CN110384826B - 一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法。本发明采用羊骨膜组织，通过原料处理、脱细胞、样本消毒等过程，制备获得羊骨膜脱细胞基质引导骨再生膜，以用于修复牙槽骨或颌骨骨缺损的引导骨再生术中。本发明提供的羊骨膜衍生脱细胞基质引导骨再生膜有效去除了组织中的细胞成分，消除了异种组织的免疫原性，保留了羊骨膜外基质的活性成分，为骨修复提供良好的微环境，促进口腔骨缺损的修复与改建。另外，本发明制备羊脱细胞骨膜方法的成本低廉，而且对比于其它哺乳动物，羊骨膜材料的厚度与机械性能更加适用于口腔引导骨再生技术的应用。

Description

一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法。

背景技术

种植修复成为缺失牙患者的首选治疗方案，但种植修复成功的关键是缺失牙局部要有足够的牙槽骨量，然而临床上由于炎症、外伤、废用性萎缩、颌骨肿瘤术后、先天缺牙等因素，存在大量由于种植区可用骨高度或宽度不足而无法常规种植修复的病例。口腔引导骨再生(Guided bone regeneration,GBR)技术最早来源于牙周手术中的引导组织再生技术(guided tissue regeneration,GTR)，于20世纪80年代被正式引入种植手术中，沿用至今，取得了显著的临床应用效果。该技术是应用一张生物膜材料在牙槽骨缺损的表面建立并维持一个局部封闭的空间，以阻断外周纤维结缔组织的长入，使骨组织在这个空间里充分完成骨再生与骨改建的过程。口腔引导骨再生技术的成功所依赖的原理是由于不同细胞的迁移速率不尽相同，纤维结缔组织细胞的迁移速率远大于骨细胞。若无生物屏障膜的保护，纤维结缔组织就会优先占领骨缺损的部位，致使骨组织没有空间再生，而生物屏障膜的主要作用就是在成骨的过程中阻挡软组织的侵扰。因此，口腔引导骨再生屏障膜是影响引导骨再生技术成功的关键因素之一。

组织衍生细胞外基质材料(extracellular matrix，ECM)是由同种异体或异种的组织经过脱细胞技术的处理而获得，其基础与应用研究在组织工程与再生医学的研究领域已逐渐成为研究热点。脱细胞组织的细胞外基质支架材料是在有效去除天然组织中具有免疫原性的细胞成分的基础上，最大限度地保留了其天然发生的内部三维支架结构以及结构中的结构蛋白成分(包括胶原蛋白、弹性蛋白等)、特殊蛋白成分(包括纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)、蛋白聚糖成分(包括糖胺多糖、硫酸肝素、软骨素)和各种各样的生长因子成分，这些组织特有的内部结构和天然成分都是人工合成材料所无法完美复制的。

骨膜(periosteum)是紧密附着在骨组织表面的、由致密结缔组织构成的一薄层结缔组织纤维膜，具有丰富的血液供应和神经支配，在骨生长和改建过程中发挥重要的作用。它不仅是骨祖细胞和局部成骨因子的重要来源，而且是募集成骨细胞和相关生物因子的天然生物支架。由于骨膜与成骨作用之间存在十分密切的联系，越来越多的学者开始认识到其在骨组织工程研究中的重要价值。目前，大多数相关研究主要关注于如何探索出更先进的生物学材料制备方法，从而模拟出更接近于人体骨膜结构和功能的人工合成骨膜材料，而很少有研究关注天然骨膜组织本身。

目前为止，用于口腔引导骨再生屏障膜研究的脱细胞基质材料的组织来源包括人真皮组织、人羊膜组织、牛心包膜组织、猪心包膜组织、鱼皮组织，其中，只有真皮组织已投入临床应用，其余组织衍生的材料仍处于临床前基础研究阶段。另外，有研究报道，尽管组织衍生的脱细胞基质材料常用于非同源解剖位点的修复，位点同源的组织衍生的材料与之相比对组织的修复再生更具优势。基于以上，骨膜组织的细胞外基质材料相比于其他人工合成的骨膜组织工程材料以及其他组织来源的脱细胞基质材料，能够更好的替代自体骨膜组织。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种由羊小腿骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜及其制备方法，本发明通过将羊骨膜组织脱细胞处理后制备成细胞外基质膜材料，应用于口腔引导骨再生技术中发挥引导骨再生膜的作用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜，是将新鲜羊小腿骨的骨膜组织经脱细胞处理、样本消毒后制得的。

一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜羊小腿骨的骨膜组织；

(2)骨膜组织-80℃冷冻，再37℃解冻；上述冷冻-解冻为1次冻融循环，共进行3次；

(3)解冻后的骨膜组织用0.5％～2％(vol/vol)Triton X-100溶液处理4～24h；

(4)用0.05％～1％(vol/vol)SDS溶液处理3～6h；

(5)置入DNase和RNase的混合溶液，于37℃反应3～6h；

(6)用万古霉素、庆大霉素、头孢西丁和两性霉素B的混合溶液于37℃处理12～24h；

(7)用0.05％～1％(vol/vol)过氧乙酸溶液处理3～6h；

(8)用青霉素和链霉素的PBS溶液荡洗处理，共进行3次，每次不少于12h，得脱细胞骨膜样品；

(9)将羊脱细胞骨膜样品无菌分装，用钴60辐照法灭菌后在-80℃保存。

进一步地，本发明中步骤(3)(4)(5)中每一步试剂处理后，脱细胞样品均经过无菌PBS的充分荡洗。

所述的由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜在口腔引导骨再生材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1.本发明脱细胞方法能够有效地去除羊骨膜材料内的细胞成分，而且细胞外基质的主要组成成分——胶原和糖胺聚糖的结构、分布以及含量并没有受到显著的影响，脱细胞骨膜由于微观结构内部的孔隙较新鲜骨膜变大，使得脱细胞骨膜的吸水性增加，而弹性模量降低，但由于胶原的完整性没有受到破坏，所以脱细胞骨膜的最大屈服应力值没有显著的降低，其机械性能并没有受到显著的影响。

2.本发明羊脱细胞骨膜具有良好的生物相容性，不仅能促进小鼠MC3T3-E1细胞的黏附、增殖与成骨分化，在异种植入时，也并不会引发明显的免疫炎性反应。最重要的，可以在口腔引导骨再生技术中发挥有效的促进成骨的作用。

附图说明

图1为新鲜羊骨膜的剥离过程图。

图2为羊骨膜脱细胞前后大体观察图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。

图3为羊骨膜脱细胞前后HE染色图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。

图4为羊骨膜脱细胞前后扫描电镜观察图(A：新鲜羊骨膜；B:脱细胞羊骨膜)。

图5为脱细胞羊骨膜与新鲜羊骨膜的机械性能指标对比。

图6为扫描电镜观察小鼠MC3T3-E1细胞于脱细胞骨膜表面细胞黏附的过程图(A：6h；B：24h；C：48h。)。

图7为不同时间点时新鲜骨膜组和脱细胞骨膜组皮下植入局部HE染色图。

图8为兔颅骨引导骨再生手术过程图。

图9为不同时间点时各组Micro-CT的影像图。

图10为不同时间点时各组骨缺损边缘甲苯胺蓝染色图(A:对照组；B：单纯植骨组；C：单纯骨膜组；D:植骨+骨膜组)

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

实施例1多种哺乳动物骨膜对比试验。

分别解剖处理牛小腿、猪小腿、羊小腿和兔小腿，得骨膜材料，对上述4中材料进行对比，具体数据见下表。

表1多种哺乳动物骨膜对比数据表

经过解剖多种哺乳动物(牛、猪、羊、兔)骨膜对比，发现羊骨膜材料不仅来源丰富、解剖过程简单，且其厚度和机械性能更加适合被利用。羊小腿骨膜的厚度适中，与目前临床上应用的商品膜厚度相仿，更适合用在后续的口腔引导骨再生膜的制备过程，然而牛和猪小腿骨膜过厚，兔小腿骨膜厚度过薄；另外，从机械性能的角度分析，四种哺乳动物之间的综合机械性能：兔小腿骨膜＜羊小腿骨膜＜猪小腿骨膜＜牛小腿骨膜，兔小腿骨膜的强度过低，无法支持后续口腔引导骨再生膜的制备，而羊骨膜材料的机械性能检测结果(见图6)显示其完全能够满足口腔引导骨再生膜技术的需要。基于两者之间的平衡，选择羊小腿骨膜最为合适。

经过解剖多种哺乳动物(牛、猪、羊、兔)骨膜对比，发现羊小腿骨膜组织无论从厚度还是机械性能方面，都更加适用于口腔引导骨再生技术的应用。此外，羊小腿骨来源的骨膜从解剖学的角度更容易剥离与获取，且来源广泛。

实施例2脱细胞羊骨膜的制备方法和生物性能评价。

1.脱细胞羊骨膜具体步骤如下：

(1)获取新鲜羊小腿骨，逐层剥离表皮层、筋膜层后，完整暴露小腿骨表面骨膜层，应用手术刀在选定骨膜区域的四周切开骨膜，并应用骨膜剥离子小心剥离选区内完整的骨膜组织，如图1所示。

(2)将新鲜羊骨膜置于-80℃冷冻保存至少6h，而后置于37℃水浴锅中解冻约30min，上述两步为1次冻融循环，共进行3次。

(3)最后一次样品解冻后，将样品置于1％(vol/vol)的Triton X-100中，摇床匀速(100rpm)处理12h。

(4)将样品置于0.2％(wt/vol)的SDS溶液中，摇床匀速(100rpm)处理6h。

(5)将样品置于100U/mL的DNase和75μg/mL的RNase混合溶液中，于37℃水浴锅中反应6h。

(6)将样品置于50mg/L的万古霉素、8mg/L的庆大霉素、240mg/L的头孢西丁和25mg/L的两性霉素B的PBS混合溶液中，摇床在37℃条件下匀速(100rpm)处理24h。

(7)配置0.1％(vol/vol)过氧乙酸中性溶液(PH＝7.3)，将脱细胞骨膜材料转移至过氧乙酸溶液中后，摇床继续匀速(100rpm)处理3h。

(8)应用含有100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的PBS溶液进行充分荡洗(100rpm)，共进行3次，每次不少于12h，得到脱细胞羊骨膜材料，如图2所示。

(9)将脱细胞骨膜样品分装至无菌塑封袋内，塑封机严密封口后，应用钴60辐照法灭菌(剂量为15kGy)，并于-80℃冰箱长期保存。

2.脱细胞羊骨膜的HE染色观察。

石蜡切片的制备：(1)4％多聚甲醛中固定24h。(2)梯度酒精(50％30min，60％1min，75％4℃过夜,85％30min,95％30min,100％I 20min,100％II 20min)脱水。(3)二甲苯透明。(4)石蜡包埋。(5)应用石蜡切片机进行切片，切片的厚度为5μm。(6)展片、粘片和烘片。行HE染色。结果如图3所示。

3.脱细胞羊骨膜表面的扫描电镜观察。

应用2.5％的戊二醛溶液于4℃条件下固定新鲜羊骨膜和脱细胞羊骨膜24h。固定好后，应用PBS冲洗3次，每次5min。(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％I，100％II各15min),应用六甲基二硅氮烷处理后自然干燥，喷金后进行扫描电镜拍照。结果如图4所示。

4.机械力学性能分析。

将新鲜羊骨膜(n＝6)与脱细胞羊骨膜(n＝6)浸泡于37℃PBS中2h以使各组样品获得均衡的温度。将每组样品(1cm×5cm)的两头固定于力学设备的夹具上，全程保持样品的湿润。两头夹具的分离速度为10mm/min，样品牵拉力、形变长度以及耗费时长均记录于设备内置软件中。其中，最大屈服应力＝最大牵拉力/样品横截面积，破坏应变＝样品的拉伸位移/样品的初始总长度。应力应变曲线由Origin Pro 9.0绘制，弹性区间内的斜率值即为样品的弹性模量(λ＝应力/应变)。结果如图5所示。

5.脱细胞羊骨膜与小鼠MC3T3-E1成骨细胞前体细胞共培养。

将脱细胞骨膜剪裁成合适的大小以刚好覆盖满24孔板中一个孔的底面内，并保证脱细胞骨膜的骨面朝上。将铺好样品的24孔板重新封装好后，以15kGy剂量的钴60进行辐照消毒。将小鼠MC3T3-E1细胞按照1×10⁵个/cm²的密度接种于24孔板中的无菌脱细胞骨膜表面。分别于6h、24h、48h后，弃去各组细胞上清液，应用2.5％的戊二醛溶液将各组细胞于4℃条件下原位固定24h。固定好后，应用PBS冲洗3次，每次5min。随后依次进行乙醇梯度脱水(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％I，100％II各15min),应用六甲基二硅氮烷处理后自然干燥，喷金后于SEM下观察细胞于脱细胞骨膜表面的黏附过程。结果如图6所示。

6.大鼠背部植入实验。

随机将32只实验SD大鼠分为三组，分别是新鲜羊骨膜组和脱细胞羊骨膜组，每组20只。具体操作步骤如下：将两组材料消毒后剪裁为1cm×1cm大小备用。应用戊巴比妥钠(30mg/kg)将大鼠麻醉后进行备皮和术区消毒。在大鼠背部中线右侧，距离中线1.5-2cm位置做一1cm的竖直切口。从切口位置开始，从右向左地分离皮下粘膜，并将各组材料由右侧切口入，移植到大鼠背部正中皮下粘膜中，并使移植材料的右侧边缘与切缘之间的距离大于1cm，以排除局部切口炎症的干扰。切口严密缝合。术后于25℃室温下分笼饲养，并常规注射3天抗生素。分别于术后7、14、28、56天时，分别处死各组大鼠4只，扩大范围取出大鼠背部移植物，置于4％多聚甲醛溶液中固定标本24h。制作石蜡切片，并进行HE染色。结果如图7所示。

7.兔颅骨缺损引导骨再生实验。

由于口腔引导骨再生膜动物实验模型难度极高，通常采用与之相似度极高的动物颅骨缺损修复模型进行评价，进而为口腔引导骨再生膜临床应用提供实验基础。

于兔臀大肌肌肉注射鹿眠宁(0.2mL/kg)，待动物肌肉松软后，再进行3％戊巴比妥钠静脉注射(30mg/kg)。用理发器剔除兔颅骨外侧术区(从双眼间至双耳根之间)的兔毛，备皮，俯卧位固定四肢，对术区进行碘伏消毒、铺巾后，局部浸润注射2％利多卡因。于颅骨顶部正中行直线形切口直达骨面，应用骨膜剥离器剥离骨膜，暴露颅骨骨面。应用环钻于颅骨顶部正中依次制备4个8mm直径的圆形骨缺损，全层骨厚度，全程保持4℃冷却的生理盐水冲洗降温，以避免热灼伤导致的骨坏死的发生。将从缺损处取下的骨块放入骨研磨器中，制备成足够细小的自体骨颗粒材料。将4处骨缺损随机分为4组：(1)对照组(Control组)：骨缺损位置不做任何处理；(2)单纯脱细胞骨膜组(Periosteum组，简称P组)：骨缺损处不进行植骨，直接覆盖脱细胞骨膜材料；(3)单纯自体骨颗粒组(Bone组，简称B组)：骨缺损处单纯植入制备好的自体骨颗粒，而并不覆盖脱细胞骨膜材料；(4)自体骨颗粒+脱细胞骨膜组(Bone+Periosteum组，简称B+P组)：在骨缺损处植入自体骨颗粒的同时，于自体骨颗粒表面覆盖脱细胞骨膜材料(如图8所示)。各组移植完成后，逐层缝合皮下粘膜层与表皮层。术后连续3日给予20万单位青霉素钠于臀大肌进行肌肉注射，一日两次，以预防术后感染。分别于4、8、12周时间点时过量麻醉处死6只实验兔，颅骨外侧局部备皮、分离软组织，应用锯条扩大范围取下包含有4处骨缺损区域的颅骨组织。样本经4％多聚甲醛固定2天后，利用micro-CT对组织进行扫描并观察，结果如图9所示。制作硬组织切片，行甲苯胺蓝染色，结果如图10所示。

通过上述实验可以看出，本发明制备出的由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔引导骨再生膜，有效地去除羊骨膜材料内的细胞成分，保留了细胞外基质的主要组成成分，脱细胞骨膜的机械性能并没有受到显著的影响；同时本发明制备出的羊脱细胞骨膜具有良好的生物相容性，能促进小鼠MC3T3-E1细胞的黏附、增殖与成骨分化，在异种植入时，也不会引发明显的免疫炎性反应。基于上述分析，本发明制备出的再生膜，在兔颅骨缺损引导骨再生实验体现出良好的性能，能显著发挥促进成骨的作用，为其在口腔引导骨再生技术中发挥有效促进成骨作用、作为口腔引导骨再生材料提供了依据。

Claims (1)

1.一种由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜，其特征在于，所述由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜是将新鲜羊小腿骨的骨膜组织经脱细胞处理、样本消毒后制得的；所述由羊骨膜脱细胞基质制备的口腔骨引导再生膜的制备方法包括以下步骤：

（1）取新鲜羊小腿骨候选区内完整的骨膜组织；

（2）骨膜组织-80℃冷冻至少6h，再37℃解冻30min；上述冷冻-解冻为1次冻融循环，共进行3次；

（3）解冻后的骨膜组织用体积比为0.5%~2%的Triton X-100溶液处理4~24h；

（4）用体积比为0.05%~1%的SDS溶液处理3~6h；

（5）置入100U/mL的DNase和75μg/mL的RNase的混合溶液，于37℃反应3~6h；

（6）用50mg/L的万古霉素、8 mg/L的庆大霉素、240mg/L的头孢西丁和25mg/L的两性霉素B的PBS混合溶液于37℃处理12~24h；

（7）用体积比为0.05%~1%且pH=7.3的过氧乙酸溶液处理3~6h；

（8）用100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的PBS溶液荡洗处理，共进行3次，每次不少于12h，得脱细胞骨膜样品；

（9）将羊脱细胞骨膜样品无菌分装，用钴60辐照法灭菌后在-80℃保存。

Images