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CN110357817B - 一类可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一类可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110357817B
CN110357817B CN201910713163.7A CN201910713163A CN110357817B CN 110357817 B CN110357817 B CN 110357817B CN 201910713163 A CN201910713163 A CN 201910713163A CN 110357817 B CN110357817 B CN 110357817B
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Abstract

本发明公开了一类可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针及其制备方法和应用，该方法包括将4‑溴‑1,8‑萘酐与胺在乙醇中回流3.5h后得到N‑R1‑4‑溴‑1,8‑萘酰亚胺，然后，在氮气保护条件下，N‑R1‑4‑溴‑1,8‑萘酰亚胺与胍在乙二醇甲醚在100℃条件下搅拌过夜得到可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针化合物，以1,8‑萘酰亚胺为荧光团，利用胍基与丙酮醛和乙二醛反应后形成可逆性的二羟基咪唑烷，激发态分子内电荷转移效应增加，从而产生强烈荧光。因此本发明的荧光探针可以快速、可逆性的检测丙酮醛和乙二醛。

Description

一类可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及有机合成与分析化学技术领域，尤其涉及一类可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
活性羰基化合物，例如甲醛、乙醛、丙酮醛、乙二醛、丙烯醛等，在生命系统中发挥着重要的作用。由于这些化合物与脱氧核糖核酸、蛋白质的高反应活性，所以这些活性羰基化合物和糖尿病、癌症、肥胖症、阿尔兹海默症、衰老等其他慢性疾病的发生和发展有关。其中丙酮醛和乙二醛，作为活性羰基化合物，能够诱导晚期糖基化终产物。
丙酮醛主要通过和赖氨酸，精氨酸，半胱氨酸残基反应产生糖基化终产物，这一反应过程主要影响不同的蛋白质，比如胰岛素、血红蛋白和生长因子，还可以对DNA造成损害，从而导致细胞毒性。据报道，正常人体血清中丙酮醛的含量为0.4-1.0μM，而糖尿病病人血清中可达到2.2-3.8μM(AnalyticalLetters.2006,39(10):2205-2215.)。为了能够更好地了解这些活性羰基化合物在生理和病理条件下的功能，需要发展选择性检测和监测生物样品中的活性羰基化合物水平的方法。检测丙酮醛大多数是邻苯二胺和丙酮醛反应生成稳定的基团，例如HPLC，LC-MS，GC-MS都基于这种原理用来检测丙酮醛。然而，这些检测方法都需要对细胞进行裂解，不适合在复杂的生命系统中应用。而荧光检测由于其简单、灵敏、具有生物相容性，可以检测生命系统中的分析物，从而受到了广泛的关注。
目前为止，荧光检测丙酮醛都是以邻苯二胺作为检测基团，与丙酮醛不可逆反应后产生荧光，这种方法在选择性和反应速度和动态检测方面都存在缺点。因此，发展一个新的检测丙酮醛的基团是有必要的而且是富有挑战的工作。
发明内容
本发明以1,8-萘酰亚胺为荧光团，利用胍基与丙酮醛和乙二醛反应后形成可逆性的二羟基咪唑烷，ICT效应增加，从而产生强烈荧光。因此本发明的荧光探针可以快速、可逆性的检测丙酮醛和乙二醛。
为了实现本发明的主要目的，本发明提供：
一种可逆性检测丙酮醛和乙二醛的荧光探针，所述荧光探针具有如下通式I或通式II或通式III：
Figure BDA0002154474060000011
其中，R1，R2均为烷基；n为自然数1、2或3。
作为优选，所述R1，R2均为各自独立的甲基、乙基、丙基。
作为优选，所述式I为下列式I-1：
Figure BDA0002154474060000021
作为优选，所述式II为下列式II-1：
Figure BDA0002154474060000022
作为优选，所述式III为下列式III-1：
Figure BDA0002154474060000023
上述通式I所示的荧光探针的方法由以下路线合成：
Figure BDA0002154474060000031
该方法包括将4-溴-1,8-萘酐与胺在乙醇中回流3.5h后得到N-R1-4-溴-1,8-萘酰亚胺，然后，在氮气保护条件下，N-R1-4-溴-1,8-萘酰亚胺与胍在乙二醇甲醚在100℃条件下搅拌过夜得到可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针化合物。
其中，4-溴-1,8-萘酐与胺的摩尔比为1:5，得到中间体N-R1-4-溴-1,8-萘酰亚胺与胍的摩尔比为1:5。
上述通式II所示的荧光探针的方法由以下路线合成：
Figure BDA0002154474060000032
该方法包括在氮气保护条件下，将N-R2-4-溴-1,8-萘酰亚胺与甲胍在乙二醇甲醚在100℃条件下搅拌过夜得到可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针化合物，其中，N-R2-4-溴-1,8-萘酰亚胺与甲胍的摩尔比为1:5。
上述通式III所示的荧光探针的方法法由以下路线合成：
Figure BDA0002154474060000033
该方法包括在氮气保护条件下，化合物1与胍在乙二醇甲醚在100℃条件下搅拌过夜得到可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针化合物，其中，所述化合物1与胍的摩尔比为1:5。作为优选，本发明还公开了由上述方法制得的荧光探针在检测溶液、细胞或生物体内丙酮醛和乙二醛中的应用。
本发明所述可逆性检测丙酮醛和乙二醛荧光探针，使探针与丙酮醛或乙二醛结合后,ICT效应大大增加，导致荧光强度增加。识别反应如下：
Figure BDA0002154474060000041
荧光探针：在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子；与核酸(DNA或RNA)、蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。
与现有技术相比，本发明具有的有益技术效果：
(1)可逆性，可逆性检测丙酮醛和乙二醛的荧光探针，实现了细胞内和血清中快速可逆性检测丙酮醛和乙二醛的水平；
(2)灵敏度高，发明的荧光探针可以选择性与丙酮醛和乙二醛快速发生特异性反应，生成具有强荧光的产物，相较于常见的其他醛类、氨基酸和金属离子，本发明的荧光探针对于丙酮醛和乙二醛表现出了较高的选择性和灵敏性；
(3)反应时间快，本发明的荧光探针与丙酮醛和乙二醛的反应在室温条件下基本在15min内即可产生具有强荧光的产物；
(4)应用广泛，潜力大，该探针具有良好的光学稳定性以及特异性响应丙酮醛和乙二醛，可用于糖尿病模型动物血清中丙酮醛和乙二醛水平的检测，具有潜在的实际应用价值；
(5)制备优势显著，荧光探针制备方法简单，产率较高。
附图说明
图1是探针I-1的核磁共振氢谱；
图2是探针II-1的核磁共振氢谱；
图3是探针III-1的核磁共振氢谱；
图4是探针I-1的质谱；
图5是探针II-1的质谱；
图6是探针III-1的质谱；
图7是探针I-1随不同浓度的丙酮醛作用的荧光变化；
图8是探针I-1随不同浓度的乙二醛作用的荧光变化；
图9是探针I-1与丙酮醛作用随时间的荧光变化；
图10是探针I-1与乙二醛作用随时间的荧光变化；
图11是探针I-1与丙酮醛反应可逆性研究；
图12是探针I-1与乙二醛反应可逆性研究；
图13是探针I-1的选择性研究；
图14是探针II-1随不同浓度的丙酮醛作用的荧光变化；
图15是探针II-1的选择性研究；
图16是探针I-1与丙酮醛和乙二醛的共定位荧光成像。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应理解，下述说明仅是为了用于说明本发明，并不对发明内容进行限定。
实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
实施例1
荧光探针Ⅰ-1的合成：
Figure BDA0002154474060000051
将4-溴-1,8-萘酐(1.1g,4mmol)混悬于10mL乙醇中，滴加正丙胺(1.18g,20mmol)，加热回流反应3.5h。放至室温，过滤，用乙醇洗三次，滤饼烘干，得到产物，N-丙基-4-溴-1,8-萘酰亚胺为淡黄色固体(1.02g,80.5％)。在氮气的保护下，将化合物N-丙基-4-溴-1,8-萘酰亚胺(382mg,1.2mmol)混悬于5mL乙二醇甲醚，再将胍(355mg,6mmol)溶于3mL乙二醇甲醚中，在室温下，缓慢将胍的乙二醇甲醚溶液滴加入N-丙基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的混悬液中。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。加入乙酸乙酯、水进行萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，经过柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1，体积比)得到化合物I-1(138mg，39％)，为橙红色固体。
化合物I-1的核磁共振氢谱和高分辨质谱的结构表征如图1及图4所示。其中，核磁共振氢谱数据：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.56(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),8.44(dd,J＝7.4,1.1Hz,1H),8.32(d,J＝8.2Hz,1H),7.72(dd,J＝8.2,7.4Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),6.70(bs,4H),4.00(m,2H),1.63(h,J＝7.4Hz,2H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H)；
高分辨质谱(ESI-HRMS):m/z按照分子式C16H17N4O2计算的[M+H]+峰的理论值为297.1346实测值为297.1353。
实施例2
荧光探针II-1的合成：
Figure BDA0002154474060000061
在氮气的保护下，将化合物N-丙基-4-溴-1,8-萘酰亚胺(100mg,0.314mmol)混悬于1mL乙二醇甲醚，再将甲胍(115mg,1.57mmol)溶于1mL乙二醇甲醚中，在室温下，缓慢将甲胍的乙二醇甲醚溶液滴加入N-丙基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的混悬液中。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。加入乙酸乙酯、水进行萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，经过柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1，体积比)得到化合物II-1(27mg,28％)，为橙红色固体。
化合物II-1的核磁共振氢谱和高分辨质谱的结构表征如图2及图5所示：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),8.40(dd,J＝7.4,1.2Hz,1H),8.24(d,J＝8.3Hz,1H),7.62(dd,J＝8.2,7.4Hz,1H),7.08(d,J＝8.3Hz,1H),6.41(bs,1H),6.07(bs,2H),3.99(m,2H),2.82(s,3H),1.62(h,J＝7.4Hz,2H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H)；
高分辨质谱(ESI-HRMS):m/z按照分子式C17H19N4O2计算的[M+H]+峰的理论值为311.1503实测值为311.1510。
实施例3
荧光探针III-1的合成：
Figure BDA0002154474060000062
在氮气的保护下，将化合物a(947mg,2mmol)混悬于15mL乙二醇甲醚，再将胍(591mg,10mmol)溶于3mL乙二醇甲醚中，在室温下，缓慢将胍的乙二醇甲醚溶液滴加入a的混悬液中。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。加入乙酸乙酯、水进行萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，经过柱层析(二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝200:20:1)得到化合物III-1(160mg,18％)，为橙红色固体。
化合物III-1结构表征如图3及图6所示：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),8.36(dd,J＝7.3,1.2Hz,1H),8.22(d,J＝8.3Hz,1H),7.72(bs,1H),7.64–7.59(m,3H),7.26(d,J＝8.1Hz,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,1H),6.17(bs,4H),4.09(t,J＝6.7Hz,2H),3.03(bs,2H),2.28(s,3H)；
高分辨质谱(ESI-HRMS)：m/z按照分子式C22H22N5O4S计算的[M+H]+峰的理论值为452.1387实测值为452.1393。
实施例4
荧光探针I-1与不同浓度丙酮醛和乙二醛反应的荧光光谱变化
取实施例1中制备的荧光探针I-1溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成浓度为1mM的荧光探针母液；将质量分数为40％的丙酮醛溶液加入到蒸馏水中，制成浓度为10mM和100mM的丙酮醛母液；将8.8M乙二醛溶液加入到蒸馏水中，成浓度为10M和100M的乙二醛母液。根据荧光探针和丙酮醛/乙二醛的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取6μL荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入不同浓度的丙酮醛/丙酮醛母液(0–500μM)，配置成探针浓度为2μM的测试溶液共3mL。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试荧光探针I-1与不同浓度丙酮醛/乙二醛反应的荧光光谱变化(激发波长为425nm)。荧光光谱变化如图7和图8所示。可见随着丙酮醛/乙二醛浓度的逐渐增加，探针溶液在564nm处的荧光峰值逐渐增强。
实施例5
荧光探针I-1与丙酮醛和乙二醛反应随时间变化的荧光谱图变化
根据荧光探针和丙酮醛/乙二醛的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取6μL实施例1中的荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入60μL(10mM)丙酮醛/乙二醛母液，配制成探针浓度为2μM，丙酮醛/乙二醛浓度为200μM的测试溶液共3mL。用425nm作激发波长，测试其随时间变化的荧光谱图变化。如图9和10所示，随着时间增加，564nm处荧光峰值逐渐增强。
实施例6
荧光探针Ⅰ-1与丙酮醛和乙二醛的可逆性研究。
根据荧光探针和丙酮醛/乙二醛的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取氨基胍(AG)110mg到水溶液中配置成10mM和100mM的母液。取6μL实施例1中的荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入60μL(10mM)丙酮醛/丙酮醛母液，配制成探针浓度为2μM，再加入不同浓度氨基胍盐酸盐(150μM-1mM)的测试溶液共3mL。其中以氨基胍为抑制剂。用425nm作激发波长，测试其随抑制剂浓度不同的荧光谱图变化，如图11和12，可发现加入抑制剂后，不论母液是丙酮醛还是乙二醛，564nm处荧光强度确实降低，并且随着抑制剂浓度的增加而降低的幅度加大。
实施例7
探针I-1对不同干扰分析物的选择性研究
根据荧光探针和不同干扰分析物的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取6μL实施例2中的荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入200μM的不同分析物：甲醛、水杨醛、苯甲醛、三光气、一氧化氮给体NOC-18、丙酮醛、乙二醛。配制成探针浓度为2μM，不同干扰分析物浓度为200μM的测试溶液共3mL，同时留一个只加探针的空白测试样品。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试不同样品的564nm处荧光发射强度(激发波长为425nm)。如图13所示，相对于空白测试溶液，丙酮醛和乙二醛的测试溶液的荧光发生了明显上升，而其他分析物的荧光增强不多。实验结果说明荧光探针I-1对于丙酮醛和乙二醛具有良好的选择性。
实施例8探针II-1不同浓度丙酮醛的荧光光谱变化
取实施例2中制备的荧光探针II-1溶于DMSO中，制成浓度为1mM的荧光探针II母液；根据荧光探针和丙酮醛的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取6μL荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入不同浓度的丙酮醛母液(0–1200μM)，配置成探针浓度为2μM的测试溶液共3mL。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试荧光探针II-1与不同浓度丙酮醛反应的荧光光谱变化(激发波长为391nm)。荧光光谱变化如图14所示。可见随着丙酮醛浓度的逐渐增加，探针溶液在564nm处的荧光峰值逐渐增强。
实施例8
探针II-1对不同干扰分析物的选择性研究
根据荧光探针和不同干扰分析物的浓度计算好所需的PBS水溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取6μL实施例2中的荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入400μM的不同分析物：为甲醛、丙酮醛、乙醛、乙二醛、邻苯二甲醛、乙醛酸、苯甲醛、谷胱甘肽、葡萄糖、半胱氨酸、过氧化氢、钾离子、钙离子、钠离子、铜离子、锌离子、铝离子，配制成探针浓度为2μM，不同干扰分析物浓度为400μM的测试溶液共3mL，同时留一个只加探针的空白测试样品。反应60分钟后，用荧光光谱仪测试不同样品的564nm处荧光发射强度(激发波长为391nm)。如图15所示，相对于空白测试溶液，丙酮醛和甲醛的测试溶液的荧光发生了明显上升，而其他分析物的荧光增强不多。实验结果说明荧光探针II-1对于丙酮醛和乙二醛具有良好的选择性。
实施例9
探针I-1与HeLa细胞中丙酮醛和乙二醛的共定位荧光成像
将HeLa细胞接种于含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的DMEM培养基(含有酚红，Gibco/Invitrogen)的T-25细胞培养瓶中，37℃下48小时。在实验前一天，将细胞转移到3个Nunc35mm玻璃底细胞培养皿(ThermoScientific)中以使细胞粘附。将探针I-1在PBS缓冲液中稀释，并以5μM的终浓度加入细胞培养基中。在37℃下在细胞培养箱中孵育1小时后，除去含有探针I-1的培养基。用PBS缓冲液洗涤两次后，将含有20μM丙酮醛或乙二醛的细胞培养基加入丙酮醛和乙二醛培养皿中。向对照(仅探针培养皿)中加入相同量的新鲜培养基。在37℃下在细胞培养箱中孵育30分钟后，将细胞在配备有40×物镜并且光电倍增管增益为800(激发和发射波长为λex/em＝405/530-590nm)的LeicaTCSSP8上成像。在第一次成像步骤后，将5mM乙酰半胱氨酸加入丙酮醛和乙二醛培养皿的细胞培养基中。然后将细胞在37℃下在细胞培养箱中孵育另外30分钟。在孵育结束时，在配备有40×物镜并且光电倍增管增益为800(激发和发射波长为λex/em＝405/530-590nm)的LeicaTCSSP8上再次捕获细胞图像。如图16所示，第一组没有荧光，第二组和第四组有明显荧光，第三组和第五组比第二组和第五组荧光性减弱。实验结果说明荧光探针Ⅰ-1可以可逆性对HeLa细胞内的丙酮醛和乙二醛进行荧光成像。
以上实施例，只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明专利申请范围内。

Claims (6)

1.一种可逆性检测丙酮醛和乙二醛的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如下I-1或II-1结构：
Figure 265301DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种制备化合物I所示的荧光探针的方法，其特征在于，该方法由以下路线合成：
Figure 526649DEST_PATH_IMAGE003
其中R1-NH2为正丙胺。
3.一种制备权利要求1中化合物II-1所示的荧光探针的方法，其特征在于，该方法由以下路线合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括将1.1g ,4mmol的4-溴-1 ,8-萘酐混悬于10mL乙醇中，滴加1.18g ,20mmol的正丙胺，加热回流反应3.5h；放至室温，过滤，用乙醇洗三次，滤饼烘干，得到1.02g的产物N-丙基-4-溴-1, 8-萘酰亚胺；在氮气的保护下，将382mg ,1.2mmol的化合物N-丙基-4-溴-1 ,8-萘酰亚胺混悬于5mL乙二醇甲醚，再将355mg ,6mmol的胍溶于3mL乙二醇甲醚中，在室温下，缓慢将胍的乙二醇甲醚溶液滴加入N-丙基-4-溴-1 ,8-萘酰亚胺的混悬液中；将反应混合物在100℃下搅拌过夜；加入乙酸乙酯、水进行萃取；有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，经过柱层析,其中，柱层析洗脱液为体积比为10:1的二氯甲烷：甲醇，得到138mg化合物I。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括，在氮气的保护下，将100mg ,0.314mmol的化合物N-丙基-4-溴-1 ,8-萘酰亚胺混悬于1mL乙二醇甲醚，再将115mg ,1.57mmol的甲胍溶于1mL乙二醇甲醚中，在室温下，缓慢将甲胍的乙二醇甲醚溶液滴加入N-丙基-4-溴-1 ,8-萘酰亚胺的混悬液中；将反应混合物在100℃下搅拌过夜；加入乙酸乙酯、水进行萃取；有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，经过柱层析，其中，柱层析洗脱液为体积比为10:1的二氯甲烷：甲醇，即得到27mg化合物II-1。
6.一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体内丙酮醛和乙二醛的荧光探针中的应用。
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