CN110184301B

CN110184301B - 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合

Info

Publication number: CN110184301B
Application number: CN201810399266.6A
Authority: CN
Inventors: 杨辉
Original assignee: Huida Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huida Gene Therapy Singapore Private Ltd; Huida Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: WO2019206236A1; CN110184301A

Abstract

本发明提供了通过Tild‑CRISPR实现高效精确的靶向整合策略，具体地，本发明提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：供体DNA，所述供体DNA为双链；Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体。本发明提供的靶向整合策略的基因编辑效率显著高于其他现有的基因编辑技术，且它对插入片段没有长度的限制。

Description

通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种通过Tild-CRISPR实现高效精确的基因靶向整合系统及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法极大地促进了基因突变的细胞和组织的原位校正。然而，通过同源重组(HR)实现的精确敲入效率通常是比较低的。在以往的研究中，非同源末端连接(NHEJ)或微同源臂介导的末端连接(MMEJ)为基础的方法被报道称通过体内切割获得没有同源臂或者短同源臂(5-25bp)的转基因供体促进了斑马鱼和小鼠中CRISPR介导的靶向整合。

然而，针对最有用的带有条件性等位基因的转基因模型小鼠以及人类胚胎中的基因敲入还没有被这些新方法实现。一个使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的靶向策略Easi-CRISPR被报道称可以有效地获得带有条件性等位基因的小鼠(Quadros et al.,2017)。然而，使用ssDNA作为供体的Easi-CRISPR花费很大并且在插入片段上有长度限制(通常是小于1 kb)。

因此，本领域迫切需要开发出一种可以用于小鼠以及人类的高效精确的基因靶向整合策略。

发明内容

本发明的目的就是提供一种通过Tild-CRISPR实现的高效精确的基因靶向整合策略。在任何情况下，本发明的方法不用于以生殖为目的对人类配子、合子和胚胎进行基因操作。

在本发明的第一方面，提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：

a) 供体DNA，所述供体DNA为双链；

b) Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和

c) sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体;

其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：

E₁-R₁-L₁-Z-L₂-R₂-E₂ (I)

式中，

E₁代表无或5’端酶切以后的残留序列；

R₁代表5’端的同源臂；

L₁为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；

Z代表待整合的靶基因；

R₂代表3’端的同源臂；

L₂为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；

E₂代表无或3’端酶切以后的残留序列；

其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。

在另一优选例中，所述的gRNA靶向结合于所述基因组的靶位点。

在另一优选例中，所述的gRNA和所述cas9蛋白对所述基因组的靶位点进行定点切割。

在另一优选例中，所述待整合的靶基因Z的序列长度为1bp-20kb。

在另一优选例中，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0-20bp，较佳地0-10bp，更佳地0-5bp，最佳地0bp。

在另一优选例中，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为100-2000bp，较佳地100-1500pb，更佳地200-1000bp，最佳地700-900bp。

在另一优选例中，所述同源臂R₁的序列长度D1和同源臂R₂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)。

在另一优选例中，|D1-D2|/D1≤1/4，或|D1-D2|/D2≤1/4。

在本发明的第二方面，提供了一种基因靶向整合的方法，所述方法包括：

(i) 提供一待基因靶向整合的细胞；和

(ii) 将a)供体DNA；b)Cas9蛋白或其编码核酸；和c)sgRNA导入所述待整合的细胞内，进行基因整合，从而获得靶向基因整合的细胞；

其中所述方法不用于对人类配子、合子、受精卵和胚胎进行基因操作。

在另一优选例中，所述细胞是体细胞、卵细胞、非人合子(非人受精卵细胞)。

在另一优选例中，所述的体细胞选自下组：神经细胞、免疫细胞(如T细胞、NK细胞)、内皮细胞、多能干细胞、专能干细胞、巨噬细胞。

在另一优选例中，所述导入方法是电转、显微注射。

在另一优选例中，所述方法是体外方法。

在另一优选例中，所述待整合的细胞是非人受精卵细胞。

在另一优选例中，所述导入方法是直接向单细胞内注入，所述注入的供体DNA为40-100ng/μl，Cas9 mRNA为80-120 ng/μl，sgRNA为30-70 ng/μl。

在另一优选例中，所述方法是一种体外方法，所述方法是非诊断性和非治疗性的。

在本发明的第三方面，提供了一种用于基因靶向整合的试剂盒，所述试剂盒包括：

i)第一容器以及位于第一容器内的供体DNA，所述供体DNA为双链；

ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas9蛋白或其编码核酸或表达Cas9蛋白的第一表达载体；和

iii)第三容器以及位于第三容器内的sgRNA或表达sgRNA的第二表达载体。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器和第三容器中的任何二个或三个(或全部)可以是相同或不同容器。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Tild-CRISPR介导的小鼠胚胎的靶向整合数据。

图2显示了通过Tild-CRISPR在不同位点获得基因敲入小鼠的示意图，以及通过Tild-CRIPSR获得的基因编辑小鼠的序列分析。

图3显示了通过Tild-CRISPR获得Nr3c2和Lhx6条件性敲除小鼠。

图4显示了通过Tild-CRISPR方法在体内进行基因组编辑的示意图。

图5显示了Tild-CRISPR介导的基因敲入示意图以及转基因靶向整合的不同靶向策略的比较。

图6 Tild-CRISPR介导的小鼠胚胎的靶向整合在囊胚阶段的荧光图片和序列分析。

图7显示了Tild-CRISPR构建的Founder小鼠的基因型分离分析。

图8显示了Tild-CRISPR方法获得的Cdx2-p2A-mCherry小鼠的Southern Blot印迹分析。

以上所有附图中，intron代表内含子，extron代表外显子。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外地发现了一种Tild-CRISPR(线性化dsDNA-CRISPR介导的靶向整合)靶向策略，通过体外PCR扩增或者精确酶切获得含有800bp同源臂的转基因供体，在小鼠胚胎以及小鼠大脑中实现了高效的DNA靶向整合。在此基础上完成了本发明。

术语

CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs（sgRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single-guide RNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。

作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA和蛋白。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统。

Tild-CRISPR机制（Targeted integration with linearized dsDNA-CRISPR）

在本发明的Tild-CRISPR靶向整合策略中，提供了一种含有长同源臂的线性化供体（即Tild供体），这种供体是通过PCR扩增或者精确酶切获得的含有800bp同源臂的转基因供体；将Tild供体与Cas9 mRNA以及single-guide RNA一起注射到小鼠受精卵中。本发明提供的Tild-CRISPR靶向整合策略相比于已有的基因靶向策略具有更高的DNA敲入效率；并且没有插入片段长度的限制，从0.8kb到6.0kb，都可以被精确地整合到不同的位点。

在本发明中，在CRISPR介导的基因组编辑中由转基因片段以及两边的800bp同源臂组成的线性化dsDNA供体是实现高效基因敲入的关键因素。与MMEJ（微同源臂介导的末端连接）或HMEJ（同源臂介导的末端连接）介导的方法相比，Tild-CRISPR跳过了转基因供体体内切割的步骤，因此导致了很高的基因敲入效率。正如图5所概括(图5)，因为Tild供体的片段与通过CRISPR介导的体内切割获得的MMEJ和HMEJ供体片段非常相似，所以可以推测MMEJ或HMEJ通路可能参与到Tild-CRISPR中。对于传统的HR供体，它是一个环状的质粒或者一个线性化的大量部分垃圾序列的供体，通过同源重组的方式实现转基因的敲入。

在一实施方案中，在小鼠胚胎中，MMEJ或HMEJ介导的靶向整合优于HR介导的靶向整合，因为HR的抑制剂对Tild-CRISPR介导的转基因整合没有效果。因此,通过CRISPR介导的体内切割移除或者通过限制性酶切除HR供体的垃圾序列可以促进转基因的靶向整合。使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的Easi-CRISPR策略，单链退火(SSA)因素可能是涉及到ssDNA供体介导的修复。

反应体系

本发明提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述的反应体系包括：

a) 供体DNA，所述供体DNA为双链；

c) sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体;

其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：

E₁-R₁-L₁-Z-L₂-R₂-E₂ (I)

式中，

E₁代表无或5’端酶切以后的残留序列；

R₁代表5’端的同源臂；

Z代表待整合的靶基因；

R₂代表3’端的同源臂；

E₂代表无或3’端酶切以后的残留序列；

在本发明中，待整合的靶基因Z的序列长度可以是1bp-20kb。本发明的优点在于反应体系中供体DNA对于靶基因的序列长度相比于现有技术，不受明显限制。例如，其既可以实现靶基因的点突变，也可以向切割位点插入长达20kb的靶序列。本发明的供体DNA中靶基因的长度可以是1bp-20kb；更优选地，可以是0.5kb-10kb；在优选的实施方式中，可以是0.8kb-6.0kb。

在本发明中，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0-20bp，较佳地0-10bp，更佳地0-5bp，最佳地0bp。

在本发明中，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为100-2000bp，较佳地100-1500pb，更佳地200-1000bp，最佳地700-900bp。在另一实施方式中，所述同源臂R₁的序列长度D1和同源臂R₂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)。在另一优选例中，|D1-D2|/D1≤1/4，或|D1-D2|/D2≤1/4。在本反应体系中，对两个同源臂的序列长度并不要求完全一致，其两者之间允许存在一定的长度差。

本发明的主要优点包括：

1）Tild-CRISPR方法的基因敲入效率显著高于其他现有的基因编辑技术，且它对插入片段没有长度的限制。

2）载体构建方便，可以用于多个系统，包括体外细胞，胚胎及体内组织细胞。

3）导入方式简便，可通过电转或者显微注射方式导入，适用于原代细胞导入，如血细胞。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和NatalieSherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

通用方法

1. 小鼠

B6D2F1(C57BL/6 X DBA2J)小鼠(7-8周)被用于受精卵收集。ICR雌鼠被用于受体。E14.5怀孕ICR小鼠用于子宫内的电转。动物的使用和照料都在中国科学院上海生命科学研究院动物伦理委员会的指导下。

2. 线性化供体的构建

为了构建Actb位点的Tild供体(转基因DNA两侧连接不同长度的同源臂), 包含了800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR的Actb-HR供体载体(Addgene 编号no. 97317)通过HindIII和Xho I两个限制性内切酶切割或者PCR扩增进行线性化处理，并且用胶回收试剂盒(Omega，D2500-02)纯化。

为了构建Actb位点的JS-2000供体(800bpHAL-转基因DNA-800bpHAR两侧连接2000bp的垃圾序列), 包含了800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR的Actb-HR供体载体(Addgene 编号no. 97317)通过限制性内切酶切割或者并且用胶回收纯化。为了构建Actb位点的JS-200和JS-800供体，以Actb-HR供体载体为模板，通过PCR扩增出含有不同长度垃圾序列的线性化供体。

为了构建人OCT4/GATA6位点的Tild供体，供体载体(800bpHAL-intron 4-exon 5-p2A-GFP-polyA-800bpHAR for Oct4, 800bpHALp2A-mCherry-800bp HAR for GATA6)通过上面描述的PCR扩增以及胶回收纯化进行线性化处理。

3. ssDNA供体的构建

Actb位点的ssDNA供体是由Actb-HR供体载体通过之前描述的IvTRT方法制备的(Miura et al., 2015)。通过T7启动子和T7 RNA聚合酶，使用mMESSAGE mMACHINE T7ULTRA kit(Life Technologies)进行体外转录。然后使用MEGAclear kit(LifeTechnologies)进行纯化。cDNA(ssDNA)由逆转录酶(Takara，2641A)合成并且RNA模板被RNsaeH降解(NEB，M0297)。

4. Cas9 mRNA和sgRNA的生产

T7启动子通过PCR扩增px260加到Cas9编码区域，使用引物Cas9 IVT_F和IVT_R(表S1)。纯化后的T7-Cas9 PCR产物被用作体外转录(IVT)的模板，使用mMESSAGE mMACHINE T7ULTRA kit(Life Technologies)进行转录。T7启动子通过PCR扩增px330加到sgRNA模板上，引物在表S1中。以此为模板，选用MEGAshortscript T7 kit(Life Technologies)进行sgRNA的体外转录。转录后的Cas9 mRNA和sgRNA都使用MEGAclear kit (LifeTechnologies) 进行回收纯化并用溶解在RNase-free水。

5. 受精卵注射、胚胎培养和胚胎移植

对于小鼠基因编辑，选取7-8周龄的 B6D2F1(C57BL/6 X DBA2J)雌鼠进行超排。每只腹腔注射5 IU孕母马血清促性腺激素(PMSG)，48小时后注射同等剂量的5 IU 人体绒毛膜促性腺激素(hCG)，然后立即与 B6D2F1 雄鼠交配。合子胚胎在注射 hCG 后的20 h后从输卵管中进行收集。

对于受精卵注射，Cas9 mRNA(100 ng/μl)、sgRNA(50 ng/μl)和一系列浓度的线性化供体(Tild-HA800，100 or 25 ng/μl；Tild-HA20，33 ng/μl)混合，注射到可观察到明显原核的受精卵的胞质内。受精卵在含有5 μg/ml细胞松弛素(CB)的 HEPES-CZB操作液中，注射使用FemtoJet microinjector(Eppendorf)仪器，持续液流模式。注射后的胚胎在含氨基酸的KSOM培养基中， 37℃、5% CO₂的环境下培养至囊胚，随后进行荧光观察以及基因型鉴定。

对于Nu7026(Selleck)和SCR7(Selleck)处理，2mM Nu7026或不同浓度(1、2、4 mM)的SCR7与Tild—CRISPR组分混合注射到受精卵的胞质中。对于咖啡因(Sigma Aldrich)处理，注射的受精卵在含有1 mM 咖啡因的KSOM培养基中培养1天，然后转移到新鲜的KSOM中。

为了获得基因敲入小鼠，注射后的受精卵培养至2-细胞阶段，然后25-30枚2-细胞胚胎移植至0.5天的ICR假孕母鼠的输卵管中。

6. 胚胎和小鼠基因型分析

我们在体视显微镜下用玻璃管进行收集和转移单个胚胎。根据荧光选取单个胚胎并转移至单个PCR管中。3 μl裂解液(0.1% tween20、0.1% TritonX-100和4μg/ml蛋白酶K)加入PCR管中。样本在56℃中反应30 min，随后95℃ 5 min热失活蛋白酶K。PCR扩增使用巢式引物(表S1)。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后第一轮PCR的程序为95℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 1min，这样反复30个循环后，最终72℃延伸10 min。第二轮PCR反应用上一轮的1μl PCR产物为模板，PCR反应体系与上一轮一样。最终的PCR产物切胶回收并且测序。

对于小鼠基因型分析，使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN，DP304- 03)从小鼠脚趾或尾巴组织中提取基因组DNA。PCR使用可以扩增出正确靶向接合处的引物(表S1)。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后PCR的程序为95℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 1min，这样反复38个循环后，最终72℃延伸10 min。PCR产物切胶回收并且测序。

7. 体外Cre重组

10 μl的反应体系，包含300 ng基因组DNA和2反应单位的重组Cre重组酶(NEB，M0298)，在缓冲体系中37°C孵育1 h。1 μl的Cre反应混合物被用作PCR的模板，使用基因特异的引物进行扩增。对于Nr3c2，引物 F3和R3 用于检测删除缺失的片段产物，而引物 cF1和cF2 用于检测环状产物。

8. 子宫内电穿孔转染

子宫内电转的实验步骤均根据之前文献报道的进行操作(Takahashi et al.,2008)。用戊巴比妥钠(50mg/Kg，Sigma)麻醉E14.5怀孕母鼠。终浓度1 μg/μl的表达Actb-sgRNA-spCas9-GFP的质粒与线性化供体(Tild-HA800，500 ng/μl或250 ng/μl；Tild-HA200，250 ng/μl或125 ng/μl)混合。作为对照，线性化的供体与表达Actb-sgRNA-GFP的质粒混合。质粒用0.005% fast green solution(Sigma)注射到小鼠胚胎的侧脑室。电转时，用仪器ECM830(BTX)，电压35V，时长50ms，间隔950ms电击5次。然后子宫角重新放回腹腔，让胚胎在子宫中继续发育至特定时间点。

9. 小鼠免疫染色

免疫染色实验中，小鼠通过蠕动泵(Gilson)先用0.9%生理盐水，后用4%多聚甲醛进行心脏灌流，然后在4℃固定过夜。然后组织用30%的蔗糖脱水直到沉到管子底部。用Leica CM1950-Cryostat将大脑组织切成40μm的厚度。脑片用0.1M磷酸缓冲液(PB)洗三遍，然后用5% NGS稀释的一抗：goat anti-GFP (1:500，GeneTex)和rabbit anti-mCherry (1:3 000，GeneTex) 4℃孵育过夜。第二天，脑片用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗：FITC-AffiniPure donkey Anti-goat IgG(1:500，Jackson Immunoresearch)和Cy3-AffiniPure donkey Anti-Rabbit IgG(1:500，Jackson Immunoresearch)室温孵育两小时。最后脑片用DAPI复染20分钟，在载玻片上用SlowFade Diamond Antifade Mountant(Life)进行封片。

10. 单细胞PCR

4-16细胞阶段的胚胎用台式酸acid Tyrode消化透明带，然后转移到0.25%的胰蛋白酶中，轻轻地吹打分离成单个的卵裂球。最后，卵裂球在CZB中冲洗8-10次然后转移到单个PCR管中。胚芽被洗了在CZB中，8到10次，然后分别转移到PCR管中。2 μl裂解液(0.1%tween20、0.1% TritonX-100和4μg/ml蛋白酶K)加入PCR管中。样本在56℃中反应30 min，随后95℃ 5 min热失活蛋白酶K。裂解产物作为巢式PCR的模板，扩增使用巢式引物(表S1)。PCR产物切胶回收并且测序。

11. Southern印迹分析

从Cdx2-p2A-mCherry小鼠中获得的10g基因组DNA被限制性内切酶EcoRI消化。被消化的基因组DNA通过0.8% 琼脂凝胶分离并转移到Zeta-Probe GT Blotting Membranes(Bio-Rad，162-0196)。Southern印迹分析是用磷32 放射性同位素系统。膜与内部mCherry探针进行杂交(SEQ ID NO: 119，5’atggtgagcaag ggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa3’)。内部mCherry探针预期的条带大小：WT = N/A，Targeted = 4.2 kb。

12. 细胞培养和转染

小鼠胚胎干细胞(129/Sv x C57BL/6 ES细胞)用2i培养基，成分为杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco，11965-02)、15%胎牛血清(FBS)(Gibco)、1000U/ml小鼠Lif、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1 %青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)、0.1 mM β-巯基乙醇(Sigma)、0.1 mM非必需氨基酸(Gibco)、1 μM PD0325901和3 μM CHIR99021。N2a细胞用DMEM(Gibco，11965-02)加上10% FBS(Gibco)进行培养。所有细胞都在5% CO₂、37℃下培养。小鼠胚胎干细胞和N2a细胞用Lipofectamine3000试剂(Invitrogen)根据说明书的指导进行转染。六孔板的每个孔，使用的质粒总量为5μg(Cas9：供体=1：1)。48小时后，转染阳性的小鼠胚胎干细胞和N2a细胞用BD FACS AriaII流式细胞仪分选并种至六孔板，进行后续培养和分析。

在小鼠的细胞和N2a细胞中，1 μM SCR7(Selleck)和4 mM咖啡因(Sigma Aldrich)在转染前1天分别加到培养基中并在转染后持续处理2天。

13. 量化和统计分析

对神经元细胞内的相对效率进行量化，通过统计随机视野内GFP+细胞中mCherry+细胞比例来说明相对敲入效率。作为对照，线性化的供体与表达Actb-sgRNA-GFP的质粒混合。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均数±标准差表示。数据点用黑点表示。*P<0.05，***P<0.001，不配对T检验。

对培养细胞中基因敲入效率进行量化，通过流式细胞术统计在所以细胞中mCherry+细胞比例来说明敲入效率。结果用平均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。

对于统计分析，所有的细胞系(mES细胞和N2a细胞，图5A)和神经元细胞(图4)的统计值被呈现为平均数±标准差。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。所有的胚胎通过每个柱上的数字表明统计的胚胎(小鼠胚胎，图1C，图1F和图5B)总数。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，卡方检验。

实施例1：通过Tild-CRISPR方法在小鼠胚胎中进行基因组编辑

本实施例检测了提前在体外通过两个限制性酶酶切获得含有长同源臂的线性化供体(称为Tild供体)是否可以进一步提高基因敲入效率。将Tild供体的效率与两种其他常用类型的供体相比，一个是同源臂介导的末端连接(HMEJ)供体(sgRNA靶向位点加800bp同源臂)，另一个是HR供体(只含有800bp同源臂)(图1A)。在Actb基因的终止密码子处融合一个p2A-mCherry报告基因(图1A)。每种类型的转基因供体和Cas9 mRNA，靶向Actb基因的sgRNA一起注入小鼠受精卵中，注射过的受精卵培养到囊胚(图1B)。敲入效率通过观察囊胚的mCherry荧光信号进行评估(图1B和S1A)。

结果如图，相比HMEJ供体(20.5%)和HR供体(0%)，可以观察到Tild供体获得更高比例的mCherry阳性囊胚(36.6%)(图1C和S1A)。

与传统的线性化HR供体(JS2000)相比，Tild供体在同源臂相邻位置不含有非同源序列。本发明人在Tild供体两端加上不同长度的JS(200bp、800bp和2000bp)(图1A)，以检测供体的非同源源序列(已知为“垃圾序列”,JS)是否会降低转基因整合的效率。结果显示，随着JS长度的增加，敲入效率从36.6%(没有JS)下降到4.9%(2000bp JS)(图1C)。此外，通过PCR扩增获得的含有长同源臂的转基因供体与酶切获得的Tild供体在Actb位点表现出相似的敲入效率(图1D)。同时也检测了一种有效的靶向策略Easi-CRISPR所使用的长单链DNA供体(Quadros et al., 2017)，结果只观察到相对较低的mCherry阳性囊胚率(12.7%)(图1C)。

在本实施例中，通过在靶向基因的最后一个外显子融合p2A-mCherry报告基因，还检测了其他一些位点处Tild-CRISPR介导的敲入效率，包括Nanog(多能性标记基因)，Sox2(多能性标记基因)，Cdx2(滋养外胚层标记基因)(图1E)。结果显示，在这三个位点中，相对于HR或HMEJ介导的方法，Tild介导的方法都展现出较高的敲入效率(图1F)。结果还显示，800bp同源臂供体的敲入效率一般高于20bp同源臂供体(图1F)。通过Tild-CRISPR获得的单个mCherry阳性囊胚的基因型分析显示在5’和3’连接处几乎所有的整合都是精确的符合读码框的整合(图6)。

本实施例还测试了Tild-CRISPR用于获得基因敲入小鼠的效率。将Tild-CRISPR处理后的胚胎移植到假孕的小鼠体内，可以成功地在6个不同的位点获得基因编辑的敲入小鼠，包括mCherry整合到Dbh位点(6/29)和Cdx2位点(31/57)，Cre整合到Sp8位点(10/35)，CAG-LSL-ChR2-Tdtomato(6.0kb) 整合到Rosa26位点(2/29)和条件性floxed等位基因在Nr3c2位点(3/16)和Lhx6位点(4/12)(图2、3和表1)。这些基因编辑小鼠的精确整合通过DNA测序分析被证实(图2B、3C和3D)，以及所有的基因敲入小鼠都可以实现生殖系传递(表1和图7)。

另外，本实施例中，对Tild-CRISPR和HMEJ介导的方法获得的在Cdx2位点上整合mCherry的小鼠进行Southern Blot印迹分析。结果显示，使用mCherry内部探针，HMEJ介导的方法获得的7个分娩前被分离的胎儿中有2个，Tild-CRISPR介导的方法获得的8个小鼠中有2个，分别携带了额外的随机整合基因(图8)。相比于HMEJ介导的方法和HR介导的方法(Yang et al., 2013; Yao et al., 2017a)，Tild-CRISPR的随机插入比例并没有显著增加。

综上所述，这些结果表明Tild-CRISPR方法在小鼠胚胎中实现了高效的DNA整合。

实施例2：通过Tild-CRISPR方法在体内进行基因组编辑

在本实施例中，用Tild-CRISPR的方法在Actb基因插入一个p2A-mCherry。

通过子宫内胚胎电转的方法，将Tild载体转入E14.5小鼠大脑中(图4A和4B)。电转后7天，脑片被染色和统计。

结果显示，使用Tild-HA800载体电转的细胞中大约16%的细胞有mCherry表达(mCherry+/GFP+，相对效率)(图4C和4D)。相比之下，Tild-HA800，HMEJ和HR载体只有大约5%，9.5%±1.7%和0.8%±0.2%的细胞是mCherry阳性的(图4C和4D)。

综上所述，Tild-CRISPR在体内可以实现高效的DNA整合效率。

实施例3：Tild-CRISPR机制

在本实施例中，验证了Tild-CRISPR是否依赖于NHEJ和HR通路。

将靶向Actb整合p2A-mCherry的Tild载体转染进小鼠的ES细胞和N2a细胞，并且给予Scr7(NHEJ抑制剂)和咖啡因(HR抑制剂)处理。

结果显示，咖啡因大大降低了小鼠的ES细胞和N2a细胞中的基因敲入效率(图5A)。相比之下，Scr7提升了Tild-CRISPR在这些细胞中介导的基因敲入效率(图5A)。

我们也给予胚胎Scr7，Nu7026(另一种NHEJ抑制剂)，或咖啡因处理，结果显示Scr7或Nu7026抑制了Tild-CRISPR介导的基因敲入，但是咖啡因并没有明显的效果(图5B)。

综上所述，Tild-CRISPR介导的转基因整合可能同时被HR和NHEJ通路调控，这也说明了Tild-CRISPR拥有高效基因敲入效率的原因。

表1通过Tild-CRISPR介导的靶向整合获得基因敲入小鼠

基因

插入大小(kb)

方法

胚胎移植(接受)

新生数量(出生率%)

5’&3’连接(%)

精确整合(%)

种系传递(%)

Cdx2-2A-mCherry

0.8

HMEJTild

118(6) 216(11)

43(36.4) 57(26.4)

7/43(16.3) 31/57(54.4)

7/7(100) 4/4(100)

N.D. 4/4(100)

Dbh-2A-mCherry-WPRE

1.4

Tild

84(4)

29(34.5)

6/29(20.7)

3/3(100)

Sp8-2A-Cre-WPRE

2.3

HMEJTild

125(5) 148(7)

33(26.4) 35(23.6)

4/33(12.1) 10/35(28.6)

4/4(100) 3/3(100)

3/3(100) 2/2(100)

Rosa26-CAG-lsl-hChR2-Tdtomato-WPRE

6.0

Tild

57(3)

29(50.9)

2/29(6.9)

2/2(100)

1/1(100)

Nr3c2-exon 5 floxed

0.6

Tild

63(3)

16(25.4)

3/16(18.8)

3/3(100)

2/2(100)

Lhx6-exon 6～8 floxed

1.0

Tild

66(3)

12(18.2)

4/12(33.3)

4/4(100)

2/2(100)

表中，Cas9 mRNA (100 ng/μl)、sgRNA(50 ng/μl)和供体(100 ng/μl)共注射至受精卵里。注射的胚胎发育至2-细胞阶段后移植入受体体内，获得的新生小鼠进行基因型鉴定。*，胎儿在出生前被分离出来进行分析。N.D.,未确定的。

表2 本发明中使用的引物

讨论

本发明提供了一个Tild-CRISPR策略(线性化dsDNA-CRISPR介导的靶向整合)，通过PCR扩增或者精确酶切获得含有800bp同源臂的转基因供体。与所有其他使用不同类型转基因供体的靶向策略相比，它的效率是最高的。这个方法是非常普适的，因为它已经被证明在9个位点有效，包括在小鼠胚胎中靶向四个位点(Actb，Nanog，Sox2，Cdx2)和在获得基因敲入小鼠中靶向6个位点(Cdx2，Dbh，Sp8，Nr3c2，Lhx6，Rosa26)。需要注意的是，HR供体包含很长的同源臂(通常是2-4kb)，在小鼠胚胎的某些研究通彻的位点，它偶尔能达到和Tild-CRISPR相当的效率。然而，质粒构建和靶向等位基因鉴定是一项费力的事情。相比使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的靶向策略Easi-CRISPR，Tild-CRISPR有两个明显的优势。首先，Tild-CRISPR比Easi-CRISPR具有更高的DNA敲入效率，见图1。其次，对于Tild-CRISPR来说，没有插入片段长度的限制。各种各样的插入片段，从0.8 kb到6.0 kb，都可以被精确地整合到不同的位点。

此外，本发明的Tild-CRISPR在子宫内电转中显示了强健的DNA敲入能力。与HR或HMEJ介导的方法相比，Tild-CRISPR编辑效率更高。因此，Tild-CRISPR为其他系统的应用，如研究眼睛和肝脏的基因的生物学功能，提供了很大的可能性。同时基因编辑最近被用于研究人类胚胎发育和纠正病理基因突变((Fogarty et al., 2017; Ma et al., 2017)。Tild-CRISPR策略也许可以极大地促进人类胚胎的靶向基因编辑。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合

<130> P2018-0538

<160> 119

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

taatacgact cactataggg agtccgccta gaagcacttg 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg cgtaagtctc atatttcacc 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg tgcccctgtc gcacatgtga 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg agaccacggg aggggtcact 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg agaatagctt ctcacaaggt 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gctgctacct gtaataagat 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg actccagtct ttctagaaga 40

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg cattgagttg caatcaagga gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg aagccattga gttgcaatca gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg gcatgagtac cgaagactca gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggg actctgccgc catgagtctt gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

taatacgact cactataggg agggtcagga gcgagtggct gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg aagggtcagg agcgagtggc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg ccgcccctca tatggagccc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

taatacgact cactataggg ggggtccccc gcccctcata gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg tagaatgtcc aagcagagtc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

taatacgact cactataggg gacagaatgt ccaagcagtc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

taatacgact cactataggg tggctcctcc aactgctcta gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

taatacgact cactataggg agtcacgtcc tccgtgcgac gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

taatacgact cactataggg cctccgtgcg accggattcc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

taatacgact cactataggg accggattcc tggtgcgccc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

aaaagcaccg actcggtgcc 20

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

taatacgact cactataggg agatttcagg ttggaccggt g 41

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

gacgtcagcg ttcgaattgc 20

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

taatacgact cactataggg agcagatgtg gatcagcaag caggag 46

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

tctgcgcaag ttaggttttg tc 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

ccctgagtgt ttcttgtggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

tggagccgta catgaactga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ttcaacaccc cagccatgta 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

gccccgtaat gcagaagaag 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

aggtagtgtt agtgcaggcc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

ctacgacgct gaggtcaaga 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

gcctaggttt ctggaggagt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

aggcctggct gtcatgttta 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

tggagccgta catgaactga 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

cgaatgtcct gtcactctgc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

gccccgtaat gcagaagaag 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

gaccctcccc ttcacatacc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

tcccacaacg aggactacac 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

ctggcatcgg ttcatcatgg 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

accggcggca accagaagaa ca 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

tcaccttcag cttggcggtc 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

caaccagaag aacagcccgg a 21

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

ggtctgggtg ccctcgtag 19

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

gccccgtaat gcagaagaag 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

gattctcggc agcctgattc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 49

ctacgacgct gaggtcaaga 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 50

tcggcagcct gattccaata 20

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 51

acttggacag agaaagagcg att 23

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 52

tccatgtgca ccttgaagcg 20

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 53

aacaaaggtc cagtctacgc at 22

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 54

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 55

gacggccccg taatgcagaa 20

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 56

tagcttgcaa ccagagaaga tgt 23

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 57

ctacgacgct gaggtcaaga 20

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 58

cgacttccct tcaccataca ac 22

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 59

aacaaaggtc cagtctacgc at 22

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 60

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 61

ctacgacgct gaggtcaaga 20

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 62

cgacttccct tcaccataca ac 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 63

gatggggtta agtggtgggt 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 64

caccttgaag cgcatgaact 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 65

cgtcccttcg gccctcaatc 20

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 66

actcccttcc aaaaccatca aaga 24

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 67

cgcttctgtg tgatggcaac ttc 23

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 68

gattgttcag cttacaccag gct 23

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 69

tagggcctgc ggggtctatt 20

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 70

caggctcgct cccgctgggc c 21

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 71

gtcgctgatt ggcttctttt c 21

<210> 72

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 72

tatatgggct atgaactaat g 21

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 73

cccgtttaaa cccgctgatc 20

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 74

catgtggctc aataatgaaa t 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 75

cccagactat gaagtcttat g 21

<210> 76

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 76

ccactctgcc gccatgaata acttcgtata gc 32

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 77

ttgagttgca atcaaataac ttcgtatagc 30

<210> 78

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 78

taggagagag ccttccataa cttcgtataa t 31

<210> 79

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 79

atgagtaccg aagacataac ttcgtataat g 31

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 80

ataccagctg ttgacagtgt 20

<210> 81

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 81

gacctgtgcc atatatcaaa ag 22

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 82

agccagctca atgtgacttt act 23

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 83

cgagctgtga aatgcaaaaa tc 22

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 84

gagcccgaga tcgtgtatgc a 21

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 85

tgaccgtcat cagcattagc 20

<210> 86

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 86

gggtcccccg cccctcataa cttcgtatag ca 32

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 87

ggtcaggagc gagtgataac ttcgtatagc 30

<210> 88

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 88

gatccccgct cccagcataa cttcgtataa t 31

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 89

tcctgggctc catatataac ttcgtataat 30

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 90

gctcactgac tcctcttgtc 20

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 91

ctgggggttc tatttggtgg g 21

<210> 92

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 92

ttacgtcgcc gtccagctc 19

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 93

ctctgcagat tctgaccgca t 21

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 94

ccttgctcac tggcccggga t 21

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 95

gggatcactc tcggcatgga c 21

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 96

aggtaacagc tacatggtga ct 22

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 97

gcctcgactg tgccttctag tt 22

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 98

aggcttttgg gaactagcct atc 23

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 99

cccgaaagag aaagcgaacc 20

<210> 100

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 100

tggatattcc catccctacc tcag 24

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 101

tgatcatggc agatagagga t 21

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 102

tggagccgta catgaactga 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 103

catggcagat agaggatgtt 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 104

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 105

ctacgacgct gaggtcaaga 20

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 106

ctgcctgtgg gttagtcaca c 21

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 107

tcccacaacg aggactacac 20

<210> 108

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 108

tgttgttgca atttttccag cac 23

<210> 109

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 109

ctgggggttc tatttggtgg g 21

<210> 110

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 110

cagcttgccg gtggtgcaga tgaa 24

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 111

ctctgcagat tctgaccgca t 21

<210> 112

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 112

ttacgtcgcc gtccagctc 19

<210> 113

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 113

acttgggtat gagcattgga tatt 24

<210> 114

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 114

tggatattcc catccctacc tcag 24

<210> 115

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 115

tgatcatggc agatagagga t 21

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 116

tggagccgta catgaactga 20

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 117

catggcagat agaggatgtt 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 118

tgaagcgcat gaactccttg 20

<210> 119

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 119

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

Claims

1.一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：

a) 线性化供体DNA，所述线性化供体DNA为双链；

c) sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体;

其中，所述的线性化供体DNA的结构从5’到3’如式I所示：

E₁-R₁-L₁-Z-L₂-R₂-E₂ (I)

式中，

E₁代表无或5’端酶切以后的残留序列；

R₁代表5’端的同源臂；

Z代表待整合的靶基因；

R₂代表3’端的同源臂；

E₂代表无或3’端酶切以后的残留序列；

其中，所述的R₁与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧序列是同源的，而所述的R₂与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧序列是同源的；

所述的sgRNA靶向结合于所述基因组的靶位点；

所述的sgRNA和所述Cas9蛋白对所述基因组的靶位点进行定点切割。

2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述待整合的靶基因Z的序列长度为1bp-20kb。

3.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0-20bp。

4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0-10bp。

5.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0-5bp。

6.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E₁和E₂的序列长度各自独立地为0bp。

7.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为100-2000bp。

8.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为100-1500pb。

9.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为200-1000bp。

10.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁和R₂的序列长度各自独立地为700-900bp。

11.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁的序列长度D1和同源臂R₂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)。

12.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R₁的序列长度D1和同源臂R₂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.9-1.1):(0.7-1.3)。

13.如权利要求11或12所述的反应体系，其特征在于，|D1-D2|/D1≤1/4，或|D1-D2|/D2≤1/4。

14.一种基因靶向整合的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i) 提供一待基因靶向整合的细胞；和

(ii) 将a) 线性化供体DNA；b)Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和c)sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体，导入所述待整合的细胞内，进行基因整合，从而获得靶向基因整合的细胞，

其中所述线性化供体DNA如权利要求1-13中任一项所定义；和

其中所述方法是非诊断性和非治疗性的，

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞是体细胞、卵细胞、非人合子。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞是非人受精卵细胞。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的体细胞选自下组：神经细胞、免疫细胞、内皮细胞、多能干细胞、专能干细胞、巨噬细胞。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的免疫细胞为T细胞或NK细胞。

19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述导入方法是电转、显微注射。

20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。

21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述导入方法是直接向单细胞内注入，所述注入的供体DNA为40-100ng/μl，Cas9 mRNA为80-120 ng/μl，sgRNA为30-70 ng/μl。

22.一种用于基因靶向整合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

i)第一容器以及位于第一容器内的线性化供体DNA，所述线性化供体DNA为双链；

iii)第三容器以及位于第三容器内的sgRNA或表达sgRNA的第二表达载体，

其中所述线性化供体DNA如权利要求1-13中任一项所定义。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一容器、第二容器和第三容器中的任何二个或三个可以是相同或不同容器。