨基酸以正离子的形式与碳酸根离子形成盐溶液，苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸是酸性氨基酸，当发酵液中含有这三种氨基酸时，酸性氨基酸、碳酸根离子与溶液中的阳离子(如金属或铵根离子)形成盐溶液，优选的，本发明所述的氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸这些碱性氨基酸。
按照上述发酵方法制备得到的氨基酸碳酸盐发酵液可进一步进行分离得到氨基酸的精品或者粗品，用于各种用途。
具体来说，将含有氨基酸碳酸盐的发酵液经离心、板框压滤、微滤、超滤、纳滤、结晶、喷干工艺中的任意一种或者几种的组合，得到氨基酸粗品或者精品。
例如，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤浓缩液进行喷干，得到含菌体、蛋白质的氨基酸碳酸盐粗品，该粗品中，氨基酸含量一般<70％，可以用于制作饲料。
例如，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理，超滤浓缩液喷干得到不含菌体、但含有蛋白质的氨基酸碳酸盐粗品，该粗品中，氨基酸含量一般<70％，可以用于制作饲料。当然，也可以将超滤浓缩液和微滤浓缩液混合后喷干得到含菌体、蛋白质的氨基酸碳酸盐粗品，该粗品中，氨基酸含量一般<70％，可以用于制作饲料。
例如，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理以脱除蛋白和色素等大分子杂质，超滤透过液再经纳滤处理以脱除无机盐等成分，将纳滤浓缩液结晶或将纳滤浓缩液喷干，得到氨基酸碳酸盐的精品。该精品中，氨基酸碳酸盐含量一般>98％。
例如，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理以脱除蛋白和色素等大分子杂质，超滤透过液再经纳滤处理以脱除无机盐等成分，将纳滤浓缩液加入盐酸或硫酸或醋酸等酸类，一方面溶液中的碳酸根离子和这些酸类形成水和二氧化碳，另一方面溶液中的氨基酸特别是碱性氨基酸会与酸根离子形成氨基酸盐酸盐或氨基酸硫酸盐或氨基酸醋酸盐，再经结晶或喷干得到氨基酸盐酸盐或氨基酸硫酸盐或氨基酸醋酸盐的精品。该精品中，氨基酸盐的含量一般>98％。通过这种方式可以避免离子交换树脂的转盐分离就能得到其他种类的氨基酸盐，比如上述氨基酸盐酸盐或氨基酸硫酸盐或氨基酸醋酸盐。
例如，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理以脱除蛋白和色素等大分子杂质，超滤透过液再经纳滤处理以脱除无机盐等成分，将纳滤浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙进行除盐操作，搅拌6～24h，静置40～80h后离心微滤去除沉淀，再将微滤透过液以蒸发和溶析结合的方法结晶，得到氨基酸精品。该精品中，氨基酸的含量一般>98％。其中，所述的氧化钙或氢氧化钙为固体形式，或者其溶液的形式。将氧化钙或氢氧化钙投入纳滤浓缩液中，添加量以控制溶液的pH值至10.5～11为宜。本方法中形成的沉淀，灼烧的后可以再次用于氨基酸发酵液除盐。
以上分离工艺中，如果有结晶母液，可将结晶母液进行喷干，得到氨基酸或氨基酸盐的粗品，其含量一般<90％。
以上分离工艺中，在微滤操作之前，如果体系的固含量7wt％以上时，在微滤前需要预先进行离心或者板框压滤处理去除固含物，以免造成对微滤膜的损坏。
本发明中，以国标GB/T 18246-2000测定氨基酸含量，以氨基酸的分子(含H)计算。
有益效果：本发明可以用于多种氨基酸及其氨基酸盐的制备，尤其是氨基酸碳酸盐的发酵制备，整个过程工艺简单可靠，原辅料消耗少，且整个过程可以实现固废零排放，氨基酸碳酸盐用于肥料或饲料也可避免对环境的污染。该工艺显著简化提取工艺，降低生产成本，且不影响氨基酸的生产能力，可以显著提升产能水平和生产强度，将为工业品的生产工艺优化升级和实现创新驱动提供新思路。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：以尿素为补料氮源，利用谷氨酸棒状杆菌上罐发酵产赖氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
平板菌的准备：从-80℃冰箱中取出甘油菌，用10μL的移液枪挑取少量的谷氨酸棒杆菌ATCC13032以十字交叉的方式在BHI平板(37g/L BHI，2％琼脂糖)上划线，置于30℃培养箱中培养约48h，有单克隆长出取出到4℃冰箱中备用。
一级种子活化：将保存于4℃冰箱中平板菌取出到超净工作台中，用10μL的移液枪挑取单克隆到BHI试管中(37g/L BHI，20mL试管，装液量4mL)，然后置于30℃摇床中，200rpm震荡培养24h。
二级种子活化：取出30℃培养的一级种子培养液到超净工作台中，以3％的转接量(v/v)转接于BHI摇瓶中(37g/L BHI，带有三个挡板的500mL的摇瓶，装液量40mL)，然后置于30℃摇床中，180rpm震荡培养24h。
三级种子活化：取出30℃培养的二级种子培养液到超净工作台中，以5％的转接量(v/v)转接于BHI-葡萄糖摇瓶中(37g/L BHI，10g/L葡萄糖，带有单个挡板的5L的摇瓶，装液量800mL)，置于30℃摇床中，150rpm震荡培养24h。
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：葡萄糖30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母抽提物5g/L，尿素21g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，生物素：100μg/L，盐酸硫胺素：1000μg/L，0.5％消泡剂(v/v)。
补料培养基配方：氮源：尿素60g/L；碳源：葡萄糖500g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵30℃培养60h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得7.5≤pH值≤8.5，此阶段发酵液内开始大量富集赖氨酸，因赖氨酸为碱性氨基酸，纯品的等电点为9.64，故发酵液开始变碱性，通入二氧化碳可形成酸性溶液进行酸碱中和，形成的赖氨酸碳酸盐维持pH值稳定。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～2g/L，发酵周期为48h，其中赖氨酸终浓度为182g/L，碳酸转化率为52％。
对比例1：谷氨酸棒状杆菌上罐发酵产赖氨酸硫酸盐
1、种子的培养：
种子液培养方法同实施例1。
2、上罐培养基的准备
罐子培养基配方：葡萄糖30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母抽提物5g/L，硫酸铵40g/L，尿素3g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，生物素：100ug/L，盐酸硫胺素：1000ug/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L KOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：硫酸铵80g/L～160g/L；碳源：葡萄糖200g/L～400g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵30℃培养60小时。发酵过程中以5mol/L硫酸维持pH值在7.0～7.5。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～8g/L，最优的情况是残糖的含量在1～4g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.5～8g/L，最优的情况是残氮的含量在0.5～3g/L。发酵周期为48h，其中赖氨酸终浓度为160g/L，糖酸转化率为44％。
实施例2：以为碳酸铵补料氮源，利用谷氨酸棒状杆菌上罐发酵产赖氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：葡萄糖30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母抽提物5g/L，碳酸铵34g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，生物素：100μg/L，盐酸硫胺素：1000μg/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L KOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：碳酸铵42g/L～84g/L；碳源：葡萄糖200g/L～700g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵30℃培养60h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得7.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为48h，其中赖氨酸终浓度为169g/L，碳酸转化率为47％。
实施例3：以碳酸氢铵为补料氮源，利用谷氨酸棒状杆菌上罐发酵产赖氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：葡萄糖30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母抽提物5g/L，碳酸氢铵57g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，生物素：100μg/L，盐酸硫胺素：1000μg/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L KOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：碳酸氢铵42g/L～84g/L；碳源：葡萄糖200g/L～700g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵30℃培养60h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得7.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为48h，其中赖氨酸终浓度为165g/L，碳酸转化率为46％。
实施例4：以尿素为补料氮源，利用大肠杆菌上罐发酵产赖氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
所用的大肠杆菌AJ11883为本实验室保藏
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：葡萄糖30g/L、酵母提取物4g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、蛋白胨1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸铜0.02g/L、硫酸锌0.02g/L、硫酸镁0.1g/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L氢氧化钾水溶液调节pH值至6.5。
补料培养基配方：氮源：尿素42g/L～84g/L；碳源：葡萄糖200g/L～700g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵35℃培养50h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得6.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为36h，其中赖氨酸终浓度为167g/L，碳酸转化率为46％。
实施例5：以尿素为补料氮源，利用乳糖发酵短杆菌上罐发酵产赖氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
所用的乳糖发酵短杆菌ATCC13869购自美国标准生物品收藏中心；
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方葡萄糖30g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母抽提物5g/L，碳酸氢铵57g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，硫酸锰0.2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸铜0.02g/L、硫酸锌0.02g/L、硫酸镁0.1g/L，0.5％消泡剂(v/v)，生物素：100μg/L，以5mol/LKOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：尿素42g/L～84g/L；碳源：葡萄糖200g/L～700g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，150rpm，通气量8L/min，发酵35℃培养50h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得6.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为60h，其中赖氨酸终浓度为165g/L，碳酸转化率为43％。
实施例5：以尿素为补料氮源，利用钝齿棒杆菌上罐发酵产精氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
所用的钝齿棒杆菌HU7251为本实验室保藏；
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：
葡萄糖30g/L，酵母抽提物5g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，尿素：10g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸亚铁0.4g/L，硫酸铜0.02g/L，硫酸锌0.02g/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L KOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：尿素42g/L～84g/L；碳源：葡萄糖200g/L～700g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，400rpm，通气量5L/min，发酵30℃培养50h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得6.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为38h，其中精氨酸终浓度为42g/L，碳酸转化率为30％。
实施例6：以尿素为补料氮源，利用谷氨酸棒杆菌发酵产组氨酸碳酸盐
1、种子的培养：
所用的谷氨酸棒杆菌TQ2223为本实验室保藏；
种子液培养方法同实例1
2、上罐培养基的准备
发酵罐初始培养基配方：
葡萄糖30g/L，酵母抽提物5g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，尿素：10g/L，七水硫酸镁：0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸亚铁0.3g/L，硫酸锌0.02g/L，0.5％消泡剂(v/v)，以5mol/L KOH调节pH值至7.0。
补料培养基配方：氮源：尿素21g/L～42g/L；碳源：葡萄糖100g/L～300g/L。
3、上罐发酵培养：
取出30℃培养的三级种子培养液，以20％的转接量(v/v)转接于发酵罐中(10L的发酵罐，装液量4L)，400rpm，通气量5L/min，发酵30℃培养50h。将发酵罐组装成功后，接入二氧化碳和压缩空气，利用二氧化碳对发酵过程中酸碱度的调控：当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5；当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得6.5≤pH值≤10。
每隔2h取样检测罐内中残糖，待初始培养基中碳源接近耗完，调控碳源补料速度，使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在1～10g/L，最优的情况是残糖的含量在1～5g/L。每隔2h取样检测罐内氮源含量，待初始培养基中氮源接近耗完，调控氮源补料速度，使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.1～10g/L，最优的情况是残氮的含量在0.1～2g/L。发酵周期为48h，其中组氨酸终浓度为29g/L，碳酸转化率为22％。
实施例7：从发酵液中分离并制备得到赖氨酸碳酸盐粗品
发酵结束后收集得到发酵液40L，其中赖氨酸的含量为180g/L，CO3 2-的含量为55g/L。对此发酵液采用孔径为200nm的陶瓷微滤膜进行微滤，微滤过程中压力0.2Mpa，温度50℃，得到约5L含菌体的微滤浓缩液，以及35L赖氨酸微滤透过液，微滤透过液中赖氨酸的浓度约为178g/L，收率为86.5％。随后，采用膨胀造粒的方法，将微滤浓缩液进行喷雾干燥。喷干机的进口气体温度为150℃，出口的温度为75℃。收集得到的粉末即为赖氨酸碳酸盐粗品，粗品中赖氨酸盐酸盐的含量约为60％，收率为12.5％。微滤透过液用于后续工艺制备高纯度的赖氨酸碳酸盐产品，总收率为99.0％。。
实施例8：从发酵液中分离赖氨酸并制备得到高纯度赖氨酸碳酸盐产品
发酵结束后收集得到发酵液30L，其中赖氨酸的含量为150g/L，CO3 2-的含量为50g/L。然后用陶瓷膜进行微滤，膜孔径为100nm，温度为60℃，压力为0.1Mpa。这步主要是为了进行固液分离，去除发酵液中的菌体以及悬浮物。收集得到微滤透过液25L，随后用水对微滤浓缩液进行渗滤3次，每次加水5L，共收集得到微滤透过液40L。微滤透过液中赖氨酸的浓度为110g/L。然后利用截留分子量为2500道尔顿的超滤膜，对微滤透过液进行超滤，超滤压力2.5MPa，超滤温度30℃，得到超滤透过液37L，并用水对超滤浓缩液进行渗滤4次，每次加水4L，共收集得到超滤透过液53L，超滤透过液中赖氨酸的浓度为83.2g/L。这步主要是为了去除发酵液中的蛋白质、色素等大分子杂质。接着，利用截留分子量为100-250道尔顿的纳滤膜对赖氨酸碳酸盐进行浓缩，将赖氨酸的浓度提高至300g/L，得到纳滤浓缩液约14.4L。将纳滤浓缩液放出后，加热至50℃，并加入约100g活性炭，并搅拌1小时，趁热抽滤，得到脱色后的赖氨酸碳酸盐清液。随后，在60℃，-1.0Mpa条件下采用真空蒸发浓缩的方法，将纳滤浓缩液中赖氨酸的浓度提高至550g/L，此时溶液中会析出大量的赖氨酸碳酸盐晶体。对析出的赖氨酸碳酸盐晶体进行抽滤、烘干，即得到赖氨酸碳酸盐成品。晶体中赖氨酸碳酸盐的含量可达到98％以上。抽滤得到的结晶母液，继续进行喷干，回收其中的赖氨酸碳酸盐。喷干的进口气体温度为140℃，出口的温度为80℃。收集得到的粉末即为赖氨酸碳酸盐粗品，其中赖氨酸碳酸盐的含量约为90％，赖氨酸的总收率为96.0％。
实施例9分离发酵液中的赖氨酸纯品并回收加入的CaO
发酵结束后收集得到发酵液40L，其中赖氨酸的含量为180g/L，CO3 2-的含量为56g/L。首先用陶瓷膜进行微滤，膜孔径为100nm，温度为60℃，压力为0.1MPa，得到微滤透过液34L，待微滤快结束时，加入6L水进行渗滤，共加入3次，最后共收集得到透过液52L，其中pH＝7.5，赖氨酸浓度为136.4g/L。这步主要是为了进行固液分离，去除发酵液中的菌体及悬浮物。
微滤得到的赖氨酸透过清液52L，利用截留分子量为2500道尔顿的超滤膜进行超滤，超滤压力2MP，温度为30℃，得到超滤透过液47L，并用水对超滤浓缩液进行渗滤3次，每次加水5L，共收集得到超滤透过液62L，赖氨酸的浓度为112.8g/L。这一步主要是为了去除发酵液中的蛋白质、色素等大分子杂质。调节超滤透过液pH值至9.5，接着，利用截留分子量为100-250道尔顿的纳滤膜对赖氨酸进行浓缩，将赖氨酸的浓度提高至346.1g/L，得到纳滤浓缩液约19.8L。这一步的目的主要是为了去除溶液中的K+、Na+、Cl-等一价离子。接着，将纳滤浓缩液加热至55℃，在不断搅拌下，加入150g活性炭，1个小时后，趁热抽滤，得到脱色后的赖氨酸清液19.5L。
然后，向脱色后的赖氨酸清液中加入CaO粉末，不断搅拌24h，使CaO溶解到溶液中，同时溶液中会形成大量沉淀，待溶液的pH升高至11.0时，静置40小时，以使得溶液中的Ca2+与CO3 2-、SO4 2-、PO4 3-充分形成沉淀。然后采用离心的方法，收集得到沉淀和上清液，其中沉淀用水清洗3次，每次用水约1L，合并洗涤液和上清液，得到赖氨酸清液21.5L，其中浓度约为314g/L。收集得到的沉淀烘干后，高温灼烧(1100℃)得到氧化钙，这部分固体可用于下一批赖氨酸分离过程中。得到的赖氨酸清液在65℃、-1.0Mpa条件下采用真空蒸发浓缩的方法，将纳滤浓缩液中赖氨酸的浓度提高至520g/L，降温至20℃，然后加入1.5倍体积的无水乙醇，进行溶析结晶，得到高纯度的赖氨酸晶体，赖氨酸的含量约为98.1％，总收率约为93.8％。
Claims (14)
1.一种发酵制备氨基酸碳酸盐的方法，其特征在于，在碳源和氮源存在下，利用菌株发酵制备含有氨基酸碳酸盐的发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵过程中，待初始培养液的氮源即将耗尽，通过控制补加氮源的流加速率，维持发酵液中氮元素的浓度为0.1～10g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，初始培养液的氮源含量为18～40g/L，补加氮源为补加碳酸铵、碳酸氢氨和尿素中的任意一种或者几种的组合。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，发酵过程中，调控发酵液pH值，当菌体浓度<10g/L，调控pH值使得6≤pH值＜7.5，当菌体浓度≥10g/L，调控pH值使得7.5≤pH值≤8.5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用二氧化碳水溶液、或通入二氧化碳气体调控发酵液的pH值。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将含有氨基酸碳酸盐的发酵液经离心、板框压滤、微滤、超滤、纳滤、结晶、喷干工艺中的任意一种或者几种的组合，得到氨基酸粗品或者精品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤浓缩液进行喷干，得到含菌体、蛋白质的氨基酸碳酸盐粗品。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理，超滤浓缩液喷干得到不含菌体、含有蛋白质的氨基酸碳酸盐粗品。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理，超滤透过液再经纳滤处理，将纳滤浓缩液结晶或将纳滤浓缩液喷干，得到氨基酸碳酸盐的精品。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理，超滤透过液再经纳滤处理，将纳滤浓缩液加入盐酸或硫酸或醋酸，形成氨基酸盐酸盐或氨基酸硫酸盐或氨基酸醋酸盐溶液，再经结晶或喷干得到氨基酸盐酸盐或氨基酸硫酸盐或氨基酸醋酸盐的精品。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，含有氨基酸碳酸盐的发酵液经微滤处理后，微滤透过液再经超滤处理，超滤透过液再经纳滤处理，将纳滤浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙进行除盐操作，搅拌6～24h，静置40～80h后离心微滤去除沉淀，再将微滤透过液以蒸发和溶析结合的方法结晶，得到氨基酸精品。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的氧化钙或氢氧化钙为固体形式，或者其溶液的形式。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，氧化钙或氢氧化钙投入纳滤浓缩液中，以控制溶液的pH值至10.5～11。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸为赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨酸或组氨酸中的任意一种或几种的组合。
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