CN110186735A - 一种含类细胞质人造细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种含类细胞质人造细胞的制备方法，本发明涉及人造细胞的制备方法。解决现有人造细胞内部几乎都是水溶液的问题。制备方法：一、制备类细胞质溶胶；二、清洗ITO玻璃电极；三、制备含类细胞质磷脂囊泡，得到含类细胞质人造细胞。本发明用于含类细胞质人造细胞的制备。
Description
技术领域
本发明涉及人造细胞的制备方法。
背景技术
目前以磷脂为主要原料制备人造细胞模型的研究已有报道，但是人造细胞内部几乎都是水溶液，而真正的细胞内部为具有粘度的胶体，而当前研究的细胞内部微反应不具有真实环境性，因此需要构建接近于真正细胞内部的液态环境，即具有粘度的胶体环境，为更真实研究细胞内部微反应奠定基础。
发明内容
本发明要解决现有人造细胞内部几乎都是水溶液的问题，而提供一种含类细胞质人造细胞的制备方法。
一种含类细胞质人造细胞的制备方法是按以下步骤进行：
一、制备类细胞质溶胶：
将琼脂糖和蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶，向琼脂糖-蔗糖混合溶胶中加入蒸馏水，并浸泡20min～30min，得到混合溶液，将混合溶液置于加热板上加热至混合溶液沸腾，然后停止加热，并在室温条件下静置至室温，得到类细胞质溶胶；
所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(4～7)；所述的琼脂糖-蔗糖混合溶胶的质量与蒸馏水的体积比为60mg:(1～1.2)mL；
二、清洗ITO玻璃电极：
将ITO玻璃电极浸渍于乙醇溶液中，超声波清洗10min～15min，再浸渍于蒸馏水中，超声波清洗10min～15min，最后氮气吹干，得到清洗后的ITO玻璃电极；
三、制备含类细胞质磷脂囊泡：
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，使用移液枪将浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液滴加到清洗后的ITO玻璃电极表面并涂抹均匀，且每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL～2μL的浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，在温度为30℃～40℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极，将聚四氟乙烯矩形框固定在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极中间，得到电形成装置，利用真空脂将电形成装置密封，且两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm～2.5mm，聚四氟乙烯矩形框与两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充类细胞质溶胶，在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为3V～6V，频率为100Hz～1000Hz，温度为30℃～60℃，时间控制为1h～3h，得到含类细胞质人造细胞。
本发明的有益效果是：
本发明以琼脂糖和蔗糖为主要原料配制琼脂糖-蔗糖混合溶胶，随着蔗糖在混合溶胶中比例的升高，琼脂糖-蔗糖混合溶胶的溶胶与凝胶之间转变温度降低至人体温度37℃附近，并且使用粘度计测量其粘度数值接近于人体细胞质粘度，具体为18cp～32cp，因此使用琼脂糖-蔗糖混合溶胶模拟细胞质环境，随后，使用细胞膜主要成分磷脂以电形成方法制备囊泡，以囊泡模拟细胞隔室，对细胞进行了多方面的构建模拟，并且将类细胞质即琼脂糖-蔗糖混合溶胶包裹在人造细胞中，同时通过调控交流电场的参数可以有效的制备出接近于真正细胞尺寸的人造细胞模型，具体为8μm～15μm。本发明将为原细胞探索研究及生命起源领域提供模型工具，该模型的构建实现了从细胞质到细胞膜的全面模拟研究，为进一步构建完整的细胞模型奠定了基础。
本发明用于一种含类细胞质人造细胞的制备方法。
附图说明
图1为不同比例类细胞质溶胶相转变温度对比图，a为对比实验一制备的类细胞质溶胶，b为对比实验二制备的类细胞质溶胶，c为对比实验三制备的类细胞质溶胶，d为实施例二制备的类细胞质溶胶，e为实施例一制备的类细胞质溶胶，f为实施例三制备的类细胞质溶胶，g为对比实验四制备的类细胞质溶胶，h为对比实验五制备的类细胞质溶胶，i为对比实验六制备的类细胞质溶胶，j为对比实验七制备的类细胞质溶胶；
图2为实施例一制备的含类细胞质人造细胞显微镜图片；
图3为不同比例类细胞质溶胶粘度数值对比图，a为对比实验一制备的类细胞质溶胶，b为对比实验二制备的类细胞质溶胶，c为对比实验三制备的类细胞质溶胶，d为实施例二制备的类细胞质溶胶，e为实施例一制备的类细胞质溶胶，f为实施例三制备的类细胞质溶胶，g为对比实验四制备的类细胞质溶胶，h为对比实验五制备的类细胞质溶胶，i为对比实验六制备的类细胞质溶胶，j为对比实验七制备的类细胞质溶胶。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种含类细胞质人造细胞的制备方法是按以下步骤进行：
一、制备类细胞质溶胶：
将琼脂糖和蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶，向琼脂糖-蔗糖混合溶胶中加入蒸馏水，并浸泡20min～30min，得到混合溶液，将混合溶液置于加热板上加热至混合溶液沸腾，然后停止加热，并在室温条件下静置至室温，得到类细胞质溶胶；
所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(4～7)；所述的琼脂糖-蔗糖混合溶胶的质量与蒸馏水的体积比为60mg:(1～1.2)mL；
二、清洗ITO玻璃电极：
将ITO玻璃电极浸渍于乙醇溶液中，超声波清洗10min～15min，再浸渍于蒸馏水中，超声波清洗10min～15min，最后氮气吹干，得到清洗后的ITO玻璃电极；
三、制备含类细胞质磷脂囊泡：
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，使用移液枪将浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液滴加到清洗后的ITO玻璃电极表面并涂抹均匀，且每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL～2μL的浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，在温度为30℃～40℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极，将聚四氟乙烯矩形框固定在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极中间，得到电形成装置，利用真空脂将电形成装置密封，且两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm～2.5mm，聚四氟乙烯矩形框与两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充类细胞质溶胶，在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为3V～6V，频率为100Hz～1000Hz，温度为30℃～60℃，时间控制为1h～3h，得到含类细胞质人造细胞。
本具体实施方式的有益效果是：本具体实施方式以琼脂糖和蔗糖为主要原料配制琼脂糖-蔗糖混合溶胶，随着蔗糖在混合溶胶中比例的升高，琼脂糖-蔗糖混合溶胶的溶胶与凝胶之间转变温度降低至人体温度37℃附近，并且使用粘度计测量其粘度数值接近于人体细胞质粘度，具体为18cp～32cp，因此使用琼脂糖-蔗糖混合溶胶模拟细胞质环境，随后，使用细胞膜主要成分磷脂以电形成方法制备囊泡，以囊泡模拟细胞隔室，对细胞进行了多方面的构建模拟，并且将类细胞质即琼脂糖-蔗糖混合溶胶包裹在人造细胞中，同时通过调控交流电场的参数可以有效的制备出接近于真正细胞尺寸的人造细胞模型，具体为8μm～15μm。本具体实施方式将为原细胞探索研究及生命起源领域提供模型工具，该模型的构建实现了从细胞质到细胞膜的全面模拟研究，为进一步构建完整的细胞模型奠定了基础。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(4～5)。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤一中所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(5～7)。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为8mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液。其它与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为5mg/mL～8mg/mL的磷脂溶液。其它与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL的浓度为8mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液。其它与具体实施方式一或五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中在温度为30℃～35℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极。其它与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm～2mm。其它与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为3V～5V，频率为100Hz～500Hz，温度为30℃～40℃，时间控制为2h～3h。其它与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤三中在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为5V～6V，频率为500Hz～1000Hz，温度为40℃～60℃，时间控制为1h～2h。其它与具体实施方式一至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
一种含类细胞质人造细胞的制备方法是按以下步骤进行：
一、制备类细胞质溶胶：
将10mg琼脂糖和50mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶，向琼脂糖-蔗糖混合溶胶中加入1mL蒸馏水，并浸泡20min，得到混合溶液，将混合溶液置于加热板上加热至混合溶液沸腾，然后停止加热，并在室温条件下静置至室温，得到类细胞质溶胶；
二、清洗ITO玻璃电极：
将ITO玻璃电极浸渍于乙醇溶液中，超声波清洗15min，再浸渍于蒸馏水中，超声波清洗15min，最后氮气吹干，得到清洗后的ITO玻璃电极；
三、制备含类细胞质磷脂囊泡：
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为10mg/mL的磷脂溶液，使用移液枪将浓度为10mg/mL的磷脂溶液滴加到清洗后的ITO玻璃电极表面并涂抹均匀，且每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL的浓度为10mg/mL的磷脂溶液，在温度为30℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极，将聚四氟乙烯矩形框固定在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极中间，得到电形成装置，利用真空脂将电形成装置密封，且两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm，聚四氟乙烯矩形框与两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充类细胞质溶胶，在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为5V，频率为100Hz，温度为40℃，时间控制为3h，得到含类细胞质人造细胞。
实施例二：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将12mg琼脂糖和48mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
实施例三：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将7.5琼脂糖和52.5mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验一：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将30mg琼脂糖和30mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验二：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将20mg琼脂糖和40mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验三：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将15mg琼脂糖和45mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验四：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将6mg琼脂糖和54mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验五：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将5mg琼脂糖和55mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验六：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将4mg琼脂糖和56mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
对比实验七：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中将3mg琼脂糖和57mg蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶。其它与实施例一相同。
图1为不同比例类细胞质溶胶相转变温度对比图，a为对比实验一制备的类细胞质溶胶，b为对比实验二制备的类细胞质溶胶，c为对比实验三制备的类细胞质溶胶，d为实施例二制备的类细胞质溶胶，e为实施例一制备的类细胞质溶胶，f为实施例三制备的类细胞质溶胶，g为对比实验四制备的类细胞质溶胶，h为对比实验五制备的类细胞质溶胶，i为对比实验六制备的类细胞质溶胶，j为对比实验七制备的类细胞质溶胶；由图可知，随着琼脂糖-蔗糖混合溶胶中蔗糖含量的增加，溶胶-凝胶之间的转变温度降低，当琼脂糖和蔗糖质量比为1:4～1:19时，溶胶-凝胶转变温度低于人体温度37℃。
图2为实施例一制备的含类细胞质人造细胞显微镜图片；由图可知，以电形成法制备的含类细胞质人造细胞尺寸接近于人体正常细胞尺寸，即8μm～15μm。
图3为不同比例类细胞质溶胶粘度数值对比图，a为对比实验一制备的类细胞质溶胶，b为对比实验二制备的类细胞质溶胶，c为对比实验三制备的类细胞质溶胶，d为实施例二制备的类细胞质溶胶，e为实施例一制备的类细胞质溶胶，f为实施例三制备的类细胞质溶胶，g为对比实验四制备的类细胞质溶胶，h为对比实验五制备的类细胞质溶胶，i为对比实验六制备的类细胞质溶胶，j为对比实验七制备的类细胞质溶胶；由图可知，随着琼脂糖-蔗糖混合溶胶中蔗糖含量的增加，琼脂糖-蔗糖混合溶胶粘度逐渐降低，当琼脂糖和蔗糖质量比为1:4～1:7时，混合凝胶粘度为18cp～32cp，此粘度接近于真正细胞质中胶体粘度。
Claims (10)
1.一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于一种含类细胞质人造细胞的制备方法是按以下步骤进行：
一、制备类细胞质溶胶：
将琼脂糖和蔗糖混合，得到琼脂糖-蔗糖混合溶胶，向琼脂糖-蔗糖混合溶胶中加入蒸馏水，并浸泡20min～30min，得到混合溶液，将混合溶液置于加热板上加热至混合溶液沸腾，然后停止加热，并在室温条件下静置至室温，得到类细胞质溶胶；
所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(4～7)；所述的琼脂糖-蔗糖混合溶胶的质量与蒸馏水的体积比为60mg:(1～1.2)mL；
二、清洗ITO玻璃电极：
将ITO玻璃电极浸渍于乙醇溶液中，超声波清洗10min～15min，再浸渍于蒸馏水中，超声波清洗10min～15min，最后氮气吹干，得到清洗后的ITO玻璃电极；
三、制备含类细胞质磷脂囊泡：
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，使用移液枪将浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液滴加到清洗后的ITO玻璃电极表面并涂抹均匀，且每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL～2μL的浓度为5mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液，在温度为30℃～40℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极，将聚四氟乙烯矩形框固定在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极中间，得到电形成装置，利用真空脂将电形成装置密封，且两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm～2.5mm，聚四氟乙烯矩形框与两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充类细胞质溶胶，在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为3V～6V，频率为100Hz～1000Hz，温度为30℃～60℃，时间控制为1h～3h，得到含类细胞质人造细胞。
2.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤一中所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(4～5)。
3.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤一中所述的琼脂糖与蔗糖的质量比为1:(5～7)。
4.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为8mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液。
5.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中将二硬脂酰基磷脂酰胆碱加入到氯仿中，得到浓度为5mg/mL～8mg/mL的磷脂溶液。
6.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中每150cm2的ITO玻璃电极表面滴加1μL的浓度为8mg/mL～10mg/mL的磷脂溶液。
7.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中在温度为30℃～35℃的条件下，加热至氯仿挥发，得到表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极。
8.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极之间的距离为1.5mm～2mm。
9.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为3V～5V，频率为100Hz～500Hz，温度为30℃～40℃，时间控制为2h～3h。
10.根据权利要求1所述的一种含类细胞质人造细胞的制备方法，其特征在于步骤三中在两片表面涂覆有磷脂的ITO玻璃电极上施加交流电场，设定交流电压为5V～6V，频率为500Hz～1000Hz，温度为40℃～60℃，时间控制为1h～2h。
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|---|---|---|---|---|
| CN113372573A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-09-10 | 齐齐哈尔大学 | 一种室温下流动态琼脂糖混合溶胶的制备方法 |
| CN113730372A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-03 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种神经干细胞磷脂膜微囊及其制备方法 |
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- 2019-07-02 CN CN201910591000.6A patent/CN110186735B/zh active Active
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