CN110423728A - 一种间充干细胞的制备方法 - Google Patents
一种间充干细胞的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110423728A CN110423728A CN201910794945.8A CN201910794945A CN110423728A CN 110423728 A CN110423728 A CN 110423728A CN 201910794945 A CN201910794945 A CN 201910794945A CN 110423728 A CN110423728 A CN 110423728A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- stem cells
- culture
- added
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 2
- FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N [C].O Chemical compound [C].O FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims 1
- 125000001805 pentosyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 29
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 10
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000015322 bone marrow disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种间充干细胞的制备方法，具体制作方法包括以下，S1,首先对提取的生物组织进行充分的清洗，以备用；S2,将生物组织送入离心旋转机中进行高速旋转分离，并加入生物酶进行溶解；S3，对细胞进行诱导分化；S4,采用基因克隆方法进行复制干细胞；S5,制作培养基，将分化后的干细胞进行培养，并冷藏保存。本发明通过采用诱导分化技术及克隆技术基础上，进行制作间充干细胞，获得的干细胞具有高纯度、高活率、无污染，并且整体原材料较为广泛，且整体制作方法较为效率，并且可以通过制作的培养基进行长期保存，值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及间充干细胞技术领域，尤其是一种间充干细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前,我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。
然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望,对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞，针对以上，在此我们提出一种间充干细胞的制备方法。
发明内容
本发明针对现有的间充干细胞制作方面等技术上的不足，提供了一种间充干细胞的制备方法。
本发明为解决上述现象，采用以下改性的技术方案，一种间充干细胞的制备方法，具体制作方法包括以下，
S1,首先对提取的生物组织进行充分的清洗，以备用；
S2,将生物组织送入离心旋转机中进行高速旋转分离，并加入生物酶进行溶解；
S3，对细胞进行诱导分化；
S4,采用基因克隆方法进行复制干细胞；
S5,制作培养基，将分化后的干细胞进行培养，并冷藏保存。
所述生物组织包括骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织及牙髓。
步骤S2中，具体包括以下步骤，剪碎成0.5-1.5mm的组织块,加入IV型胶原酶(1.0g/L),置37C恒温振荡培养箱振荡消化3h后,用80目滤网过滤,将滤过的细胞悬液离心洗涤，然后用无血清培养液混匀细胞,以1.0x105/cm2接种于T-75cm2培养瓶中,置37C、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养,每隔3-4h换液，融合至80％-90％传代培养,加入2.5g/L胰酶消化,按1:2或1:3传代至T-75cm2培养瓶中。
步骤S3中，先将冻存细胞取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化，移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液，加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液；加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5％CO2的细胞培养箱中培养；
细胞密度达到80％-90％时.去培养基，10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液，再加入10ml PBS，经高压灭菌，保存于40C，吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×105/盘接种，继续培养。
细胞密度达到80％～90％时，使用10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加入1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpm×2min，弃上清液。
所述克隆方法包括以下步骤，L1，进行目的基因的克隆，根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以DNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段；
L2、在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载 体中，构建重组质粒；
L3、将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序，然后重复循环操作，直到克隆完成。
作为本发明的进一步优选方式，所述培养基包括以下重量百分数的组分：核糖核 酸8％、脱氧核糖核酸1％、寡核苷酸1.5％、多聚核苷酸3.2％、五碳糖2.3％、融合蛋白1.5％、维生素4.3％、抗病毒多肽1.5％、细胞因子模拟肽3.7％、小分子活性多肽2.8％、乳酸1.8％、乙醇酸0.4％、氯化锌0.3％、氯化钠0.2％和余量碳水化合物。
与现有技术相比：本发明通过采用诱导分化技术及克隆技术基础上，进行制作间充干细胞，获得的干细胞具有高纯度、高活率、无污染，并且整体原材料较为广泛，且整体制作方法较为效率，并且可以通过制作的培养基进行长期保存，值得推广。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种间充干细胞的制备方法，具体制作方法包括以下，
S1,首先对提取的生物组织进行充分的清洗，以备用；
S2,将生物组织送入离心旋转机中进行高速旋转分离，并加入生物酶进行溶解；
S3，对细胞进行诱导分化；
S4,采用基因克隆方法进行复制干细胞；
S5,制作培养基，将分化后的干细胞进行培养，并冷藏保存。
所述生物组织包括骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织及牙髓。
步骤S2中，具体包括以下步骤，剪碎成0.5-1.5mm的组织块,加入IV型胶原酶(1.0g/L),置37C恒温振荡培养箱振荡消化3h后,用80目滤网过滤,将滤过的细胞悬液离心洗涤，然后用无血清培养液混匀细胞,以1.0x105/cm2接种于T-75cm2培养瓶中,置37C、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养,每隔3-4h换液，融合至80％-90％传代培养,加入2.5g/L胰酶消化,按1:2或1:3传代至T-75cm2培养瓶中。
步骤S3中，先将冻存细胞取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化，移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液；加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5％CO2的细胞培养箱中培养；
细胞密度达到80％-90％时.去培养基，10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液，再加入10ml PBS，经高压灭菌，保存于40C，吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×105/盘接种，继续培养。
细胞密度达到80％～90％时，使用10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加入1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpm×2min，弃上清液。
所述克隆方法包括以下步骤，L1，进行目的基因的克隆，根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以DNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段；
L2、在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载 体中，构建重组质粒；
L3、将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序，然后重复循环操作，直到克隆完成。
所述培养基包括以下重量百分数的组分：核糖核酸8％、脱氧核糖核酸1％、寡核苷 酸1.5％、多聚核苷酸3.2％、五碳糖2.3％、融合蛋白1.5％、维生素4.3％、抗病毒多肽1.5％、细胞因子模拟肽3.7％、小分子活性多肽2.8％、乳酸1.8％、乙醇酸0.4％、氯化锌0.3％、氯化钠0.2％和余量碳水化合物。
本发明的方法具体参数表格如下：表1
| 制作原料 | 培养周期 | 干细胞总数量 | 存活数量 | 存活率 |
| 胎盘组织 | 1-3/天 | 1.58×10<sup>7</sup> | 1.52×10<sup>7</sup> | 95.15％ |
传统的方法具体参数表格如下：表2
| 制作原料 | 培养周期 | 干细胞总数量 | 存活数量 | 存活率 |
| 胎盘组织 | 2-7/天 | 1.54×10<sup>6</sup> | 1.45×10<sup>7</sup> | 94.15％ |
。
综上，通过表1和表2明显看出本发明的方法效果更优，本发明通过采用诱导分化技术及克隆技术基础上，进行制作间充干细胞，获得的干细胞具有高纯度、高活率、无污染，并且整体原材料较为广泛，且整体制作方法较为效率，并且可以通过制作的培养基进行长期保存，值得推广。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种间充干细胞的制备方法，其特征在于：具体制作方法包括以下，
S1,首先对提取的生物组织进行充分的清洗，以备用；
S2,将生物组织送入离心旋转机中进行高速旋转分离，并加入生物酶进行溶解；
S3,对细胞进行诱导分化；
S4,采用基因克隆方法进行复制干细胞；
S5,制作培养基，将分化后的干细胞进行培养，并冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述生物组织包括骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织及牙髓。
3.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤，剪碎成0.5-1.5mm的组织块,加入IV型胶原酶(1.0g/L),置37C恒温振荡培养箱振荡消化3h后,用80目滤网过滤,将滤过的细胞悬液离心洗涤，然后用无血清培养液混匀细胞,以1.0x105/cm2接种于T-75cm2培养瓶中,置37C、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养,每隔3-4h换液，融合至80％-90％传代培养,加入2.5g/L胰酶消化,按1:2或1:3传代至T-75cm2培养瓶中。
4.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中，先将冻存细胞取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液；加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5％CO2的细胞培养箱中培养；
细胞密度达到80％-90％时.去培养基，10mlPBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液，再加入10mlPBS，经高压灭菌，保存于40C，吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×105/盘接种，继续培养。
细胞密度达到80％～90％时，使用10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加入1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管,加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpm×2min，弃上清液。
5.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤，L1，进行目的基因的克隆，根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以DNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段；
L2、在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连 接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒；
L3、将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序，然后重复循环操作，直到克隆完成。
6.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基包括以下重量百分数的组分：核糖核酸8％、脱氧核糖核酸1％、寡核苷酸1.5％、多聚核苷酸3.2％、五碳糖2.3％、融合蛋白1.5％、维生素4.3％、抗病毒多肽1.5％、细胞因子模拟肽3.7％、小分子活性多肽2.8％、乳酸1.8％、乙醇酸0.4％、氯化锌0.3％、氯化钠0.2％和余量碳水化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910794945.8A CN110423728A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种间充干细胞的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910794945.8A CN110423728A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种间充干细胞的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110423728A true CN110423728A (zh) | 2019-11-08 |
Family
ID=68416074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910794945.8A Pending CN110423728A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种间充干细胞的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110423728A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130059378A1 (en) * | 2010-09-13 | 2013-03-07 | Bing Huang | Human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells and preparation method thereof |
| CN104630141A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-05-20 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法 |
| CN106085952A (zh) * | 2016-07-05 | 2016-11-09 | 四川华皓生物科技有限公司 | 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法 |
| CN108504628A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-09-07 | 四川大学 | 人脐带间充质干细胞的培养方法 |
| CN109929806A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-06-25 | 北京吉源生物科技有限公司 | 一种双基因修饰的干细胞及其用途 |
| CN110004105A (zh) * | 2018-01-05 | 2019-07-12 | 上海清流生物医药科技有限公司 | 一种蛋白在细胞培养中的应用 |
| WO2021135073A1 (zh) * | 2020-01-05 | 2021-07-08 | 浙江大学 | 一种yap1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法 |
-
2019
- 2019-08-27 CN CN201910794945.8A patent/CN110423728A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130059378A1 (en) * | 2010-09-13 | 2013-03-07 | Bing Huang | Human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells and preparation method thereof |
| CN104630141A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-05-20 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法 |
| CN106085952A (zh) * | 2016-07-05 | 2016-11-09 | 四川华皓生物科技有限公司 | 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法 |
| CN109929806A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-06-25 | 北京吉源生物科技有限公司 | 一种双基因修饰的干细胞及其用途 |
| CN110004105A (zh) * | 2018-01-05 | 2019-07-12 | 上海清流生物医药科技有限公司 | 一种蛋白在细胞培养中的应用 |
| CN108504628A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-09-07 | 四川大学 | 人脐带间充质干细胞的培养方法 |
| WO2021135073A1 (zh) * | 2020-01-05 | 2021-07-08 | 浙江大学 | 一种yap1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| XIAO-AI CHEN等: "Plasmid-encapsulated polyethylene glycol-grafted polyethylenimine nanoparticles for gene delivery into rat mesenchymal stem cells", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 * |
| YAO HE等: "Overexpression of the Circadian Clock Gene Rev-erbα Affects Murine Bone Mesenchymal Stem Cell Proliferation and Osteogenesis", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 * |
| 张馨等: "重组腺病毒介导突变型低氧诱导因子1α基因转染脂肪间充质干细胞并促进其增殖", 《中国组织工程研究》 * |
| 李新平等: "腺病毒介导的KGF基因修饰促进表皮干细胞增殖", 《中国临床解剖学杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110551684B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞制备方法 | |
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN112430567B (zh) | 一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用 | |
| CN103396990A (zh) | 一种制备间充质干细胞的方法 | |
| CN103667187A (zh) | 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 | |
| CN108795855A (zh) | 一种间充质干细胞的无血清培养基 | |
| CN104726406A (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| CN111500578B (zh) | 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用 | |
| CN108456657A (zh) | 犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法 | |
| CN111088224B (zh) | 促进脐带间充质干细胞向成软骨定向分化的方法 | |
| CN115851587A (zh) | 一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法 | |
| LU507631B1 (en) | Crispr/cas9-grna targeting plasmid, donor plasmid, and preparation method for immortalized mouse cell line | |
| CN107083359B (zh) | 干细胞培养基及干细胞分离方法 | |
| CN116200343A (zh) | 一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和用途 | |
| CN110964693A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 | |
| CN108728408B (zh) | 犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基 | |
| CN111733161B (zh) | circ6148及其重组载体在促进血管生成上的应用 | |
| CN109652368A (zh) | 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法 | |
| CN119979470A (zh) | 一种可体外长期培养的猪肌肉干细胞细胞系及其应用 | |
| CN110423728A (zh) | 一种间充干细胞的制备方法 | |
| CN105039241B (zh) | 中华鳖心脏细胞连续细胞系及其构建方法和超低温冷冻保存方法 | |
| CN106434543A (zh) | 一种培养基及细胞培养方法 | |
| CN103773734B (zh) | 具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法 | |
| CN119391631A (zh) | 一种脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及培养方法 | |
| CN115820546B (zh) | 一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191108 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |