CN110396510A - 一种抗旱的蛋白及其编码基因和其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗旱的蛋白，是如下1)或2)的蛋白：1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的由1)衍生的蛋白质。

Description

一种抗旱的蛋白及其编码基因和其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高度抗旱的蛋白及其编码基因和其应用。

背景技术

玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食作物之首。我国是玉米生产和消费大国，播种面积、总产量、消费量仅次于美国，均居世界第二位。培育高产、优质、稳产的农作物新品种是粮食生产可持续发展的最佳途径。我国粮食生产最大的威胁是旱灾，而玉米为喜水植物，最易受旱灾影响，导致玉米植株生长发育影响严重，单产减少。因此，挖掘玉米干旱胁迫响应的基因，对阐明玉米干旱胁迫响应形成的分子机理以及玉米耐旱性的遗传改良，具有非常重要的意义。

目前一些研究表明，植物中的部分编码蛋白激酶的基因可以对非生物胁迫例如干旱作出响应。一些分子和生化的研究已经证实，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径可对干旱胁迫作出防御反应。该级联途径包括三种蛋白激酶：MAPKKK(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)、MAPKK(mitogen-activated protein kinase kinase)和MAPK(mitogen-activated proteinkinase)。它们均为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，通过其特定氨基酸的磷酸化被逐级活化，从而传递信号，特异性感受上游刺激并级联放大传递给靶蛋白。MAPKKK位于MAPK级联途径的上游，是一类Ser/Thr蛋白激酶。它通过信号分子受体或其本身直接感受胞外刺激从而被磷酸化激活。

已有一系列研究证实了MAPK通路在干旱胁迫中的重要意义(Morris,2001；Yeet.al.,2017)。紫花苜蓿可在非ABA依赖的情下由干旱激活p44MMK4的表达(Jonak et.al.,1996)；而一个在拟南芥和烟草中具有高度同源性的基因AtMPK3也在干旱诱导下表达上调(Mizoguchi et.al.,1996)；拟南芥中的MAPKKK基因AtMEKK1在干旱处理5分钟后被激活，随后24小时内表达持续增强(Tsuneaki et.al.,2002)。水稻中的OsMKK1、OsMSRMK2、OsMAPKK44和OsMAPK5在干旱条件下表达水平均显著增强(Kumar et.al.,2008；Agrawalet.al.,2002；Jeong et.al.,2006；Xiong et.al.,2003)，且过表达MAPKKK家族的DSM1基因可以显著增强水稻转基因株系苗期的抗旱性(Ning et.al.,2010)。而在玉米中，也有研究发现干旱处理后ZmMPK3的转录水平快速上升(Wang et.al.,2010a)。此外，MAPK可在玉米叶片在水分胁迫下的抗氧化损伤过程中起到一定的正调控作用(张孝华等，2009；张阿英，2006)。Shou等(2004)的研究表明烟草的MAPKKK基因NPK1的玉米植株表现出明显强于野生型的抗旱性能。此外Xiao等(2009)将NPK1基因转入水稻后，在干旱条件下使转基因水稻的产量增产23％。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的抗旱的蛋白及其编码基因，命名为ZmMAPKKK18。

本发明提供的蛋白，其为如下1)或2)的蛋白：

1)SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)SEQ ID №.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而衍生的氨基酸序列组成的与植物抗旱相关的蛋白质。

SEQ ID №.1的核苷酸序列为1440bp，如下：

ATGGCAACAGCGGCGCCGGTCAGCTGCCGGTGGACGCGCGTCCTCACGCTCGGCCGCGGCGCGTCGGGCGCGGTGGTGTCGCTCGCGGCCGACGCCGCCTCGGGCGCGCTCTTCGCGGTCAAGTCCGCCCCCGCGGGGACGCGGGCCGCGGAGAGCCTGCGGCGCGAGGGGAGCATCCTGTCCGCGCTCCGGTCCCCGCACGTGGTCCCCTGCCTGGGCCTCCGCGCCGCGGCGGACGGCGGGTGCGAGCTGCTCCTCGAGTTCGCGCCGGGCGGCTCGCTGGCGGACGTGGCGGCGAGGAGGAGCGGGCGCGACGAGCGCGCGGTCGCCGCGTACGCCGCGGACGTGGCGCGGGGCCTGGCGTACCTCCACGGGCGCTCGGTCGTGCACGGCGACGTCAAGGCGCGGAACGTCGTGGTGGGCGCCGACGGCCGCGCCATGCTCGCCGACTTCGGCTGCGCCAGGGCCGCGGCGGGCGGCGCCGACCCCGGGCGCCCCGTCGGCGGCACGCCGGCGTTCATGGCGCCCGAGGTGCTGCGCGGCGAGGGGCAGGGCCCCGCCGCCGACGTCTGGGCGCTGGGCTGCACCGTCGTCGAGATGGCCACGGGCCGCGCGCCGTGGAGCGACCTGGACGGCCTCCCCGCGGCCGTGCTCCGGGTCGGGTACACCGACGCCGTGCCCGAGGCGCCCCGCTGGATGTCGCCGGAGGCCAAGGACTTCTTGGCCCGGTGCTTCGCGAGGGACCCGCGCGAGCGGTGCACCGCGGCGCAGCTGTTGGAGCACCCGTTCCTGGCGTCGGCTGGCTGCGGCGCCATGGCGGAGTGGGTGTCTCCCAAAAGCACGCTGGACGCCGCGCTCTGGGAATCCGACGCCGACGATGGCTCCGATGACGAGGGGGACGTGTCAGAGAGCCCCGCCCAGAGAATCAAGGCGTTGGCCTGCCCCTGCTGCTCGGCCTTGCCGGACTGGGATTCCGAAGAAGGCGACTGGATTGAGGTGCTCGGTGAGCAATGTGAGGCCAACGGTTTGGTACCACCGACCAAAGAGGTGGCCAAGGAGACGGCCAGCGAAGACGAGTGCCAGCTCCTGATCCTGAGTGGGGTGTTGGAAACAGAGGTTGACTTCGTCGACGCCGATGCAGAGGGTGATCATCGTGCTAGGTGTTCTGTAGATGTAGGATTAGCTACTGTTCCGTCAGTTGAGCAGCTGCAGGAAGAGCAGCCAACTGTTTTTCTTACGGAGGCTTGTCATAACAATACTGAAATGTCGAAGTCATTTTTACTGCAAAATCGTCCCTTCGTTGCTGTGTCTTCTGTTCTCCTACTATTCGTTCTACTATTCGTCCACAAAAGAAAATCTAGAACTGCCAAACTGGTGCGATGCGACAATTCCAGAAACGTTGTTCTAGTTCTAGACCGAGGCGGCGACGGCGAGGCGTGA

SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由479个氨基酸残基组成，如下:

MATAAPVSCRWTRVLTLGRGASGAVVSLAADAASGALFAVKSAPAGTRAAESLRREGSILSALRSPHVVPCLGLRAAADGGCELLLEFAPGGSLADVAARRSGRDERAVAAYAADVARGLAYLHGRSVVHGDVKARNVVVGADGRAMLADFGCARAAAGGADPGRPVGGTPAFMAPEVLRGEGQGPAADVWALGCTVVEMATGRAPWSDLDGLPAAVLRVGYTDAVPEAPRWMSPEAKDFLARCFARDPRERCTAAQLLEHPFLASAGCGAMAEWVSPKSTLDAALWESDADDGSDDEGDVSESPAQRIKALACPCCSALPDWDSEEGDWIEVLGEQCEANGLVPPTKEVAKETASEDECQLLILSGVLETEVDFVDADAEGDHRARCSVDVGLATVPSVEQLQEEQPTVFLTEACHNNTEMSKSFLLQNRPFVAVSSVLLLFVLLFVHKRKSRTAKLVRCDNSRNVVLVLDRGGDGEA。

本发明利用生物信息学技术鉴定出B73玉米基因组中所有的71个MAPKKK家族成员，并通过RNA-Seq找到8个在干旱下表达差异显著差异的基因，随后发现其中一个基因在干旱胁迫下的郑单619以及8个自交系(包括J24、J853、X178、E28、C8605-2、200B、齐319及B73)总计9个样品中的相对表达量均发生显著上调，通过玉米自然变异群体关联分析验证该基因中有7个SNP与耐旱性显著相关。推断该基因可能在玉米苗期耐旱性起到重要作用，因此，我们将这个位于第8号染色体、所表达的蛋白定位于叶绿体中的新基因(GRMZM2G305066)命名为ZmMAPKK18，并将其密码子进行优化，将人工合成的优化后的片段转入拟南芥及玉米中，转基因植株较野生型均表现出更强耐旱性。

附图说明

图1 ZmMKKK18基因PCR扩增结果；M为DNAMarker；1-4为ZmMKKK18目的基因扩增产物；

图2 ZmMKKK18过表达载体载体图示；

图3 ZmMKKK18过表达载体双酶切(BamHⅠ/AscⅠ)检测结果；M为DNAMarker；1-10为ZmMKKK18表达载体酶切产物；

图4 ZmMKKK18转化植株叶片直接PCR结果；M为DNAMarker；1-4为转化植株的叶片直接PCR产物，+为阳性对照，-为阴性对照；

图5农杆菌介导玉米幼胚遗传转化流程；

图6转ZmMAPKKK18基因拟南芥T1代阳性植株筛选；左侧没有植株生长的是野生型对照，右侧是转基因植株；

图7 ZmMAPKKK18转基因拟南芥植株的分子检测；M表示DNAMarker；-表示以野生型拟南芥基因组DNA为模板；+表示以质粒DNA作为阳性对照模板；2、5、11、17分别为以对应编号的转基因拟南芥植株基因组DNA为模板；

图8 ZmMAPKKK18转基因T3代植株的表型鉴定；WT为野生型拟南芥，vi8为转基因植株；CG为正常施水处理组；EG为10％PEG 6000溶液胁迫处理组；

图9 ZmMAPKKK18过表达及非转基因玉米株系苗期表型；ZPM9为对照植株，V18为转基因植株；CK为正常施水处理组；MD为中度胁迫处理组；SD为重度胁迫处理组；

图10 ZmMAPKKK18转基因T3代植株抗旱相关指标鉴定。

具体实施方式

ZmMAPKKK18基因功能验证

1材料与方法

1.1实验材料

本实验选取拟南芥野生型哥伦比亚亚型(Columbia-0)进行遗传转化。

1.2实验试剂

核酸内切酶：Thermo公司；

Green Dream PCR Mix：Thermo公司；

Plant RNA kit提取试剂盒：Omega公司；

大肠杆菌质粒提取试剂盒：Axygen公司；

除草剂(草甘膦异丙胺盐)：孟山都公司

1.3实验菌株

植物表达载体VK011-ZmMKKK18：

根癌农杆菌GV3101电击转化感受态细胞：北京全式金公司

1.4培养基及溶液

MS固体培养基(MS 4.43g，蔗糖30g，琼脂粉9g，蒸馏水定容至1L，pH 5.8)

蘸花侵染转化缓冲液(MS 2.21g，蔗糖50g，蒸馏水定容至1L，pH 5.8)

1.5实验方法

1.5.1 VK011-ZmMKKK18超表达载体构建

使用单子叶植物转基因载体构建试剂盒(Catalog.No.VK011-04)(购自唯尚立德生物技术有限公司)进行VK011-ZmMKKK18(以下简称V18)超表达载体的构建。

1.5.1.1 ZmMKKK18基因PCR引物

PCR引物按照载体构建试剂盒的要求进行设计。引物信息如下：

表1 ZmMKKK18基因PCR引物信息

1.5.1.2目的基因的PCR反应

用表1中的PCR引物对目的基因ZmMKKK18进行PCR反应，反应体系如下表2所示。

表2 ZmMKKK18 PCR反应体系(50μl)

PCR扩增程序为：94℃预变性2min→(98℃变性10s→56℃退火30s→72℃延伸1min)×35个循环→72℃过度延伸7min→4℃保存。

1.5.1.3 PCR产物凝胶电泳及回收

对ZmMKKK18基因PCR产物进行凝胶电泳，电泳结束后进行回收。

将50μl的PCR产物与40μl的酶切产物全部加样至1％的凝胶孔中进行电泳，设置电压10V/cm，电泳时间30min，使用凝胶成像仪对结果进行观测与分析，选择大小为1437bp和4000bp的凝胶条带进行切胶回收。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen)进行琼脂糖凝胶的回收：

1)将切下的凝胶分别放到1.5ml离心管中，称重并记录总重量，减去1.5ml离心管的重量，即为凝胶重量(取1g重量＝1ml体积)；

2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A(熔化剂)，置于75℃金属浴加热，期间每隔2min颠倒混匀一次，约8min后凝胶完全熔化；

3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B(结合液)，充分混匀；

4)将步骤3中的溶液全部转移至试剂盒的DNA吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液；

5)加入500ul Buffer W1(洗涤液)，12000rpm离心1min，弃滤液；

6)加入700ul Buffer W2(去盐液)，12000rpm离心1min，弃滤液，此步骤需要进行两次，洗涤液用前应注意按要求添加无水乙醇；

7)将吸附柱放到灭菌的洁净1.5ml离心管内，静置5min，加入25μl去离子水，再次静置5min，12000rpm离心2min洗脱DNA。将去离子水提取加热至65℃，并且洗脱2次可以有效增加DNA回收量。

8)最终将产物定量稀释为15ng/μl。

1.5.1.4目的基因与产物连接

1)将试剂盒中的Easy Assembly mix取出并置于冰上冰浴融化，融化后的试剂进行低速离心操作，使管盖和管壁上的残留液体离心至管底部；

2)取0.5μl定量稀释的回收产物和2μl Plant Transgenic Vector于0.2ml离心管中混合，将其全部吸出加到冰浴中的Easy Assembly mix中，用枪头轻轻搅拌混匀；

3)将混合液立即在50℃金属浴上反应25min，进行下一步的转化实验。

1.5.1.5转化

使用使用DH5α大肠杆菌感受态和具有卡纳抗性的LB培养基进行载体转化实验。具体操作步骤如下：

1)取若干支保存于-80℃超低温冰箱的感受态细胞，每支100μl，立即置于冰上冰浴融化备用；

2)将连接产物全部慢慢加入感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌均匀，这一过程严禁用移液枪吹打，加样完成后立即置于冰上冰浴30min。注意实验过程中需要分别设置阳性和阴性对照：阳性对照设置为向100μl感受态中加入0.1μl Plant Transgenic Vector，其主要目的用于检验感受态细胞的活性；阴性对照设置为向100μl感受态中加入适当体积去离子水，其主要目的用于检验转化过程中的LB培养基是否具有抗性选择；

3)将冰浴结束的感受态细胞取出后立即置于42℃金属浴上热激30s，然后快速将感受态转移至冰上继续冰浴2min。经过多次实验发现，热激30s的转化效率较45s及90s均要高；

4)向热激结束的感受态中加入800μl无抗性的灭菌LB培养液，37℃，200rpm培养1h，使其充分复苏。同时将含有卡纳抗生素抗性的LB培养基平板置于37℃培养箱中预热；

5)将加入LB培养液进行复苏培养后的感受态全部加入到预热的LB培养板上，并将细胞均匀涂布在平板上。倒置密封后置于37℃培养箱中12～14h。

1.5.1.6酶切鉴定

挑取平板上的阳性单菌落，接种于含卡纳抗性的LB培养液中扩繁，取扩繁后菌液进行质粒提取，具体实验操作步骤如下：

1)取50ml灭菌的LB培养液置于灭菌洁净的100ml锥形瓶中，加入50μl卡纳青霉素，加入40μl含V18载体的大肠杆菌菌液，密封后置于摇床上，37℃，200rpm，摇晃12-14h；

2)取2ml充分培养的菌液置于1.5ml离心管中，取多管，12000rpm离心1min，尽量将上清去除干净；

3)加入250μl Buffer P1(细菌悬浮液)，用枪头反复吹打直至菌体全部裂解，均匀悬浮于溶液中。若菌体裂解不完全，会影响最终的质粒产量；

4)加入250μl Buffer P2(细菌裂解液)，轻轻混匀直至溶液变为淡红色。混匀时不能用力摇晃，以免基因组DNA污染；

5)加入350μl Buffer P3(中和液)，立即轻轻混匀，这时会有白色丝状沉淀产生，静置5min，12000rpm离心10min。此步骤中也应避免摇晃时用力过大，否则很可能造成环状质粒的断裂；

6)将步骤5中的上清液全部吸出，转移至试剂盒中的离心吸附柱内，静置5min，在这一过程中，溶液中的质粒会与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12000rpm离心1min，倒掉废液；

7)向吸附柱内加入500μl Buffer PD(去蛋白液)，12000rpm离心1min，弃废液。此步骤可以进一步清除宿主菌中的核酸酶，防止其降解质粒。

8)向吸附柱内加入500μl Buffer PW(洗涤液)，12000rpm离心1min，弃废液。此步骤需进行两次。洗涤液用前应注意按要求添加无水乙醇；

9)将吸附柱置于灭菌的1.5ml离心管中，静置5min晾干，加入50μl去离子水，静置5min，12000rpm离心2min，收集管内洗脱液。

实验发现，将洗脱质粒用的去离子水提前置于60℃金属浴上加热，能够明显提高洗脱效率；用去离子水反复洗脱在一定程度上也能增加洗脱效率；去离子水的用量不宜太多也不宜太少，若太多，会降低质粒终浓度，若太少，则不能充分洗脱硅胶膜上的质粒，也会减少质粒获得量。

对提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切位点为BamHⅠ和AscⅠ。酶切体系配制如下：

表3 V18载体酶切体系(10μl)

按上表于0.2ml离心管内配置酶切体系，完成后震荡离心，置于金属浴上，37℃酶切1h。

酶切产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现两条带，一条为10.4kb，另一条为1440bp，则说明菌落为阳性菌落，取部分菌液或质粒进行测序，验证V18表达载体构建成功。保存阳性菌液为甘油菌。

1.5.2农杆菌介导转化玉米

1.5.2.1农杆菌感受态细胞的制备

1)取出一管EAH105农杆菌菌株，置于冰上解冻，待融化后取少量菌株接种于含卡纳抗性的YEP培养基中，置于28℃培养箱内，暗条件下培养48h；

2)挑取单菌落于50ml含卡纳抗性的YEP培养液中(含50mg/L Rif)，于28℃摇床上，暗条件下200rpm摇12～14h；

3)培养好的菌液冰浴10min，4℃条件下5000rpm离心5min，弃上清液，收集离心管底部细胞；

4)用液体MS培养基重悬细胞，使用分光光度计调节OD₅₅₀到0.4～0.6；

5)将农杆菌感受态分装成50μl/管，于-80℃超低温冰箱中储存备用。

1.5.2.2冻融法转化农杆菌

1)取制备好的农杆菌感受态，立即置于冰上融化，加入2μl V18载体质粒，用轻轻搅拌混匀，立即冰浴30min；

2)液氮处理1min，37℃恒温金属浴上热激5min，然后立即冰浴2min，该过程不要摇动离心管；

3)加900μl无抗性的LB培养液，28℃条件下，200rpm摇3h；

4)8000rpm离心1min，倒掉上清液，用100μl LB回溶菌体；

5)将全部菌液加入含卡纳抗性的YEP培养基上(含100mg/L Rif)，涂均匀，倒置密封放到28℃培养箱中2～3d；

6)挑取单菌落，使用表1中的PCR引物验证阳性单菌落，验证无误后扩繁并保存菌液备用。

1.5.2.3农杆菌介导转化玉米

1)取田间自交授粉10天的ZPM9自交系幼穗，去除幼穗顶部和底部部分，用次氯酸钠和0.1％Tween20混合溶液浸泡幼穗30min，消毒杀菌；

2)取出幼穗，用无菌水彻底清洗干净，超净工作台中进行剥胚，幼胚1.0～1.5mm大小最佳，有利于农杆菌侵染。将幼胚放到装有Inf侵染液的1.5ml离心管中备用；

3)取1.5.2.2中保存的菌液，在20℃条件下侵染幼胚15～20min；

4)用移液枪吸出侵染液，再用无菌滤纸慢慢吸去幼胚上残留的侵染液，将幼胚平放在Coc培养基上，28℃暗培养箱中共培养3d；

5)共培养结束后的幼胚转移至Ⅰ型选择培养基上，28℃暗培养箱中培养14d，幼胚成长为愈伤组织；

6)Ⅰ型选择培养结束后正常生长的愈伤组织转移至Ⅱ型选择培养基上，28℃暗培养箱中培养14d；

7)Ⅱ型选择培养结束后仍长势良好的愈伤组织转移至Ⅰ型再生培养基上，26℃暗培养箱中培养至长出幼芽；

8)Ⅰ型再生培养结束后的幼芽转移至Ⅱ型再生培养基上，26℃培养箱中进行光周期培养至长出绿芽；

9)Ⅱ型再生培养结束后的绿芽转移至III型再生培养基上，26℃培养箱中继续进行光周期培养直至长出幼根，形成幼苗；

10)III型再生培养结束后的幼苗转移至生根培养基中，26℃培养箱中光周期培养10～14d；

11)取再生植株小块叶片，使用Phire Plant Direct PCR Master Mix试剂盒(购自Thermo Scientific)对其直接PCR，对植株进行快速转基因检测。

直接PCR反应程序：98℃-预变性5min→(98℃-变性5s→62℃-退火5s→72℃-延长20s)×40个循环→72℃-过度延伸1min→4℃-保存。

对PCR产物进行凝胶电泳，判断检测材料是否为阳性植株；

12)取再生植株小块叶片，使用Bar转基因快速检测试剂盒(购自奥创生物技术有限公司)对植株内的Bar蛋白表达进行检测，判断检测材料是否为阳性植株。

13)对检测的阳性植株进一步做RT-PCR检测，挑选目的基因ZmMKKK18表达量高的2个转基因株系进行后续的抗旱功能鉴定。

1.5.2.4拟南芥的转化

1)取生长三周并长出较多未开发的花的野生型拟南芥备用；

2)待转化好的农杆菌培养至OD值约为1.2～1.6，室温4000rpm离心15min，弃上清收集菌体；

3)使用沾花侵染转化缓冲液重悬菌体，稀释至OD值为0.8；

4)每20mL菌液中加入10μL Silweet，将拟南芥倒置浸入菌液中，均匀侵染1min；

5)用保鲜膜包裹侵染好的植株，放置于16℃恒温培养箱中避光培养24hr；

6)取出并轻轻剥除保鲜膜，放置于培养架上继续培养直至结实。

1.5.2.5拟南芥阳性植株的筛选

1)取部分T1代转基因种子均匀等量种植于分别含的MS培养基平板上，测试可以耐受的除草剂浓度；

2)随后将其余种子均匀撒在含土与蛭石比例1：1的营养钵中，盖上保鲜膜，将水浇透；

3)待拟南芥长出两片绿色子叶后，按测试出的耐受浓度，三天喷施一次除草剂，约一周后，非阳性植株枯萎死亡，阳性植株正常生长；

4)取阳性植株叶片提DNA作为模板进行PCR鉴定。

1.5.2.6阳性植株的DNA提取

1)按说明书操作，全部室温进行。

2)将植株全株加入液氮研磨成粉末状；

3)每50-100mg加入500μL裂解液，涡旋震荡至充分混合均匀，14000g转速离心5min；

4)上清转移到收集柱中，静置5min后，14000g离心5min，弃液；

5)向收集柱中加入500μL的Wash I洗液，12000g转速下离心1min；

6)再次向收集柱中加入500μL的Wash II洗液，12000g转速离心1min，重复一次；

7)弃收集液，空管离心2min；

8)向收集柱中加入30μL DEPC水，离心1min；

9)收集管中即为植株总DNA，测量浓度并记录。

1.5.2.7阳性植株的PCR鉴定

将提取的DNA模板取1μL进行PCR鉴定。按照顺序依次加入下列各试剂：

将上述试剂轻轻混匀后进行PCR反应，反应条件如下：

取出5μL跑琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.3阳性植株的干旱胁迫处理

分别种植野生型拟南芥及阳性转基因植株，选取生长4周、长势基本一致的野生型和拟南芥植株各6盆，随机选为正常施水对照组及以10％PEG6000溶液灌溉的处理组两组，每个处理3个重复，期间量取等体积ddH₂O及10％PEG6000溶液灌溉幼苗3次。于处理14天后观察表型。

1.5.4转基因玉米植株的抗旱生物学功能鉴定

对获得的转基因玉米植株进行连续两代自交繁种得到T₂代种子，作为干旱胁迫实验中的处理材料，对照材料为ZPM9。本实验在北京市农林科学院玉米研究中心干旱棚内进行，具体实验方案如下：

1)实验材料命名为ZPM9，V18-1，V18-2均设正常灌水(CK)、中度干旱(MD)、重度干旱(SD)3个不同水分处理，每个处理设置10个重复；

2)对实验材料进行发芽处理，取洁净培养盒和灭菌处理过的滤纸，滤纸平铺于培养盒内，无菌水浸湿，取ZPM9，V18-1，V18-2种子若干平放到培养盒中，在30℃暗条件下进行发芽，适时补充水分；

3)同时准备播种用干旱盆，每盆装入适量苗期营养土(营养土+缓释肥)，浇水至刚好没过土面，备用；

4)2～3天种子萌发后，挑选发芽整齐一致的种子种在干旱盆中，每个旱播4粒，将萌发的种子置于穴内，根向下芽向上，轻轻盖上营养土；

5)待幼苗长至两叶期时，取少量叶片，用Bar转基因快速检测试剂盒对幼苗进行转基因检测，剔除非转基因杂株，留阳性植株；

6)试纸条筛选过的转基因植株继续生长，期间正常灌水，待植株长至三叶一芯时进行干旱处理；

7)每天9：00和15：00两次用土壤水分测量仪进行水分测量并记录，严格控制各处理组间的水分，各处理水分控制标准如下：

正常灌水处理(CK)：16～18(田间持水量的70％～80％)

中度干旱处理(MD)：12～14(田间持水量的50％～60％)

中度干旱处理(SD)：8～10(田间持水量的30％～40％)

8)连续进行14天的干旱胁迫处理，对各组材料的生长情况进行拍照。取各处理叶片和茎各10个重复，立即用液氮冷冻，保存在-80℃超低温冰箱中，为下一步相关生理指标的测定做准备；

9)参照1996年Grace and Logan提出的植物粗酶液提取方法，进行优化改进，进行样品粗酶液的提取。取上步保存的冻干样品约0.3g于研钵中并加入少量液氮轻轻研磨，将研钵放到冰上，加入2ml提取缓冲液和石英砂，研磨直至成匀浆，将匀浆装到多个2.0ml离心管中，4℃条件下12000rpm离心10min，取上清液再次保存到－80℃超低温冰箱中，备用。

1.5.4.1光合速率、气孔导度及蒸腾速率

使用LI-6400XT光合仪测定光合速率、气孔导度及蒸腾速率指标。在干旱胁迫的第14天上午9时～11时进行测定。设置进气室CO₂浓度为400ppm，光照室光强为1200Lux。选择完全展开新叶的同一部位进行测量，待测量数值稳定后记录数据。

1.5.4.2 PEPC羧化酶

在比色杯中加入反应混合液(0.5ml 70mM MgSO₄，0.5ml 70mM NaHCO₃，1ml14mMPEP)和1ml酶提取液，对340nm波长比色，每隔20s读取一次OD值，根据OD值的变化得到NADH的消耗速率，再根据每毫克蛋白的NADH消耗速率来定义PEPC活性。

1.5.4.3叶绿素

取0.2g叶片，剪碎后放到50ml离心管中，向管内加入0.5ml 100％丙酮和15ml80％丙酮进行浸提。待叶片变白后浸提结束，12000rpm离心5min，取上清液加入比色杯中，对波长645nm、663nm和652nm进行比色，根据公式：叶绿素a浓度：Ca＝12.72×A663-2.59×A645；叶绿素b浓度：Cb＝22.88×A663-4.67×A645。两者之和即为总的叶绿素浓度。

2结果与分析

2.1 ZmMKKK18基因PCR扩增

使用表1中的引物对ZmMKKK18基因进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳，结果如图1。以1Kb DNA Marker作参照，扩增产物约为1400bp，与已知的目的基因1440bp相符，对产物进行切胶回收，备用。

2.2 VK011-ZmMKKK18载体构建

使用单子叶植物转基因载体构建试剂盒(Catalog.No.VK011-04)进行V18超表达载体的构建，载体图示如图2。对获得的质粒使用BamHⅠ和AscⅠ内切酶进行双酶切，酶切结果如图3。对挑取的10个单菌落提取的质粒进行双酶切，酶切泳结果显示有两条带，一条带为10.4kb，另一条带为1440bp，测序结果与ZmMKKK18基因序列比对完全吻合，V18超表达载体构建成功。

2.3玉米遗传转化

农杆菌感受态EAH105转化V18表达载体，取玉米受体材料ZPM9自交授粉10天的幼胚，通过农杆菌介导转化，经过共培养，静息培养，选择培养，再生培养四个时期，获得转化植株，详见图5。利用直接PCR法(检测目的基因)和Bar转基因快速检测试纸(检测Bar蛋白)检测转化植株，筛选获得转基因阳性植株。用Bar转基因快速检测试纸进行检测，筛选得到4株转基因试纸呈阳性的植株，进一步取上述4株转化植株的小块叶片，对获得的转化植株的小块叶片进行叶片直接PCR反应，结果显示详见图4，可见4株转化植株中扩增出1440bp大小的目的基因条带，表明目的基因已整合进入玉米基因组。

2.4 ZmMAPKKK18转基因拟南芥阳性植株的鉴定

通过农杆菌蘸花侵染法将pCAMBIA3301-ZmMAPKKK18表达载体转入拟南芥中，整合到拟南芥基因组中的序列包括35s启动子、ZmMAPKKK18基因及除草剂抗性基因。对转基因拟南芥T1代植株进行浓度的除草剂喷施筛选后，如图6所示，左侧第一列及第二列一半总计6盆为野生型拟南芥。在除草剂喷施处理后，种植有野生型拟南芥的营养钵中基本没有能够正常发苗生长的植株个体，而第二列的两盆及第三、四列总计10盆种植有T1带转基因植株的营养钵中，有部分植株长势正常，植株呈现绿色，表现出对除草剂的抗性。这些在除草剂压力下存活的植株即可能为阳性转基因植株。

随后在结实后，摘取长势正常的抗除草剂植株叶片并按摘取顺序编号。提取基因组DNA，扩增ZmMAPKKK18基因片段，目的片段的大小应为1.4kb。如图7所示，图中展示的是随机挑选的阳性克隆2、5、11、17进行PCR扩增，结果显示，这四个克隆均可扩增出大小正确的目的基因片段，均为转基因阳性植株。最终由68个T1代转基因植株中筛选到31个可以扩增出目的片段的阳性植株。收取种子后，T2代转基因植株含有除草剂的平板上进行分离比鉴定，其中有14个株系的分离比为3:1，选取这14个株系用于纯合株系筛选。

实验得到过表达ZmMAPKKK18基因的拟南芥转基因植株，如图8，在干旱胁迫处理后发现，野生型植株出现了大面积的枯黄萎蔫甚至坏死。但是过表达ZmMAPKKK18转基因植株仅有部分叶片有轻微枯黄萎蔫，基本没有植株出现死亡，大部分转基因植株受干旱胁迫影响不大，说明在干旱胁迫下，过表达ZmMAPKKK18转基因植株表现出了较强抗旱性能。

2.5转基因玉米的干旱胁迫处理结果

于旱棚内对挑选的转基因植株进行干旱胁迫处理，设实验组材料为V18-1，V18-2，对照材料为ZPM9，通过苗期水分控制对材料进行干旱胁迫处理，胁迫14天后对各组材料的生长情况进行拍照。由图9可看出，干旱胁迫条件下，MD组和SD组生长势均弱于CK组，说明不同程度的干旱胁迫已对植株的生长造成了不同程度的影响。同时也发现，ZPM9干旱条件下的MD和SD处理材料发生明显的卷叶，老叶枯死等现象；V18-1、V18-2的MD和SD处理材料未发生卷叶及叶片枯死等胁迫表现。表明中度及重度干旱胁迫下，ZmMAPKKK18转基因植株表型受干旱胁迫影响较小。

图10的对照试验表明，三个材料的CK、MD、SD处理下的光合速率均有所降低，然而，ZPM9的下降幅度远高于V18-1和V18-2。在MD和SD处理下，V18-1和V18-2的光合速率均高于同处理下的ZPM9，尤其是在SD处理下可以看出，在受到重度干旱胁迫时，V18-1和V18-2仍能保持较高的光合速率，而ZPM9的光合速率已经降至10以下。因此，干旱下V18植株较ZPM9植株有更高的光合速率。

在MD处理下ZPM9、V18-1、V18-2三组材料的PEPC羧化酶均呈极显著升高：ZPM9涨幅60％，V18-1涨幅85％，V18-2涨幅47％。在SD处理下，ZPM9的PEPC羧化酶较MD处理极显著下降，降幅24％，而V18-1、V18-2相较于MD处理则没有明显的变化，即，SD处理下V18植株的PEPC羧化酶活性高于同处理下的ZPM9。因此V18转基因植株有可能通过维持较高的PEPC羧化酶活性，从而保证重度干旱下光合作用的正常进行。

而三个处理下的三个材料的蒸腾速率变化与气孔导度变化趋势基本一致。V18植株与ZPM9植株相比，在同等干旱条件下，转基因植株具有更低的蒸腾速率，这一表现在SD处理下尤为明显。通过降低蒸腾速率，V18植株能够更好地适应干旱环境。

ZPM9的CK-MD-SD的叶绿素呈现出梯度下降的趋势，MD处理较CK处理下降了28％，SD处理较MD处理下降了23％；V18-1的MD处理较CK处理下的叶绿素含量没有明显变化，SD处理较MD处理则下降了22％；V18-2的MD处理较CK处理的叶绿素含量同样没有明显变化，SD处理较MD处理下降了23％。整体上来看，V18-1MD处理的叶绿素含量高于同为MD处理的ZPM9，在SD处理下，V18-1和V18-2的叶绿素含量均明显高于ZPM9。因此，V18植株在干旱下比ZPM9植株有更高的叶绿素含量。

综上，ZmMAPKKK18转基因株系各项抗旱指标均优于对照。

总结

由于植物的抗旱性是一个较为复杂的性状，部分抗旱基因过表达后虽然可以在干旱胁迫表现出较好的抗旱性，但在正常施水情况下却会抑制过表达转基因植株的生长，这也是很多抗旱基因无法应用于生产实际中的一个重要原因。而本研究发现，过表达ZmMAPKKK18转基因植株在正常施水下情况下，表型与野生型植株基本一致，不影响植株的正常生长发育，而仅在干旱胁迫下，表现出优异的抗旱性能。

上述实验结果均表明，玉米基因ZmMAPKKK18可显著增强玉米对干旱的抗性，是一个可应用于玉米优良种质资源进行抗旱性改良和选育的抗旱基因。

Claims (3)

1.一种抗旱的蛋白，其为如下1)或2)的蛋白：

1)SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)SEQ ID №.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而衍生的氨基酸序列组成的与植物抗旱相关的蛋白质；

SEQ ID №.1的核苷酸序列为1440bp，如下：

ATGGCAACAGCGGCGCCGGTCAGCTGCCGGTGGACGCGCGTCCTCACGCTCGGCCGCGGCGCGTCGGGCGCGGTGGTGTCGCTCGCGGCCGACGCCGCCTCGGGCGCGCTCTTCGCGGTCAAGTCCGCCCCCGCGGGGACGCGGGCCGCGGAGAGCCTGCGGCGCGAGGGGAGCATCCTGTCCGCGCTCCGGTCCCCGCACGTGGTCCCCTGCCTGGGCCTCCGCGCCGCGGCGGACGGCGGGTGCGAGCTGCTCCTCGAGTTCGCGCCGGGCGGCTCGCTGGCGGACGTGGCGGCGAGGAGGAGCGGGCGCGACGAGCGCGCGGTCGCCGCGTACGCCGCGGACGTGGCGCGGGGCCTGGCGTACCTCCACGGGCGCTCGGTCGTGCACGGCGACGTCAAGGCGCGGAACGTCGTGGTGGGCGCCGACGGCCGCGCCATGCTCGCCGACTTCGGCTGCGCCAGGGCCGCGGCGGGCGGCGCCGACCCCGGGCGCCCCGTCGGCGGCACGCCGGCGTTCATGGCGCCCGAGGTGCTGCGCGGCGAGGGGCAGGGCCCCGCCGCCGACGTCTGGGCGCTGGGCTGCACCGTCGTCGAGATGGCCACGGGCCGCGCGCCGTGGAGCGACCTGGACGGCCTCCCCGCGGCCGTGCTCCGGGTCGGGTACACCGACGCCGTGCCCGAGGCGCCCCGCTGGATGTCGCCGGAGGCCAAGGACTTCTTGGCCCGGTGCTTCGCGAGGGACCCGCGCGAGCGGTGCACCGCGGCGCAGCTGTTGGAGCACCCGTTCCTGGCGTCGGCTGGCTGCGGCGCCATGGCGGAGTGGGTGTCTCCCAAAAGCACGCTGGACGCCGCGCTCTGGGAATCCGACGCCGACGATGGCTCCGATGACGAGGGGGACGTGTCAGAGAGCCCCGCCCAGAGAATCAAGGCGTTGGCCTGCCCCTGCTGCTCGGCCTTGCCGGACTGGGATTCCGAAGAAGGCGACTGGATTGAGGTGCTCGGTGAGCAATGTGAGGCCAACGGTTTGGTACCACCGACCAAAGAGGTGGCCAAGGAGACGGCCAGCGAAGACGAGTGCCAGCTCCTGATCCTGAGTGGGGTGTTGGAAACAGAGGTTGACTTCGTCGACGCCGATGCAGAGGGTGATCATCGTGCTAGGTGTTCTGTAGATGTAGGATTAGCTACTGTTCCGTCAGTTGAGCAGCTGCAGGAAGAGCAGCCAACTGTTTTTCTTACGGAGGCTTGTCATAACAATACTGAAATGTCGAAGTCATTTTTACTGCAAAATCGTCCCTTCGTTGCTGTGTCTTCTGTTCTCCTACTATTCGTTCTACTATTCGTCCACAAAAGAAAATCTAGAACTGCCAAACTGGTGCGATGCGACAATTCCAGAAACGTTGTTCTAGTTCTAGACCGAGGCGGCGACGGCGAGGCGTGA；

SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由479个氨基酸残基组成，如下：

MATAAPVSCRWTRVLTLGRGASGAVVSLAADAASGALFAVKSAPAGTRAAESLRREGSILSALRSPHVVPCLGLRAAADGGCELLLEFAPGGSLADVAARRSGRDERAVAAYAADVARGLAYLHGRSVVHGDVKARNVVVGADGRAMLADFGCARAAAGGADPGRPVGGTPAFMAPEVLRGEGQGPAADVWALGCTVVEMATGRAPWSDLDGLPAAVLRVGYTDAVPEAPRWMSPEAKDFLARCFARDPRERCTAAQLLEHPFLASAGCGAMAEWVSPKSTLDAALWESDADDGSDDEGDVSESPAQRIKALACPCCSALPDWDSEEGDWIEVLGEQCEANGLVPPTKEVAKETASEDECQLLILSGVLETEVDFVDADAEGDHRARCSVDVGLATVPSVEQLQEEQPTVFLTEACHNNTEMSKSFLLQNRPFVAVSSVLLLFVLLFVHKRKSRTAKLVRCDNSRNVVLVLDRGGDGEA。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.含权利要求2所述的编码基因的重组载体。