CN110475857A - 表达抗-可替宁嵌合抗原受体的天然杀伤细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达特异性结合可替宁的抗可替宁嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞，以及含有该细胞的细胞治疗剂。根据与可替宁偶联的结合物质，表达特异性结合可替宁的嵌合抗原受体的本发明天然杀伤细胞可以有效移动到肿瘤组织，而无论癌症的类型。因此，本发明的天然杀伤细胞可以有效地用作表现出高效抗癌作用的基因疗剂。

Description

表达抗-可替宁嵌合抗原受体的天然杀伤细胞

技术领域

本发明涉及表达特异性结合可替宁(cotinine)的抗-可替宁嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞，以及包含它的细胞治疗剂。

背景技术

几十年来，治疗癌症的方法一直稳步变化和发展。从19世纪到20世纪，主要进行诸如手术、化疗和放疗等方法，这些方法的局限性开始显现。最典型的是情况，现有的治疗方法仅在未发生转移的癌症早期才有效；而在已发生转移的情况下，即使在手术后也有很高的可能性复发。另外，据报道，化疗在实体瘤中的疗效低，并且引起副作用，即癌细胞以外的正常细胞的生长也受到抑制。最近，为了克服这些问题，人们正在积极研究抗癌症的免疫疗法。抗癌症免疫疗法是指提升免疫反应，以使患者自身可以对抗癌细胞。

最近，细胞治疗方法越来越得到关注，这些方法是免疫细胞疗法，其中体内的免疫细胞被取出、强化或遗传修饰，并再次引入。其典型实例包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)技术。其中，积极进行了采用遗传重组/修饰获得的人工受体CAR的研究。

嵌合抗原受体(CAR)是被设计为赋予T细胞抗原特异性的人工受体。这些受体包括抗原特异性组分、跨膜组分和胞内组分，其被选择用于活化T细胞并提供特异性免疫力。表达嵌合抗原受体的T细胞可用于包括癌症疗法在内的各种疗法。

诸如CAR-T等治疗剂对肿瘤有效。然而，在某些情况下，这些治疗因对健康组织的部分非特异性攻击而引起副作用。为了克服该问题，目前正对第三代CAR-T进行研究，这些研究的特点是加入作为共刺激信号的两个信号域和人工受体(另外的工程改造受体)来增加“癌细胞抗原识别能力”，从而最大程度降低攻击正常细胞的副作用。然而，CAR-T细胞治疗剂的开发受阻于以下问题：目前的CAR-T技术具有限制，即产生的CAR-T仅识别癌细胞中表达的一种蛋白质，因此开发个体治疗剂的所需成本太高；一旦注射CAR-T，即使在癌细胞移除后，毒性T细胞仍继续发挥作用并引起毒性；在有呈递靶蛋白的正常细胞存在下，CAR-T在其上诱导非特异性攻击而引起不可逆的致命副作用。

因此，迫切需要研究能够解决上述问题的新的改进细胞治疗剂。

发明内容

技术问题

作为解决常规治疗剂问题的研究结果，本发明人制备了表达嵌合抗原受体的天然杀伤细胞，该嵌合抗原受体使用特异性结合可替宁的抗原结合域。本发明人如此确定了天然杀伤细胞可能解决现有CAR-T治疗剂的问题，同时易于开发通用治疗剂，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种细胞治疗剂，其使用表达特异性结合可替宁的抗原结合域的天然杀伤细胞，以及使用该细胞治疗剂治疗癌症的方法。

针对技术问题的技术方案

为解决上述问题，本发明提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞，其中所述嵌合抗原受体包括1)抗原结合域、2)跨膜域和3)胞内信号传导域，抗原结合域是特异性结合可替宁的结构域。

此外，本发明提供一细胞治疗剂，其包含所述天然杀伤细胞。

此外，本发明提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述天然杀伤细胞作为活性成分。

此外，本发明提供预防或治疗癌症的方法，包括将所述天然杀伤细胞给予对象的步骤。

此外，本发明提供用于癌症诊断的药物组合物，其包含所述天然杀伤细胞作为活性成分。

此外，本发明提供了一癌症诊断试剂盒，其包含所述天然杀伤细胞。

本发明的有益效果

根据偶联于可替宁的结合物质，本发明的表达特异性结合可替宁的嵌合抗原受体的天然杀伤细胞可以有效移动到肿瘤组织，而无论癌症的类型。因此，本发明的天然杀伤细胞可以有效地用作表现出高效抗癌效果的基因治疗剂。

附图简述

图1显示用于本发明的pLVX-AcGFP-C1载体。

图2是可替宁特异性CAR-NK细胞和示例性可替宁偶联物的示意图。

图3显示了Cot-CAR-NK细胞的作用，其是可替宁特异性NK细胞。

图4显示了用于本发明的特定相关序列。

图5显示了抗可替宁嵌合抗原受体及其表达系统的示例性示意图。

图6显示了通过流式细胞术测量NK92细胞中CAR的表达所得的结果。

图7显示的结果证实本发明的可替宁-CAR NK92对AU565细胞的细胞杀伤作用。

图8显示了用流式细胞术证实的各种癌细胞的Her2表达水平的结果。

图9显示了通过钙黄绿素-AM方法证实本发明的可替宁-CAR NK92细胞的细胞杀伤作用取决于Her2-可替宁偶联物的存在与否的结果。

图10显示了通过ELISA确认可替宁-CAR NK92细胞中细胞因子的分泌水平的结果。

图11显示了通过流式细胞术证实细胞中CD107a的表达水平的结果。

图12显示了通过流式细胞术证实经由可替宁-CAR NK92的胞内域(endo domain)的Erk磷酸化的结果。

图13显示了通过钙黄绿素-AM方法证实可替宁-CAR NK92细胞的细胞杀伤作用的结果。

图14显示了通过流式细胞术证实AU565、SK-OV-3、A431和A459细胞中Her2和EGFR的表达水平的结果。

图15显示了通过钙黄绿素-AM方法证实可替宁-CAR NK92的细胞杀伤作用取决于偶联物的存在与否的结果。

图16显示了通过ELISA确认癌细胞中细胞因子分泌变化的结果，这取决于用可替宁-CAR NK92和偶联物处理。

图17显示了通过流式细胞术证实AU565细胞中CD107a的表达水平的结果。

图18显示了通过流式细胞术证实A431细胞中CD107a的表达水平的结果。

本发明的最佳实施方式

下文将对本发明作详细描述。

在本发明的一方面，提供了一天然杀伤细胞，其中表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述嵌合抗原受体包括1)抗原结合域、2)跨膜域和3)胞内信号传导域，所述抗原结合域是特异性结合可替宁的结构域。

根据偶联于可替宁的结合物质，本发明的表达特异性结合可替宁的嵌合抗原受体的天然杀伤细胞可以有效移动到肿瘤组织，而无论癌症的类型。因此，本发明的天然杀伤细胞可以有效地用作表现出高效抗癌效果的基因治疗方法。

由于本发明的表达嵌合抗原受体的天然杀伤细胞的特征在于特异性结合可替宁，因此它包括特异性结合可替宁的抗原结合域。

抗原结合域可以是特异性结合可替宁的抗体或抗体片段。表达嵌合抗原受体的NK细胞可以与和可替宁融合的偶联物一起给予患者以治疗癌症。

特别地，本发明的表达嵌合抗原受体的天然杀伤细胞(CAR-NK细胞)不仅能够通过反应开/关开关解决使用现有CAR-T治疗剂作癌症免疫治疗的问题(例如持久的毒性、自身免疫疾病的风险、异种细胞移植的移植物抗宿主病(GVHD)和非靶标毒性)，还有利的是它能够靶向各种癌细胞，因此可以用作通用目的的治疗剂。由于本发明的CAR-NK细胞能够进行同种异体移植，与使用患者自身免疫细胞的CAR-T相比，可以预先制备高效的细胞。因此，所述CAR-NK细胞不仅缩短了治疗剂的给药时间以提高其疗效，而且由于减少了开发和治疗成本，还可以有效地用于开发各种疾病的治疗剂。

本文所用的“抗体”是指在通过抗原刺激而在免疫系统中产生的物质，其类型没有特别限制。此外，在本说明书中，抗体包括但不限于保留抗原结合能力的抗体片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。

本文所用的“嵌合抗体”是指这样的抗体，其可变区或互补决定区(CDR)衍生自不同于该抗体其余部分的动物。此类抗体可以是，例如这样的抗体，其可变区源自除人以外的动物(如小鼠、家兔和家禽)，而其恒定区源自人。此类嵌合抗体可以通过本领域已知的方法，例如遗传重组产生。

本文所用的“重链”是指全长重链及其片段，其中所述全长重链包括具有足以赋予抗原特异性的可变区氨基酸序列的可变区结构域VH，和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。

本文所用的“轻链”是指全长轻链及其片段，其中所述全长轻链包括具有足以赋予抗原特异性的可变区氨基酸序列的可变区结构域VL，和恒定区结构域CL。

构成本发明的嵌合抗原受体的抗原结合域是指转导主信号的位点，该位点位于细胞膜外并识别具有特异性抗原的靶细胞的细胞膜配体(结合并激活受体的物质)。

本发明的跨膜域是跨细胞膜连接抗原结合域与共刺激结构域及必需信号传导域的位点。胞内信号传导域是通过结合抗原结合域来激活NK细胞的免疫反应的位点。

本发明的嵌合抗原受体的特征在于抗原结合域特异性结合可替宁，而可替宁是指尼古丁的主要代谢产物，其具有下式1所示结构。

[式1]

可替宁优选是与结合物质偶联的偶联物，所述结合物质的特征选自下组：肽、适体、激素、蛋白和化学物质。结合物质可以更优选但不限于适体。

在本发明中，与可替宁偶联的偶联物可以通过将至少一种多肽(通常是一种多肽)与作为异源分子的至少一种非多肽部分(例如聚合物分子、亲脂性化合物、碳水化合物部分或有机衍生剂，特别是聚合物部分)共价连接来产生。此外，偶联物可以与至少一个碳水化合物部分连接，特别是采用N-或O-糖基化。共价连接是指多肽和非多肽部分彼此直接共价连接，或通过中间部分或中间部等，例如连接桥部分、间隔基团、连接部分或连接部彼此间接地共价连接。例如，通过将本文公开的结合物质与可替宁偶联而获得的偶联物包括在该定义中。

在抗可替宁抗体与本发明的结合物质与可替宁的偶联物相结合的复合物中，可替宁用作半抗原，从而该复合物可以保留结合物质和抗体的固有特性。具体地，该复合物可以保留作为抗体特征的分子的特定反应性和功能，以及补体介导的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和长体内半衰期。

结合物质可以是，例如选自下组：肽、适体、激素、蛋白和化学物质，并且可以是，例如选自下组：WKYMVm-NH2肽(WKYMVm-NH2)、wkymvm-NH2肽(wkymvm-NH2)、AS1411适体、哌加他尼、阿昔单抗和胰岛素。在本发明的一些实施方式中，蛋白可以是抗体，尤其可以是抗Her2抗体或抗EGFR抗体。

因此，本发明提供了这样的方法，该方法通过将抗可替宁抗体与结合物质和可替宁偶联得到的偶联物结合来增加结合物质的体内半衰期。

此外，本发明提供了这样的方法，该方法通过将抗可替宁抗体与结合物质和可替宁偶联得到的偶联物结合来诱导针对与该结合物质结合的细胞的补体依赖性毒性。

本发明的抗原结合域是特异性结合可替宁的物质，可以是抗体或抗体片段，其中所述抗体片段可以是scFv。在与可替宁结合的抗体或抗体片段的序列中，可替宁-scFv可以由例如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列组成，并且可以包括但不限于对上述序列进行修饰或取代获得的序列，这些序列与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列具有优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性，并且其表现出与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列基本相同的生理活性。

此外，可替宁-scFv可以由SEQ ID NO:17所示核苷酸序列和与该核苷酸序列具有优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高序列同源性的核苷酸序列编码。

在能够特异性结合可替宁的抗可替宁嵌合抗原受体中，抗原结合域可以由重链可变区、接头序列和轻链可变区组成。所述重链可变区可以由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列组成：所述核苷酸序列与SEQ IDNO:1所示核苷酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且能编码SEQ ID NO:1所示核苷酸序列表达的氨基酸序列的功能等同物。

所述轻链可变区可以由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列组成：所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且能编码SEQ ID NO:2所示核苷酸序列表达的氨基酸序列的功能等同物。

与SEQ ID NO:1所示碱基序列或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列分别有95％或更高序列同源性的碱基序列编码的氨基酸序列可表现出与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码的氨基酸序列基本相同的生理活性。

本发明的抗体或抗体片段可以进一步包括接头，其重链可变区和轻链可变区可以通过接头彼此连接。可以使用接头而没有限制，只要它是能够连接重链可变区和轻链可变区以形成VH-接头-VL结构域的组分即可。优选地，接头可以由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列或与其具有95％或更高同源性的碱基序列编码的氨基酸序列组成。

本发明的抗可替宁嵌合抗原受体中的抗原结合域可以通过铰链区、间隔区或其组合与跨膜域连接。本发明的铰链区或间隔区可以是选自Myc表位、CD8铰链区和Fc中的至少一种，优选包括Myc表位和CD8铰链区。本发明的Myc表位和CD8铰链区起到连接域(间隔区)的作用。

本发明的CD8铰链区可以由SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且表现出与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列大致相同功能的氨基酸序列组成；Myc表位可以由SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且表现出与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列大致相同功能的氨基酸序列组成。因此，本发明的铰链区或间隔区优选由SEQ IDNO:12所示氨基酸序列或与其具有95％或更高序列同源性的氨基酸序列组成；或由SEQ IDNO:13所示氨基酸序列或与其具有95％或更高序列同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，编码Myc表位的碱基序列可以包括能够编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的所有核苷酸序列，优选SEQ ID NO:7所示核苷酸序列；编码人CD8铰链区的核苷酸序列可以包括能够编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的所有核苷酸序列，优选SEQ ID NO:4所示核苷酸序列。

跨膜域是本发明的嵌合抗原受体的组分，可以包括选自下组的蛋白的跨膜域：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。例如，跨膜域可以是CD28的跨膜域，其可以由(但不限于)SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或与其具有95％或更高同源性的氨基酸序列组成。

此外，对于作为本发明的嵌合抗原受体的组分的胞内信号传导域，可以使用本领域已知的胞内信号传导域而没有限制。在本发明的一个实施方式中，胞内信号传导域可包括但不限于DAP10、CD3ζ或其组合。

本发明的嵌合抗原受体可以使用DAP10和CD3ζ作为胞内信号传导域，从而使得NK细胞可以对癌细胞表现出高活性的杀伤作用。在这种情况下，DAP10起到共刺激结构域的作用，可以由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且表现出与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列基本相同功能的氨基酸序列组成；CD3ζ起到NK细胞激活域的作用，可以由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的序列同源性并且表现出与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列基本相同功能的氨基酸序列组成。因此，本发明的胞内信号传导域可以由SEQ IDNO:14所示氨基酸序列或与其具有95％或更高同源性的氨基酸序列组成；或由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列或与其具有95％或更高同源性的氨基酸序列组成。

此外，本发明的抗原结合域可包括用于结构域暴露的信号肽。所述信号肽可以是CD8α或小鼠轻链κ信号肽。在是CD8α的情况中，本发明的信号肽可以由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或与其具有95％或更高同源性的氨基酸序列组成。此外，编码CD8α区的碱基序列可以包括能够编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的所有碱基序列，优选SEQ ID NO:6所示核苷酸序列。

另外，在本发明中，含有能够编码上述抗可替宁嵌合抗原受体的多核苷酸的载体可用于以该嵌合抗原受体转化NK细胞。

对于本发明所用的载体，可以利用本领域已知的各种载体，其中可以根据预期产生抗原受体的宿主细胞类型适当选择表达调节序列，如启动子、终止子和增强子，膜靶向或分泌的序列等，并且可以根据目的以各种方式组合。本发明的载体包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。合适的载体包括用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列以及表达调控元件，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，并且可以根据目的以各种方式构建。

在本发明中，可以使用慢病毒载体(Clontech，632155)作为优选实例。特别是，图1中说明了作为本发明实施例中所用载体的pLVX-AcGFP-C1。

在一些实施方式中，天然杀伤细胞从骨髓、外周血、外周血单个核细胞或脐带血获得或产生。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。

表达本发明的抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞和可替宁偶联物的外观的示意图示于图2。

通过引入抗原受体而得以转化的上述NK细胞可以识别作为抗原的可替宁并特异性结合可替宁，并且可以在细胞表面上表达可替宁特异性嵌合抗原受体。具体地，该受体可以诱导与CAR-NK细胞相同的活性，例如，在与肿瘤抗原接触和结合后通过胞内信号传导域诱导NK细胞活化，并诱导NK细胞的肿瘤特异性杀伤。

本发明的Cot-CAR-NK细胞是可替宁特异性NK细胞，其作用如图3中的示意图所示。

特别是，在本发明中，CAR-NK细胞是指已经引入嵌合抗原受体的天然杀伤(NK)细胞。上述细胞具有癌症特异性靶向治疗的优点，这是CAR-T治疗剂已有的优点，同时具有以下优点：该细胞不仅因包含本发明的嵌合抗原受体而通过能够开启/关闭治疗反应的开关功能解决毒性问题这一已有的问题，还可以通过与特异性结合嵌合抗原受体的可替宁融合的偶联物的末端修饰而用作通用治疗剂。即，根据与可替宁偶联的结合物质，本发明的表达特异性结合可替宁的嵌合抗原受体的NK细胞可以有效地移动到肿瘤组织，而无论癌症的类型。因此，本发明的细胞可以有效地用作表现出高特异性的优异抗癌作用的基因治疗方法。

因此，本发明的另一方面提供了包含所述天然杀伤细胞的细胞治疗剂，包含所述天然杀伤细胞作为活性成分的预防或治疗癌症的药物组合物，或预防或治疗癌症的方法，包括将所述细胞给予个体的步骤。

在本发明中，细胞可用于细胞治疗，例如用于抗癌治疗。细胞可以源自供体，或者可以是从患者获得的细胞。例如，细胞可用于再生以代替患病细胞的功能。还可以修饰细胞以表达异源基因，从而可以将生物制剂递送至，例如特定的微环境，例如患病的骨髓或转移性沉积物。

此外，本发明的用于预防或治疗癌症的药物组合物可以进一步包含其中结合物质与可替宁融合的偶联物，用于预防或治疗癌症的方法可以进一步包括给予结合物质与可替宁融合的偶联物的步骤。根据与可替宁偶联的结合物质，天然杀伤细胞可特异性结合靶细胞，并表现出优异的抗癌作用。

具体地，本发明提供的细胞是表达嵌合抗原受体的天然杀伤细胞，所述嵌合抗原受体具有能够特异性结合可替宁的抗原结合域，其中所述嵌合抗原受体可以例如，利用与可替宁融合的偶联物或中间体调节常规CAR治疗剂对靶细胞的开启/关闭反应。因此，该天然杀伤细胞包括安全开关，其在需要增加或降低后续细胞治疗或治疗性细胞的活性的情况下非常有益。例如，在向患者提供表达嵌合抗原受体的NK细胞的情况下，在某些情况下，可能存在诸如脱靶毒性等副作用。或者，例如，治疗细胞可以起到减少肿瘤细胞数量或肿瘤大小的作用，并且可能不再需要。在这种情况下，可以调节可替宁，通过该调节作用可以调节治疗细胞不再被激活。

在本发明中，癌症可包括但不限于本领域已知的所有类型的癌症。

本文所用的术语“单位剂量”是指适合作为哺乳动物单位剂量的物理上离散的单位，各单位含有经计算得到所需免疫原刺激作用的预定量药物组合物，以及所需的稀释剂。接种物的单位剂量的细节受药物组合物的固有特征和有待实现的特定免疫学效果的影响，并由此确定。

特定应用的有效量可以根据诸如待治疗的疾病或病症、待给予的具体组合物、对象的体积和/或疾病或病症的严重程度等因素而有所不同。本文所述的特定组合物的有效量可以凭经验确定，而无需过多实验。

另外，在本发明还有另一方面，提供了癌症诊断组合物和癌症诊断试剂盒，各自包含表达本发明的嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞。在本发明的又一方面，提供了用于提供癌症诊断信息的方法，包括使含有表达本发明的嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞的组合物与从个体分离的样品接触的步骤。所述组合物或试剂盒可以进一步包括但不限于结合物质与可替宁融合的偶联物。

本文所用的术语“诊断”旨在包括测定对象对特定疾病或病症的易感性，测定个体当前是否患有特定疾病或病症，测定患有特定疾病或病症的个体的预后或治疗指标(例如，监测个体的状态以提供关于疗效的信息)。

在本发明的还有一个方面，提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞用于预防或治疗癌症的用途。

所述嵌合抗原受体，表达该嵌合抗原受体的天然杀伤细胞及其用于预防或治疗癌症的用途如上所述。

本发明的实施方式

下文将借助实施例更详细地描述本发明。然而，给予这些实施例是为了说明本发明，本发明的范围不限于此。

实施例1.载体骨架

对于本发明所用的载体，使用慢病毒载体(Clontech，632155)。具体地说，利用图1所示的pLVX-AcGFP-C1。从中删除Kozak序列(CTCGAG；核苷酸2801-2806)和AcGFP1(墨绿多管水母(Aequorea coerulescens)绿色荧光蛋白；核苷酸2807-3604)以便用于实验，然后利用XhoI作为限制酶。具体的相关序列示于图4。

实施例2.靶抗原和可替宁偶联物的制备

可替宁(反式-4-可替宁羧酸)是用作靶抗原的小分子物质，其化学结构如下式1所示。使用购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的可替宁。

[式1]

此外，通过以下方法制备可替宁与结合物质融合的偶联物。

具体地说，对于HER2-可替宁偶联物，使用作为抗HER2抗体的曲妥珠单抗(基因泰克公司-Genentech，美国)制备可替宁和抗HER2抗体偶联的偶联物。在此，偶联物通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)偶联方法偶联。首先，通过溶解在PBS中来制备抗HER2抗体，浓度为25μM。另一方面，通过溶解在1ml MES缓冲液[0.1M 2-[吗啉代]乙磺酸(MES)和0.5M氯化钠，pH 6.0]中来制备反式-4-可替宁羧酸(西格玛奥德里奇公司)，浓度为5mM。向得到的混合物中加入浓度为50mM的EDC和浓度为125mM的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，赛默科技公司-Thermo Scientific，美国)。然后，通过在室温下搅拌15分钟将所得物溶解，从而制备其中产生可替宁-NHS酯的活性溶液。为诱导可替宁-NHS酯与蛋白的胺基之间的反应，加入氢氧化钠溶液以便将活性溶液的pH调节至7或更高。从中取出1ml。向其中加入浓度为25μM的与可替宁偶联的抗HER2抗体，用量与活性溶液相同。将混合物在室温下搅拌反应3小时，以获得通过EDC偶联反应产生的可替宁-HER2抗体偶联物。利用Slide-A-lyzer^TM透析盒(赛默飞世尔公司-Thermo Fisher Scientific，美国)，将获得的可替宁-HER2抗体偶联物对PBS作透析，或者利用Amicon超离心过滤器(EMD密理博公司-EMDMillipore，美国)，将获得的可替宁-HER2抗体偶联物作PBS缓冲液替换并使用。

此外，使用购自安尼进公司(ANYGEN，可替宁-zEGFR:95)的EGFR-可替宁偶联物作为其中抗EGFR亲合体(affibody)与可替宁融合的偶联物。所用的抗EGFR亲合体的特定序列如下。

反式-4-可替宁羧酸-VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:30)

实施例3.抗-可替宁嵌合抗原受体

通过以下方法制备含有编码特异性结合可替宁的本发明嵌合抗原受体的各结构域的核酸的质粒。

(1)信号肽

基于人T细胞表面糖蛋白CD8α链(GenBank：AK300089.1)，使用分别含有XhoI和XbaI限制酶位点的两类引物(正向引物：SEQ ID NO:18，反向引物：SEQ ID NO:19)进行聚合酶链式反应，然后进行克隆。

(2)靶标特异性识别结构域-scFv

作为能够特异性结合可替宁的抗原结合域，希望获得抗可替宁嵌合抗体或其抗体片段。对于ScFv的序列，参考韩国专利号10-1648960中与ScFv相关的信息。具体地说，抗原结合域包括SEQ ID NO:17所示核苷酸序列，并构建为VH-接头-VL。

(3)连接结构域(间隔区)

(A)Myc表位

基于本发明人所拥有的质粒(抗可替宁28Z-1CAR ORF，cot28z-1)，使用分别含有sfiI和HindIII限制酶位点的两类引物(正向引物：SEQ ID NO:20，反向引物：SEQ ID NO:21)进行聚合酶链式反应，然后进行克隆。

(B)人CD8绞链区

基于本发明人所拥有的质粒(抗可替宁28Z-1CAR ORF，cot28z-1)，使用分别含有HindIII单一限制酶位点的两类引物(正向引物：SEQ ID NO:22，反向引物：SEQ ID NO:23)进行聚合酶链式反应，然后进行克隆。

(4)跨膜区

人CD28基因铰链中的胞质区用作跨膜区。通过将限制酶BamH1的序列加入正向引物(SEQ ID NO:24)并将限制酶EcoRI的序列加入反向引物(SEQ ID NO:25)来构建引物。

使用上述引物对Jurkat细胞的cDNA进行PCR，以获得跨膜区的DNA。

(5)一个或多个胞内信号传导域

(A)共刺激结构域

DAP10用作共刺激结构域，通过将限制酶EcoRI的序列加入正向引物(SEQ ID NO:26)并将限制酶NotI的序列加入反向引物(SEQ ID NO:27)来构建引物。

使用上述引物对原代成熟NK细胞的cDNA进行PCR，以构建共刺激结构域。

(B)NK细胞激活域

CD3ζ用作NK细胞激活域。具体地说，使用两类引物(正向引物：SEQ ID NO:28，反向引物：SEQ ID NO:29)对Jurkat细胞的cDNA进行PCR，以构建激活域。

使用各自的限制酶依次将上述各结构域相互连接，对应于各结构域的具体序列信息示于下表1中。

[表1]

当表1中的序列与上述结构匹配时，信号肽如对应于人CD8α区的SEQ ID NO:6所示；在靶标特异性识别结构域中，重链可变区如SEQ ID NO:1所示，接头如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区如SEQ ID NO:2所示。连接域(间隔区)如SEQ ID NO:7的Myc表位或SEQ IDNO:4的人CD8铰链区所示，作为跨膜区的CD28如SEQ ID NO:5所示。对于一个或多个胞内信号传导域，作为共刺激结构域的DAP-10如SEQ ID NO:8所示，作为NK细胞激活域的CD3ζ如SEQ ID NO:9所示。

实施例4：引入抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞的产生

将编码实施例3中所示的抗可替宁嵌合抗原受体的多核苷酸导入载体，将所得载体用于产生经转化的天然杀伤细胞。含有可替宁特异性抗原结合域的嵌合抗原受体的示意图及其表达系统示于图5。

首先，使用通过从实施例1的pLVX-AcGFP-C1中除去AcGFP而获得的载体作为基本载体，使用MCS中的限制酶XhoI和XbaI，将编码实施例3的抗可替宁嵌合抗原受体(可替宁-CAR)的多核苷酸插入载体。

随后，通过含有可替宁-CAR的载体连同病毒包装载体(PMDLg/RRE、RSV/REV、VSVG)转化HEK293T细胞，由此获得表达可替宁-CAR的慢病毒。使用超高速离心机浓缩慢病毒，使用表达可替宁-CAR的浓缩慢病毒感染HEK293T或Hela细胞。然后，用流式细胞术鉴定可替宁-CAR的Myc表位的量以计算感染单位。计算NK细胞数和慢病毒量，从而使得感染复数(MOI)为10，并通过旋转接种方法(360g，90min，室温)，利用表达可替宁-CAR的慢病毒感染NK细胞。将感染的NK细胞在37℃、5％CO₂的条件下培养5小时，然后用新鲜培养基替换培养基。3天后，用浓度为3μg/ml的嘌呤霉素进行处理以选择感染的NK细胞，并继续培养。

作为对照的未感染NK细胞也用嘌呤霉素处理，其中使用嘌呤霉素处理的培养基继续培养直至对照细胞被嘌呤霉素完全杀死。在对照细胞被完全杀死的时间点，对于感染的NK细胞，将培养基更换为不含嘌呤霉素的培养基用于增殖或扩增。为增殖或扩增所选细胞，使用含有12.5％胎牛血清、12.5％马血清、0.2mM肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、0.02mM叶酸和200U/ml重组IL-2的α-MEM培养基进行实验。

实施例5.鉴定引入抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞中CAR的表达

采用流式细胞术鉴定实施例4中产生的，引入本发明的抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞中CAR的表达。

将对应于可替宁-CAR的Myc表位的Myc抗体(CTS；9B11)与表达可替宁-CAR的NK细胞反应(4℃，避光30分钟)，并用流式细胞术鉴定Myc的表达；或将与Her2抗体融合的可替宁偶联物与表达可替宁-CAR的NK细胞在4℃反应30分钟，用对应于Her2抗体的Fc区的Fc抗体(eBioscience；12-4988-82)进行二次反应，然后用流式细胞术进行鉴定。使用不表达CAR的原始NK92细胞作为对照，结果示于图6。

如图6所示，证实导入抗可替宁嵌合抗原受体的本发明NK细胞表达抗可替宁抗体片段。

实施例6.确认可替宁-CAR NK细胞与可替宁的结合特异性

利用Cot-SWNT(可替宁聚合物)和HER2-肿瘤细胞确认可替宁-CAR NK细胞的可替宁ScFv是否特异性结合可替宁。

具体地说，用钙黄绿素-AM(生命技术公司-Life Technologies；C1430)染色AU565(人乳腺癌)。然后，将表达可替宁-CAR的NK细胞以1:1的比例在200μl RPMI1640(10％FBS)中混合，将该混合物用浓度为1μg/ml的与Her2抗体融合的可替宁偶联物和浓度为(0、0.005、0.05、0.5和5mg/ml)的cot-SWNT同时处理，从而使得在cot-SWNT和Her2-可替宁偶联物(Her2-cot)之间发生竞争。此外，为了确定单独的cot-SWNT的效果，增加单用cot-SWNT(5mg/ml)处理的条件，并在该条件下进行处理。反应在37℃和5％CO₂下进行4小时后，取出100μl上清液，鉴定上清液中钙黄绿素的存在量，藉此根据各条件鉴定细胞杀伤效果。作为对照，使用仅用RPMI1640(10％FBS)处理的用钙黄绿素染色的AU565的组(自发值)和用2％Triton X-100处理的用钙黄绿素染色的AU565的组(最大值)，通过以下方法计算细胞杀伤效果。

细胞杀伤效应(％)＝(取决于条件的钙黄绿素释放值-自发值)/(最大值-自发值)×100

由此获得的细胞杀伤效果的结果示于图7。

如图7所示，发现随着cot-SWNT浓度的增加，可替宁-CAR NK细胞对表达her2的癌细胞的杀伤作用降低。由此证实，根据偶联物的结合物质，本发明的可替宁-CAR NK细胞特异性地作用于靶细胞。

实施例7.通过赫赛汀(Her2)-可替宁偶联物证实可替宁-CAR NK细胞的细胞杀伤作用

利用实施例3中制备的抗Her2-可替宁偶联物和实施例4中制备的可替宁-CARNK92细胞，发现偶联物识别癌细胞表面上的Her2，从而引入本发明的抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞发挥细胞杀伤作用。

首先，利用抗Her2抗体(英杰公司；BMS120FI)以1μg/100μl的量处理四种细胞系中的每一种，AU565(人乳腺癌；RPMI1640(10％FBS；200nm HEPES))、SK-OV-3(人卵巢癌；RPMI1640(10％FBS))、SK-BR-3(人乳腺癌；DMEM(10％FBS))和K562(慢性髓性白血病；RPMI1640(10％FBS))，反应在4℃下避光进行30分钟。反应后，用流式细胞术(BD；FacsCantoII)检查每种细胞系中的Her2表达水平。结果如图8所示。

如图8所示，发现Her2在AU565、SK-OV-3和SK-BR-3细胞中表达，但Her2在K562细胞中不表达。

随后，通过钙黄绿素-AM方法检查可替宁-CAR NK细胞根据Her2-可替宁偶联物存在与否的细胞杀伤作用。具体地说，用5ug/ml浓度的钙黄绿素-AM处理四种细胞系AU565、SK-OV-3、SK-BR-3和K562中的每一种，然后在37℃和5％CO₂的条件下避光反应1小时。反应后，将原始NK92、插入表达AcGFP缺失的pLVX空载体的对照载体的NK92(Puro-92)和可替宁-CAT NK92(cot-10z-92)分别与上述细胞系以5:1、1:1和0.5:1的比例(效应细胞；NK92、Puro-92、Cot-10z-92:靶细胞；AU565、SK-OV-3、SK-BR-3、K562)在200μl RPMI(10％FBS)中混合，反应在37℃和5％CO₂的条件下进行4小时。然后，取100μl上清液并检查上清液中钙黄绿素的存在量，藉此根据各条件鉴定杀灭效果。结果如图9所示。

如图9所示，发现可替宁-CAR NK92细胞对表达Her2的AU565、SK-OV-3和SK-BR-3细胞表现出细胞杀伤活性，而对不表达Her2的K562细胞不表现出活性。此外，鉴定到Her2-可替宁偶联物不影响NK92和Puro-92的细胞杀伤作用，但对可替宁-CAR NK92有作用。从这些结果可以确认，本发明的可替宁-CAR NK细胞通过可替宁偶联物特异性地诱导细胞杀伤。

实施例8.可替宁-CAR NK细胞的细胞活性的验证

通过检查NK细胞中细胞因子和颗粒的分泌来验证NK细胞的活性。具体地说，如下验证细胞因子的分泌。将原始NK92、PURO-92和cot-10z-92各自与AU565以1:1在RPMI1640(10％FBS)中混合。向其中加入可替宁偶联物，在37℃和5％CO₂的条件下反应6小时。然后收集上清液，通过ELISA验证上清液中存在的细胞因子IFN-γ和TNF-α。单独的原始NK92、PURO-NK92和cot-10z-92各自分泌的细胞因子量作为对照，结果示于图10。

此外，如下验证CD107a的表达。将原始NK92、PURO-92和cot-10z-92各自与AU565以1:1在RPMI1640(10％FBS)中混合。用可替宁偶联物和CA107a抗体(BD；555801)组合处理该混合物，然后在37℃和5％CO₂的条件下反应4小时。使用CD56抗体进行染色，从而可以在反应后从细胞中选择NK92细胞。然后，采用流式细胞术比较原始NK92、PURO-NK92和cot-10z-92中的CD107a表达水平。原始NK92、PURO-92和Cot-10z-92中的CD107a基础表达水平，以及在没有可替宁偶联物的存在下与AU565混合状态中的CD107a表达水平用作对照，结果如图11所示。

如图10和11所示，发现仅在有可替宁-CAR NK细胞和Her2-可替宁偶联物存在下，NK细胞中响应于癌细胞而发生细胞因子和颗粒的分泌。

实施例9.Her2-可替宁偶联物引起的可替宁-CAR NK细胞信号的变化

通过测量在NK细胞表现出活性时改变的信号来检查可替宁-CAR NK细胞的活性。具体地说，使用通过可替宁-CAR NK92的内部结构域的信号，用流式细胞术检查Erk的磷酸化，结果示于图12。

如图12所示，发现在可替宁-CAR NK92细胞单独存在(没有her2-cot；对照)的情况下，胞内Erk的磷酸化没有增加，并且在有癌细胞存在的情况下(具有her2-cot；her2-cot处理组)，可替宁-CAR NK92细胞中Erk的磷酸化因her2-可替宁偶联物(her2-cot)而增加。

实施例10.验证赫赛汀(Her2)-可替宁偶联物对可替宁-CAR NK细胞的特异性

为验证可替宁-CAR NK细胞对Her2-可替宁偶联物的特异性，检查了取决于偶联物的细胞杀伤作用。

首先，使用呼吸道合胞病毒(RSV)-可替宁偶联物作为Her2-可替宁偶联物的对照。采用与实施例2中相同的方式制备RSV-可替宁偶联物，除了在制备实施例2的可替宁偶联物的方法中利用抗RSV抗体(帕利珠单抗，阿斯利康，英国)作为与可替宁融合的抗体。

随后，将可替宁-CAR-NK92细胞和钙黄绿素染色的AU565分别以5:1、1:1和0.5:1的比例在RPMI1640(10％FBS)中混合，利用针对Her2(在AU565细胞上表达的抗原)的Her2-可替宁偶联物和非表达的呼吸道合胞病毒抗体(RSV；帕利珠单抗，阿斯利康，英国)-可替宁偶联物进行处理，各自浓度为1μg/ml。反应在37℃和5％CO₂的条件下进行4小时。然后，通过钙黄绿素-AM方法检测可替宁-CAR NK92细胞的细胞杀伤效果，结果示于图13。

如图13所示，发现可替宁-CAR NK细胞对Her2-可替宁偶联物特异性地表现出活性。

实施例11.验证赫赛汀(Her2)-可替宁偶联物和EGFR(亲合体)-可替宁偶联物引起的可替宁-CAR NK细胞杀伤作用

利用实施例3中制备的抗Her2-可替宁偶联物和抗EGFR-可替宁偶联物以及实施例4中制备的可替宁-CAR NK92细胞，证实了引入本发明的抗可替宁嵌合抗原受体的NK细胞通过可替宁偶联物识别癌细胞表面的Her2或EGFR而发挥细胞杀伤作用。

首先，四种细胞系，AU565(人乳腺癌)、SK-OV-3(人卵巢癌)、A431(人皮肤癌；DMEM(10％FBS))和A549(人肺癌；RPMI1640(10％FBS))各自用抗Her2抗体和抗EGFR抗体(BD；563577)处理，每种抗体的用量为1μg/100μl，反应在4℃下避光进行30分钟。然后，对于每种细胞系，用流式细胞术检查其中Her2和EGFR的表达水平，结果示于图14中。

如图14所示，发现四种细胞系中Her2和EGFR的表达水平取决于每种细胞系而有所不同。

随后，根据Her2-可替宁偶联物或EGFR-可替宁偶联物存在与否，通过钙黄绿素-AM方法检查可替宁-CAR NK92对所述四种细胞系各自的细胞杀伤作用。具体地说，AU565、SK-OV-3、A431和A549细胞各自用钙黄绿素染色，然后以5:1、1:1和0.5:1的比例与cot-10z-92细胞(cot-10z-92：癌细胞)在200ul RPMI1640(10％FBS)中混合。根据各情况，只允许cot-10z-92和癌细胞反应，或使cot-10z-92和癌细胞在有Her2-可替宁偶联物(1μg/ml)或EGFR-可替宁偶联物(100ng/ml)处理下一起反应。反应在37℃和5％CO₂的条件下进行4小时。检查根据每种条件的细胞杀伤效果，结果示于图15中。

如图15所示，可替宁-CAR NK92细胞依据靶抗原Her2或EGFR的表达水平表现出细胞杀伤作用，这证实了本发明的可替宁-CAR NK细胞的细胞杀伤作用取决于可替宁偶联物的类型。

实施例12.验证EGFR-cot偶联物引起的可替宁-CAR NK细胞的细胞活性

通过细胞因子和颗粒的分泌来检查由her2-可替宁偶联物或EGFR-可替宁偶联物引起的针对表达Her2或EGFR的癌细胞的活性变化。

具体地说，将AU565或A431细胞和cot-10z-92以1:1的比例在RPMI1640(10％FBS)中混合。用her2-cot偶联物或EGFR-cot偶联物进行处理，然后在37℃和5％CO₂的条件下反应6小时。随后采用ELISA检查上清液中细胞因子(IFN-r和TNF-a)分泌的变化，结果示于图16中。

此外，通过CD107a的表达水平检查颗粒的分泌。具体地说，将原始NK92、PURO-92和cot-10z-92各自与AU565或A431细胞作1:1混合。用her2-cot偶联物或EGFR-cot偶联物处理混合物，并用CD107a抗体处理。在37℃和5％CO₂的条件下反应4小时。使用CD56抗体进行染色，以便在反应后选择NK92细胞。然后，采用流式细胞术进行检查。AU565和A431细胞的结果示于图17和18中。

如图16至18所示，发现可替宁-CAR NK细胞的活性由于针对抗原的抗体-可替宁偶联物而提高。

前文已经详细描述了本发明的具体部分。本领域技术人员显然知道，该具体描述仅示出了优选的实施方式，本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同表述方式限定。

序列表

<110> 韩国生命工学研究院

首尔大学校产学协力团

<120> 表达抗-可替宁嵌合抗原受体的天然杀伤细胞

<130> PCB903028KBB

<150> KR 10-2017-0001951

<151> 2017-01-05

<150> KR 10-2017-0001976

<151> 2017-01-05

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc agtccagtca gagtccttat agtaacgagt ggttatcctg gtatcagcag 120

aaaccagggc aggctcccaa agtcctaatt tctaggatat ccactctggc atctggggtc 180

tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat aagcgacctg 240

gagtgtggcg acgctgccac ttatttctgt gcaggcggtt ataattttgg tttgtttcct 300

ttcggcggag ggaccgagct ggagatccta 330

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agatcttccc agtcggtgaa ggagtccgag ggtcgcctgg tcacgcctgg aggatccctg 60

acactcacct gcacagtctc tggaatcgac ctcagtaggg actggatgaa ctgggtccgc 120

caggctccag gggaggggct ggaatggatc ggagccattg gtagaagtgg agacacatac 180

tacgcgacct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgag gacggtgact 240

ctaacagtca ccgatctgca gcgctcagac acggccacct atttctgtgc cagaattcct 300

tattttggtt ggaataatgg tgacatctgg ggcccaggca ccctggtcac catctcttca 360

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggggtggtt cctct 45

<210> 4

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtcaccg tctcttcagc gctgagcaac tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg 60

gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 120

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcat gccggccagc ggcggggggc 180

gcagtgcaca cgagggggct gga 203

<210> 5

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg 60

gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 120

attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 180

actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 240

ttcgcagcct at 252

<210> 6

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tactgctcca cgccgccagg 60

ccggc 65

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60

ccaggcaggg gc 72

<210> 9

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn

20 25 30

Glu Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val

35 40 45

Leu Ile Ser Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Cys Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Phe

85 90 95

Gly Leu Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu Ser Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser

115 120 125

Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asp Trp

145 150 155 160

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Arg Thr Val Thr Leu Thr Val

195 200 205

Thr Asp Leu Gln Arg Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ile

210 215 220

Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Ile Ser Ser

245

<210> 12

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser

1 5 10 15

His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala

20 25 30

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

35 40 45

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

50 55 60

Arg Gly Leu

65

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val

1 5 10 15

Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly

20

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

1 5 10 15

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

20 25 30

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

35 40 45

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

50 55 60

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

65 70 75 80

Phe Ala Ala Tyr

<210> 17

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc agtccagtca gagtccttat agtaacgagt ggttatcctg gtatcagcag 120

aaaccagggc aggctcccaa agtcctaatt tctaggatat ccactctggc atctggggtc 180

tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat aagcgacctg 240

gagtgtggcg acgctgccac ttatttctgt gcaggcggtt ataattttgg tttgtttcct 300

ttcggcggag ggaccgagct ggagatccta tcctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 360

gggggtggtt cctctagatc ttcccagtcg gtgaaggagt ccgagggtcg cctggtcacg 420

cctggaggat ccctgacact cacctgcaca gtctctggaa tcgacctcag tagggactgg 480

atgaactggg tccgccaggc tccaggggag gggctggaat ggatcggagc cattggtaga 540

agtggagaca catactacgc gacctgggcg aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg 600

tcgaggacgg tgactctaac agtcaccgat ctgcagcgct cagacacggc cacctatttc 660

tgtgccagaa ttccttattt tggttggaat aatggtgaca tctggggccc aggcaccctg 720

gtcaccatct cttca 735

<210> 18

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcgaggcca ggatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccg 75

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agatctttag cgagggggca gggcctcccc ctcgtgtgc 39

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggcccgggag gccgcgaaca aaaactcatc tcag 34

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagcttcaga tcctcttc 18

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagcttgggg tcaccgtctc ttcagc 26

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aagcttatcc agccccctcg tgtgc 25

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgcggatccg tgaaagggaa acacctttgt c 31

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccggaattca taggctgcga agtcgcg 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccggaattcc tgtgcgcacg cccacgc 27

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ataagaatgc ggccgcgccc ctgcctggca tgttgat 37

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ataagaatgc ggccgctaga gtgaagttca gcaggagcg 39

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgctctagag cattagcgag ggggcagggc 30

<210> 30

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile

1 5 10 15

Arg Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

Claims (21)

1.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的天然杀伤细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括1)抗原结合域、2)跨膜域和3)胞内信号传导域，和

所述抗原结合域是特异性结合可替宁的结构域。

2.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗原结合域是特异性结合可替宁的抗体或抗体片段。

3.如权利要求2所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗体片段是scFv。

4.如权利要求2所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗体或抗体片段包括重链可变区，所述重链可变区由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列组成。

5.如权利要求2所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗体或抗体片段包括轻链可变区，所述轻链可变区由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码的氨基酸序列组成。

6.如权利要求2所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗体或抗体片段还包括接头。

7.如权利要求6所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述接头由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列组成。

8.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗原结合域通过铰链区、间隔区或其组合与所述跨膜域连接。

9.如权利要求8所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述铰链区、间隔区或其组合是选自以下的至少一种：Myc表位、CD8铰链区和Fc。

10.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述跨膜域包括选自以下的至少一种蛋白的跨膜域：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

11.如权利要求10所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述跨膜域包括CD28的跨膜域。

12.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述胞内信号传导域包括DAP10、CD3ζ或其组合。

13.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述抗原结合域包括信号肽。

14.如权利要求13所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述信号肽是CD8α或小鼠轻链κ信号肽。

15.如权利要求1所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述可替宁是与结合物质偶联的复合物形式。

16.如权利要求15所述的天然杀伤细胞，其特征在于，所述结合物质选自下组：肽、适体、激素、蛋白和化学物质。

17.一种细胞治疗剂，其特征在于，包含权利要求1所述的天然杀伤细胞。

18.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的天然杀伤细胞作为活性成分。

19.一种预防或治疗癌症的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的天然杀伤细胞给予对象的步骤。

20.一种诊断癌症的方法，其特征在于，包括使权利要求1所述的天然杀伤细胞与分离自对象的样品接触。

21.权利要求1所述的天然杀伤细胞在预防或治疗癌症中的用途。