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CN110452662B - 一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法 - Google Patents

一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法 Download PDF

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CN110452662B CN201910778155.0A CN201910778155A CN110452662B CN 110452662 B CN110452662 B CN 110452662B CN 201910778155 A CN201910778155 A CN 201910778155A CN 110452662 B CN110452662 B CN 110452662B
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Abstract

本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠。本发明通过重组蛋白技术合成了含有大量正电荷的类弹性蛋白分子ELP，然后在多肽骨架侧链通过静电作用力与阴离子型表面活性剂组合，从而制备了高粘合强度的生物医用粘合剂。所得产品在不同条件下(干样、湿样以及动物表皮)均能表现出优异的黏合性能，可用于止血和伤口修复；同时具有良好的生物相容性以及可降解性、制备工艺简单、无需特殊设备、成本低、绿色环保，可开发为新一代生物医用胶水。

Description

一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种基于生物工程蛋白的高强度生物粘合剂及其制备方法。
背景技术
粘合剂是一种用于在规定条件下，使两个或更多表面粘合在一起的材料。它在高技术和生物医学领域发挥着重要作用。同样，在自然界中，跨越多个长度尺度的粘连是生存的必要条件。受自然界的启发，研究人员通过对生物有机体的各种粘合机制的研究，合成出各种仿生类粘合剂。但是这些粘合剂通常合成周期长，价格昂贵，而且部分粘合剂还需要通过紫外照射来实现胶黏，这大大限制了现有的粘合剂在医药和工业等领域上的应用。在世界范围内每年都会有大量的外科手术，在最近的一项研究中，2012年进行了超过3亿次手术；在过去的8年里增长了33.6％。目前的外科手术止血关闭技术包括使用诸如缝线、钉子或夹子等侵入性技术，这些技术通常会导致继发性组织损伤、微生物感染、产生瘢痕以及不良的美观效果。尽管这些技术是目前的护理标准，但在复杂而敏感的外科手术中，如血管吻合、神经修复或眼部手术等复杂的手术，使用缝合线是很困难的。在骨科手术中，使用金属移植如钢板、针或螺钉是一种常见的做法，用于骨整合。然而，硬骨材料与骨组织之间的模量不匹配会导致固定和骨萎缩的局部应力。金属移植是一种不与骨骼进行化学反应的辅助媒介，通常会受到无菌性放松的影响，导致骨愈合不良。尽管存在这些缺点，但由于缺乏能够超越它们的非侵入性技术，缝合仍然是组织重建的黄金标准。另一方面，我们的日常生活经验表明，常规粘合剂在干燥的环境中表现出的较强的粘合作用，但在水的存在条件下很容易被破坏。因此，在粘合剂的科学技术中，挑战之一是在潮湿的环境中开发具有高黏性特性的粘合材料。因而，如何简易高效、绿色制备高强度生物粘合剂是现有粘合剂制备中的难点。基于以上研究现状，基于生物工程蛋白的高强度生物黏合剂的绿色制备对基础科研及应用有着重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法，本发明中的生物粘合剂在不同条件下均能表现出优异的粘合性能，同时具有良好的生物相容性和可降解性。
本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠。
优选的，所述带正电荷的类弹性蛋白按照以下步骤进行表达：
将带正电荷的类弹性蛋白ELP载体质粒转化进毕赤酵母(GS115/X-33/KM71)或大肠杆菌表达菌株(BL21/BL21DE3/BLRDE3)，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，得到带正电荷的类弹性蛋白ELP。
优选的，所述带正电荷的类弹性蛋白与烷基类阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(0.5～2)。
优选的，所述生物粘合剂的含水量为5～15％。
本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂分贝溶于超纯水中，得到类弹性蛋白溶液和表面活性剂溶液；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠；
B)将所述表面活性剂溶液滴加至类弹性蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干，得到生物粘合剂。
优选的，所述类弹性蛋白溶液的浓度为0.1～0.5mg/μL。
优选的，所述表面活性剂溶液的浓度为0.05～0.3mg/μL。
优选的，所述离心的速率为15000～18000rpm；
所述离心的时间为5～20min。
优选的，所述冻干的时间为5～20min。
本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠。本发明通过重组蛋白技术合成了含有大量正电荷的类弹性蛋白分子ELP，然后在多肽骨架侧链通过静电作用力与阴离子型表面活性剂组合，从而制备了高粘合强度的生物医用粘合剂。所得产品在不同条件下(干样、湿样以及动物表皮)均能表现出优异的黏合性能，可用于止血和伤口修复；同时具有良好的生物相容性以及可降解性、制备工艺简单、无需特殊设备、成本低、绿色环保，可开发为新一代生物医用胶水。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的ELP蛋白粘合剂的外观照片；
图2为本发明实施例1制备的ELP蛋白粘合剂的粘合强度；
图3为本发明实施例2制备的ELP蛋白粘合剂用于皮肤粘合与肝脏止血的效果图；
图4为本发明实施例2制备的ELP蛋白粘合剂粘附性数据。
具体实施方式
本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠。
在本发明中，所述带正电荷的类弹性蛋白(ELP)优选按照以下方法进行表达：
将带正电荷的类弹性蛋白ELP载体质粒转化进毕赤酵母(GS115/X-33/KM71)或大肠杆菌表达菌株(BL21/BL21DE3/BLRDE3)，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到带正电荷的类弹性蛋白ELP。
在本发明中，所述带正电荷的类弹性蛋白的电荷数优选为36～108，更优选为72。
在本发明中，所述带正电荷的类弹性蛋白与烷基类阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(0.5～2)，更优选为1：(0.8～1)。
在本发明中，所述生物粘合剂中的含水量优选为5～15％，更优选为8～10％。
本发明提供了一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂分别溶于超纯水中，得到类弹性蛋白溶液和表面活性剂溶液；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠；
B)将所述表面活性剂溶液滴加至类弹性蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干，得到生物粘合剂。
在本发明中，所述带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂的种类、来源和用量与上文所述的带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂的种类、来源和用量一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述类弹性蛋白溶液的浓度优选为0.1～0.5mg/μL，更优选为0.15～0.4mg/μL，最优选为0.17～0.22mg/μL；所述表面活性剂的浓度优选为0.05～0.3mg/μL，更优选为0.1～0.2mg/μL，最优选为0.12～0.15mg/μL。
得到粘合剂溶液后，本发明将所述粘合剂溶液进行高速离心，然后直接冻干，得到高强度的稀土蛋白粘合剂。
在本发明中，所述离心的速率优选为15000～18000rpm，更优选为16000～17000rpm，最优选为16800rpm；所述离心的时间优选为5～20min，更优选为10～15min。
所述冻干的时间优选为5～20min，更优选为10～15min。
本发明提供一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠。本发明通过重组蛋白技术合成了含有大量正电荷的类弹性蛋白分子ELP，然后在多肽骨架侧链通过静电作用力与阴离子型表面活性剂组合，从而制备了高粘合强度的生物医用粘合剂。所得产品在不同条件下(干样、湿样以及动物表皮)均能表现出优异的黏合性能，可用于止血和伤口修复；同时具有良好的生物相容性以及可降解性、制备工艺简单、无需特殊设备、成本低、绿色环保，可开发为新一代生物医用胶水。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将带正电荷的类弹性蛋白ELP载体质粒转化进大肠杆菌表达菌株BL21DE3，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达。诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，最终得到带正电荷的类弹性蛋白ELP。
取11mg的ELP蛋白，7.5mg的十二烷基苯磺酸钠，分别加入50μL超纯水中。将表面活性剂水溶液滴加到ELP蛋白水溶液中，震荡离心5mins，留下层沉淀冻干10min，即可得到ELP粘合剂。
粘附力测试分别在钢片、铝片、玻璃片、PVC底片以及PE底片上进行的。图1为本发明实施例1制备的ELP粘合剂外观照片。图2本发明实施例1制备的ELP粘合剂剪切粘合强度及对照组强度比较。
本实施例中的生物粘合剂的剪切粘合强度在水下可以达到0.5MPa，在猪皮表面的断裂力值是22N/m。
实施例2
取8.7mg实施例1制得的ELP蛋白，6mg的十二烷基苯磺酸钠，分别加入50μL超纯水中。将表面活性剂水溶液滴加到ELP蛋白水溶液中，震荡离心10min，留下层沉淀冻干20min，即可得到ELP黏合剂。
图3为本发明实施例2制备的ELP粘合剂用于皮肤粘合和肝脏止血实验。
图4为本发明实施例2制备的ELP粘合剂粘附性曲线，由图4可以看出，潮湿环境下，K72-SDBS蛋白粘合剂在钢片上表现出良好的粘附性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，由带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂组成；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠；
所述带正电荷的类弹性蛋白按照以下步骤进行表达：
将带正电荷的类弹性蛋白ELP载体质粒转化进毕赤酵母或大肠杆菌表达菌株，挑取单克隆菌落，用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30度进行过量表达；诱导12小时收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶，用高压破碎机破碎菌体，10000rpm转速以上离心，收集上清液，HPLC纯化，得到带正电荷的类弹性蛋白ELP；
所述带正电荷的类弹性蛋白与烷基类阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(0.5～2)。
2.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，所述生物粘合剂的含水量为5～15％。
3.一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
A)将带正电荷的类弹性蛋白和烷基类阴离子表面活性剂分别溶于超纯水中，得到类弹性蛋白溶液和表面活性剂溶液；
所述烷基类阴离子表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠和/或十二烷基磺酸钠；
B)将所述表面活性剂溶液滴加至类弹性蛋白溶液中，混合均匀，得到粘合剂溶液；
C)将所述粘合剂溶液离心后冻干，得到生物粘合剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述类弹性蛋白溶液的浓度为0.1～0.5mg/μL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂溶液的浓度为0.05～0.3mg/μL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述离心的速率为15000～18000rpm；
所述离心的时间为5～20min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的时间为5～20min。
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