CN110354303A - 一种金属钛表面的抗菌修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金属钛表面的抗菌修饰方法。包括：(1)金属钛颗粒依次用去离子水，乙醇，丙酮，去离子水超声清洗，烘干待用；(2)配制γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液，溶剂为乙醇和水；放入金属钛颗粒，水浴加热50‑55℃，反应5‑6h，加入三乙胺，反应10‑12h，取出，洗涤，干燥，烘干；(3)将多肽接枝到表面氨基化的金属钛上。本发明通过共价接枝的方法，以金属钛作为基底材料进行改性，将抑菌肽接入金属钛表面，从而达到表面改性抑菌的目的。

Description

一种金属钛表面的抗菌修饰方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，进一步地说，是涉及一种金属钛表面的抗菌修饰方法。

背景技术

1.骨科植入体引起的感染

植入物感染是骨科手术如关节置换术(TJA)最严重的病发症之一。文献报道，骨折内固定与人工关节置换后的感染率分别为5％～20％和0.5％～2％，且有大于20％的复杂关节翻修术是由于TJA术后感染所致。相对于其他术野周围组织感染，TJA术后感染后果更加严重，经常需要移除假体，旷置关节，二期翻修，甚至融合关节，截肢，造成残疾。对病人来说，不仅造成了大量的医疗负担，延长了病人的痛苦，而且扩大了发病率，甚至导致死亡。

预防TJA术后感染最常用的方法是术后系统性口服或注射抗生素,但局部浓度较低,还容易导致细菌耐药性问题。临床治疗的方案有清创术、一期置换、二期置换、长期口服抗生素、多次翻修治疗无效者甚至需要截肢。其中二期置换是最常用的治疗办法,需要先移除感染假体,然后经过4-8周甚至更长时间的抗生素治疗后,再植入新的假体。且术后还常需持续抗生素治疗6个月左右。但即便是二次置换后的感染再发生率仍然高达3.2-5.6％。

2.TJA术后感染主要原因－细菌生物膜

近年来大量的研究证实，植入物感染与植入材料表面形成细菌生物膜有关。细菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白及脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成大量细菌聚集膜样物。

生长于BF中的细菌,无论其形态结构、生理生化特性及对抗菌药物的敏感性等都与浮游生长的细胞显著不同,致病特点也不同。BF可以保护细菌逃逸宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用。当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强10～1000倍，对抗浮游细菌的抗生素剂量不但无法有效清除BF,还可诱导耐药性产生。成熟的BF内在的调节机制可使部分细菌从BF中脱落,脱落的细菌如粘附到合适的表面将形成新的BF,造成感染的迁移。研究结果证明:人工关节假体周围发生感染及相关感染迁延不愈的主要原因与细菌在假体表面细菌生物膜的形成有关。术中细菌的污染或术后血源性细菌都易于在假体周围定植并逐渐形成成熟的BF。

3.表面改性方法

抗生素是临床应用最为广泛、抑菌机理最为明确且体内抑菌效果已经得到长期临床验证的抑菌剂。临床治疗中对各类抗生素的最小抑菌浓度及安全用药量都有明确规定。针对性口服或注射抗生素是目前预防及治疗植入物术后感染的普遍方法。然而,全身给药往往存在病灶处浓度过低,对其它组织器官存在潜在毒性的风险。因此,局部使用抗生素得到了广泛的关注。早在1970年,抗生素就被引入骨水泥从而达到局部抑制TJA术后感染的目的。长期临床效果已经充分验证抗生素骨水泥能够有效降低关节翻修率、假体松动及深度感染。但由于骨水泥型关节假体的安装及翻修较非骨水泥型假体复杂,有逐步被取代的趋势。因此对于表面加载抗生素的抑菌型关节假体的研究就越来越受重视。

3.1涂层法

涂层法是表面加载抗生素的常用方法。涂层可以分为被动的(passive)和主动的(active)，主要取决于是否有抗菌剂(antibacterial agents)在植入部位释放出。被动的涂层不会向周围的组织释放抗菌剂，这种涂层主要通过接触来阻碍细菌粘附以及杀死细菌。相比而言，主动的涂层会释放出接枝在表面的杀菌剂抑制感染，例如antibiotics,antiseptics,silver ions,growth factors/chemokines/peptides.

3.1.1抗粘连涂层(Coatings That Prevent Bacterial Adhesion)

研究表明，控制表面的疏水性，表面的粗糙程度，电性能和表面相容性可以有效的减少细菌的接触。细菌接触植入物表面是通过吸附蛋白质层来实现的，也就是说，表面如果不吸附细菌，也不会吸附蛋白质，因此，这种表面既可以防止细菌生物膜的产生又可以防止微生物的黏附。

聚乙二醇(PEG)被广泛的应用到生物医学领域。由于PEG分子结构的特性，PEG分子具有链柔性和很大的空间位阻，这就是PEG可以阻止细菌接触表面的原因。Park等研究发现了一种PEG修饰的聚亚安酯。PEG分子末端带有的基，氨基和磺酸基团可以有效的防止大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S.epider-midis)的黏附。他们测试了细菌在不同介质中对材料的黏附力，如胰蛋白冻大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)和人体血浆，结果发现，细菌是否能接触材料取决于介质，接触的过程和PEG的分子量。通常，高分子量的PEG抵抗细菌接触的效果比低分子量的更好，此外，表面终端带有磺酸盐基团对抵御细菌的接触更为有效。

对植入体表面物理化学性能的调节是制止细菌繁殖的一种相对简单和经济的方式。例如，利用紫外(UV)射线可以导致二氧化钛表面“自发”润湿性的增加，这种方式不仅能阻止细菌在材料表面粘附，而且也不会影响到在钛合金表面的骨组织再生。也可以通过在表面氧化膜上接枝结晶结构来达到细菌防粘连的效果。有研究表明，通过在钛氧化膜表面接枝锐钛矿形式的结晶结构，很明显能够减少细菌粘附，同时也没有影响到宿主细胞的新陈代谢行为。

3.1.2抗菌涂层(Microbicidal Coatings)

抗菌涂层主要包括银释放涂层(Silver-Releasing Coatings)、抗生素或抗菌涂层(Antibiotic or Antiseptic-Releasing Coatings)、聚阳离子涂层(Polycation-BasedCoatings)、纳米粒子涂层(Nanomaterials)、酶基抗菌涂层(Enzyme-Based AntimicrobialCoatings)等。现在应用最广泛的是抗生素涂层。预防系统的抗生素(antibiotics)通常用于植入骨科设备的病人，为了预防在围术期(peri-operative)发生的感染。然而，这种类型的抗生素有很多缺点，包括在靶向部位低的血药浓度，以及可能造成系统或者是器官的毒性。因此，局部使用抗生素的到了人们的关注。

临床研究表明，在骨水泥中加载抗生素可以降低由于巩固全髋置换术引起的深度感染的可能，早在1970年,抗生素就被引入骨水泥从而达到局部抑制TJA术后感染的目的。长期临床效果已经充分验证抗生素骨水泥能够有效降低关节翻修率、假体松动及深度感染。但由于骨水泥型关节假体的安装及翻修较非骨水泥型假体复杂,有逐步被取代的趋势。

磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cements)，被普遍认为具有骨引导作用，已经被用于加载抗生素和其他生物活性分子。除钙磷酸盐外,可降解聚合物材料(如PDLLA,壳聚糖,环糊精等)也被广泛用于钛合金植入物表面载抗生素涂层的研究。然而目前钛合金表面涂层法加载抗生素的最大问题就是无法保证长期且有效浓度释放。已经报道的各类抗生素涂层的药物释放时间为几个小时至4周不等,且在释放初期都有一个突释阶段,一般在很短的时间内药物释放量都会达到70％以上,而突释过后的药物释放量又很难达到最小抑菌浓度,据报道长期小于最小抑菌浓度的释放会引发耐药性的风险。即便采用LBL多层自组装加载药物等先进涂层技术,也很难将释放时间延长至4周以上[1，2]。最理想的抗生素传送涂层应该在最佳的细菌浓度水平时释放抗生素达到足够长的时间以预防潜在的感染的可能，并且之后抗生素的释放应该能快速的停止，以消除抗生素残留的风险。

由于考虑到抗生素残留所造成的大风险，在涂层中加载非抗生素试剂成了一个不错的选择。在各种不同的掺杂物中，由于银能抑制细菌粘附，能抵抗大多数的细菌(革兰氏阴性和阳性菌)，以及长期持久的抗菌作用，以及不易残留的特性使得银成为最为熟知的抗菌试剂。Christian Gorzelanny等用银纳米粒子复合了类金刚石碳(diamond-likecarbon，DLC)并且研究了这种复合材料的抗菌性能和银纳米粒子的释放速率。实验表明，在对银－高分子纳米复合材料进行等离子体浸入离子注入以后，提高了DLC和植入体表面的键能，减少了因脆性引起的分层，进而提高了DLC在植入体表面的附着力。此外，他们还证实了用银纳米粒子复合的DLC涂层确实可以阻止细菌的黏附和繁殖，这种抗菌作用是通过银的瞬时释放来实现的，早期的银的释放是突发性的，浓度很高，并以此来阻止细菌的生长。当银突发性释放进入尾声的时候，低浓度的银纳米粒子减少了凝血细胞在内皮细胞上的生长，细胞的繁殖和分化导致了血管化，进而使植入体和骨组织更好的融合。虽然银具有极佳的抗菌能力，但是我们还需要了解其长期植入后的长期的组织毒性，以及其潜在的采集电阻的能力，以及其抗细菌粘附和生长的确切的机制。

3.1.3其他涂层

一些有机的抗菌试剂，如chlorhexidine,chloroxylenol,polyhexamethylenebiguanide(双氯苯双胍己烷，氯间二甲苯酚，聚六亚甲基单胍磷酸盐)已经证明它们在抗菌方面的能力，同时可能成为避免细菌形成耐药性风险的一种有效的选择。在钛合金的表面，Chlorhexidine(双氯苯双胍己烷)可以吸附在TiO2涂层中，可以持续释放数天。其释放模式与抗生素负载的涂层相似，初始快速释放，之后缓慢并持续的释放。

一些生物活性分子，例如透明质酸，脱乙酰壳多糖，它们都具有防止细菌粘附和/或防止细菌增殖以及降低细菌活性的能力。尽管这些物质作为植入体涂层具有一定的吸引力，但是仍有不足，通过体内试验证明：与其他涂层例如磷酸钙相比，这些生物活性分子膜在支持骨整合方面并不理想。的确，有报告显示，在透明质酸分子链的作用下成骨细胞的粘附受到一定的限制。

[1]Lv H,Chen Z,Yang X,Cen L,Zhang X,Gao P.Layer-by-layer self-assembly of minocycline-loaded chitosan/alginate multilayer on titaniumsubstrates to inhibit biofilm formation.J Dent,2014,42(11):1464-72.

[2]Pérez-Anes A,Gargouri M,Laure W,Van Den Berghe H,Courcot E,Sobocinski J,Tabary N,Chai F,Blach JF,Addad A,Woisel P,Douroumis D,Martel B,Blanchemain N,Lyskawa J.Bioinspired Titanium Drug Eluting Platforms Based ona Poly-β-cyclodextrin-Chitosan Layer-by-Layer Self-Assembly TargetingInfections.ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(23):12882-93

由于相对较短的释放趋势，生物活性分子的可控释放涂层，其导致的病原抗性有潜在的可能，越来越多的研究致力于通过共价键的作用将抗微生物的多肽加载到植入体的表面，可以达到长期预防植入体感染的目的，与此同时，抗菌肽的组成均为氨基酸，在人体内可以被降解且对人体无害，未来医药的发展的热门方向即为抗菌肽。

现有技术利用NHS/EDC通过酰胺键将多肽连接在基体表面，连接效果不很理想，且生物相容性好。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种金属钛表面的抗菌修饰方法。本发明通过共价接枝的方法，以金属钛作为基底材料进行改性，将抑菌肽接入金属钛表面，从而达到表面改性抑菌的目的。

本发明的目的是提供一种金属钛表面的抗菌修饰方法。

所述方法包括：

(1)金属钛颗粒依次用去离子水，乙醇，丙酮，去离子水超声清洗，烘干待用；

(2)配制γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液，溶剂为乙醇和水；放入金属钛颗粒，水浴加热50-55℃，反应5-6h，加入三乙胺，反应10-12h，取出，洗涤，干燥，烘干；

(3)将多肽接枝到表面氨基化的金属钛上

将接枝好的金属钛颗粒放入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液中，溶剂为乙二胺四乙酸盐磷酸盐溶液；温育1-2h；再用乙二胺四乙酸磷盐酸盐溶液漂洗，风干，加入多肽溶液反应18-24h，漂洗，风干。

其中，优选：

金属钛颗粒的粒径范围为60-100目。

步骤(2)，

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液的体积浓度为1-2％；

溶剂中为乙醇与水的体积比为(90～95)：(10～5)。

三乙胺占整个溶液的体积比为0.5-1％。

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液和三乙胺的体积比为100：(0.4～0.5)；

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液与金属钛颗粒的用量比为：100ml:(0.5-1)g

步骤(3)，

多肽溶液的浓度为1-2mg/ml；

4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为1-2mg/ml。

步骤(3)，

乙二胺四乙酸盐磷酸盐溶液的浓度为40-50mmol/L。

步骤(3)，

多肽与接枝好的金属钛颗粒的质量比为1：(250～500)。

所述多肽为抗菌多肽，优选为Cys-Melimine，具体序列为C T L I S W I K N K RK Q R P R V S R R R R R R G G R R R R。

本发明中，KH550的-SiOH官能团可在水中或材料表面水中水解产生硅醇基，进而和金属钛表面的氧化钛薄膜反应,这个反应相对于先通过EDC活化羧基，羧基再和氨基反应生成酰胺键，反应效率更高，反应相对来说更容易。

附图说明

图1空白对照组的激光共聚焦显微镜图；

图2未改性材料组的激光共聚焦显微镜图；

图3实施例1制备的改性材料组的激光共聚焦显微镜图；

图4纯抑菌钛的激光共聚焦显微镜图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

1.使用到的化学产品

钛粉，60目，99.5％，Aladdin；乙醇，分析纯，沪试；丙酮，分析纯，沪试；多巴胺，99％，alfa aesar；TRIS，solarbio；KH550(3-氨丙基三氟氧基硅烷)，99％，Aladdin；TEA，多肽为Melimine，序列为Cys-Melimine(C T L I S W I K N K R K Q R P R V S R R R R RR G G R R R R)；sulfo-smcc,源叶科技；PBS，gelife；EDTA，98％，Aladdin；

2.产品的制备

1.选用金属钛的小颗粒，尺寸为60目，分别各用去离子水，乙醇，丙酮，去离子水超声清洗15min，烘干待用。

2.配制KH550，2％的溶液(溶剂为乙醇95％，水5％)，取100ml，放入0.5g金属钛小颗粒，水浴加热至55℃，反应6h，加入0.5ml TEA，反应12h，取出，用乙醇洗涤，真空干燥30min，再放入130℃烘箱中加热3h

3.将多肽接枝到表面氨基化的金属钛上：将接枝好KH550的金属钛0.5g放入2mg/ml的sulfo-SMCC/PBS-EDTA(50mM)溶液中温育1h，用PBS-EDTA漂洗，风干，加入多肽溶液2mg反应24h，漂洗，风干。

3.用途或使用效果

表1.金属钛表面改性后XPS数据(X射线光电子能谱仪(XPS)ESCALAB 250美国ThermoFisher Scientific公司)

表2.改性后金属钛的能谱(EDS)数据(原子百分比)；日本日立公司的HITACHIS-4700FESEM相连的美国EDAX公司生产EDAX-9100型X射线能谱仪

元素	Ti	Ti-kh550	Ti-Melimine
				C	3.10	3.39	10.29
O	--	24.90	46.24
				Si	--	0.27	0.20
Ti	96.90	64.60	53.08
				S	--	--	0.07

抑菌性能：

选用金黄色葡萄球菌进行培养，具体操作流程参见GB/T21866-2008，GB4789.2-2010。之后对分组培养的菌液进行活死菌荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察。

由表1可以看出，在经过KH550引入氨基后，体系中硅元素含量显著增加，其原因是由于KH550引入氨基是由硅氧键完成的，故体系里硅元素含量会增加；在引入Melimine抑菌肽之后，硫元素含量增加，其原因是由于在合成Melimine时，在其一端增加了一个半胱氨酸，使之一端带有巯基，从而可以通过sulfo-SMCC偶联剂，连接至金属钛基底上，故在加入Melimine之后，体系中硫元素会增多。同理，EDS测试结果解释同上。

抑菌试验采用激光共聚焦显微镜观察，用Live/Dead Baclight BacterialViability Kit荧光染色液。结果见图1-4，阳性空白对照组(C)和金属钛基底(图2)绝大多数细菌为活细菌，阴性对照组(纯抑菌钛Melimine)几乎不存在细菌，说明在加入Melimine初始，细菌即被杀死，进而不会再进行繁殖，故当将菌液稀释同等倍数之后，在显微镜下观察，几乎观察不到细菌，表面改性之后的金属钛(图3)，虽然还存在细菌，但是少很多，说明抑菌作用不是瞬间完成的，而是随着时间的延长逐渐释放，但是和空白对照相比，还是有一定的抑菌效果的。

说明：阳性空白对照是只培养细菌，阴性对照是只加抑菌肽的，未改性材料组是没有改性的材料的，不加任何处理的材料，改性材料组是实施例制备的材料。

根据培养基上的细菌数量也可以很明显的看出，改性后材料具备了一定的抑菌性能。

实施例2

1.使用到的化学产品

钛粉，100目，99.5％，Aladdin；乙醇，分析纯，沪试；丙酮，分析纯，沪试；多巴胺，99％，alfa aesar；TRIS，solarbio；KH550(3-氨丙基三氟氧基硅烷)，99％，Aladdin；TEA，多肽为Melimine，序列为Cys-Melimine(C T L I S W I K N K R K Q R P R V S R R R R RR G G R R R R)；sulfo-smcc,源叶科技；PBS，gelife；EDTA，98％，Aladdin；

2.产品的制备

1.选用金属钛的小颗粒，尺寸为100目，分别各用去离子水，乙醇，丙酮，去离子水超声清洗15min，烘干待用。

2.配制KH550，2％的溶液(溶剂为乙醇95％，水5％)，取100ml放入1g金属钛小颗粒，水浴加热至50℃，反应5h，加入0.4ml TEA，反应10h，取出，用乙醇洗涤，真空干燥30min，再放入130℃烘箱中加热3h

3.将多肽接枝到表面氨基化的金属钛上：将接枝好KH550的金属钛1g放入1mg/ml的sulfo-SMCC/PBS-EDTA(50mM)溶液中温育1.5h，用PBS-EDTA漂洗，风干，加入多肽溶液2mg反应18h，漂洗，风干。

表3金属钛表面改性后XPS数据(X射线光电子能谱仪(XPS)ESCALAB 250美国ThermoFisher Scientific公司)

Claims (8)

1.一种金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于所述方法包括：

(1)金属钛颗粒依次用去离子水，乙醇，丙酮，去离子水超声清洗，烘干待用；

(2)配制γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液，溶剂为乙醇和水；放入金属钛颗粒，水浴加热50-55℃，反应5-6h，加入三乙胺，反应10-12h，取出，洗涤，干燥，烘干；

(3)将多肽接枝到表面氨基化的金属钛上

将接枝好的金属钛颗粒放入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液中，溶剂为乙二胺四乙酸盐磷酸盐溶液；温育1-2h；再用乙二胺四乙酸磷盐酸盐溶液漂洗，风干，加入多肽溶液反应18-24h，漂洗，风干。

2.如权利要求1所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

金属钛颗粒的粒径范围为60-100目。

3.如权利要求1所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

步骤(2)，

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液的体积浓度为1-2％；

溶剂中为乙醇与水的体积比为(90～95)：(10～5)；

三乙胺占整个溶液的体积比为0.5-1％。

4.如权利要求3所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

步骤(2)，

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液和三乙胺的体积比为100：(0.4～0.5)；

γ―氨丙基三乙氧基硅烷溶液与金属钛颗粒的用量比为：100ml:(0.5-1)g。

5.如权利要求3所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

步骤(3)，

多肽溶液的浓度为1-2mg/ml；

4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为1-2mg/ml。

6.如权利要求5所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

步骤(3)，

乙二胺四乙酸盐磷酸盐溶液的浓度为40-50mmol/L。

7.如权利要求5所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

步骤(3)，

多肽与接枝好的金属钛颗粒的质量比为1：(250～500)。

8.如权利要求1所述的金属钛表面的抗菌修饰方法，其特征在于：

所述多肽为抗菌多肽。