CN110152062A - 一种应用于组织再生的3d生物打印水凝胶支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要是涉及一种可打印的3D水凝胶支架及其制备方法，属于组织工程领域。本发明提供的可3D打印的水凝胶支架由具备生物相容性和可剪切稀化行为特性的结冷胶和塑性的可溶性淀粉混合并借助3D打印技术打印出表面光滑且具完整镂空六棱柱结构的复合支架,以用于组织损伤修复和神经再生。该支架具有良好的稳定性，且由可降解、吸收的生物材料打印而成。该支架高度仿生体内细胞三维生长空间，利于细胞的附着和允许营养物质的扩散和废弃物的排放，让细胞能够充分生长和增殖。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域，尤其是涉及到一种应用于组织再生3D生物打印水凝胶支架及其制备方法，具体属于组织工程神经再生领域。
背景技术
周围神经是联系神经中枢和外周靶结构的桥梁，其主要功能是感受刺激，将神经冲动传入神经中枢，并将神经中枢的冲动传出，支配肌肉运动和腺体分泌。周围神经缺损是指外伤或手术导致的周围神经干离断，在功能位置下恢复其“生物弹性”后，断端之间仍然存在间距的。在日常生产生活中，交通事故、工伤、战争、地震及临床手术意外等导致的周围神经损伤是临床常见病征。据世界卫生组织统计，美国每年新发生周围神经损伤病例约36万例，欧洲每年新增病例超过30万例。我国周围神经损伤病例每年新增约100万例，其中周围神经缺损的病例约30万例。
目前临床上外周神经缺损仍然采用传统的自体神经作为神经桥接物，近年来，在采用组织工程神经桥接物来修复神经缺损取得很大进展，不少产品己进入临床或即将进入临床使用。
然而传统的自体神经桥接物来源有限、组织尺寸和结构不匹配以及移植物供区长期失神经支配、二次损伤等原因，因此自体神经移植的应用有很大的局限性。常用人工神经移植物的修复效果与自体移植相比还不很理想，尤其是修复长距离、粗大或陈旧性神经缺损时，其修复效果与自体移植相比还有很大的差距。
因此开发出一种新型的能够比拟自体神经移植物、引导神经长入远侧和新生神经塑型效果的可用于神经再生的3D生物打印水凝胶支架作为人工神经移植物具有广阔的临床应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供用于神经再生负载细胞的3D生物打印水凝胶支架及其制备方法。本发明提供的打印支架经过3D打印后，凝胶性好。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架及其制备方法，所述的水凝胶支架由具备生物相容性和可剪切稀化行为特性的结冷胶和塑性特性的可溶性淀粉混合并借助3D打印技术制备出表面光滑且具完整结构的复合支架。
本发明提供了一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：在水中加入结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末，将其配制成结冷胶和淀粉混合溶液；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料。
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，得到复合支架。
步骤6：将打印好的支架进行定型灭菌处理。
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
本发明的一种实施方式中，所述水为超纯水。
本发明的一种实施方式中，所述步骤1中在超纯水中加入结冷胶（GG），水浴搅拌溶解，制成结冷胶水溶液。
本发明的一种实施方式中，所述步骤1中超纯水和结冷胶的质量比例为70-100:16。
本发明的一种实施方式中，所述步骤2为在步骤1所得的结冷胶水溶液中加入一定比例的可溶性淀粉粉末，制备成结冷胶和可溶性淀粉混合溶液。
本发明的一种实施方式中，所述步骤2中超纯水、结冷胶和可溶性淀粉的质量比例为70~100:16:4~16。
本发明的一种实施方式中，所述步骤2中，制备混合溶液的水浴温度为90~100℃。
本发明的一种实施方式中，所述步骤2中，制备混合溶液需要搅拌30~40min。
本发明的一种实施方式中，所述步骤2中，制备混合溶液需要搅拌速度为1000rpm。
本发明的一种实施方式中，所述步骤3中，制备好的混合溶液需要在室温条件下冷却大概2h后，放入50ml离心管中继续冷却1h。
本发明的一种实施方式中，所述步骤5中，导入的3D打印模型为不同边长的长方体或者正方体，3D打印机的打印速度为15~20mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为0.74mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.11~0.3MPa。
本发明的一种实施方式中，所述步骤6中将打印好的支架放入-20℃冰箱冷冻48h,再将其放入-50℃的真空冷冻干燥机中36h,最后紫外灭菌2h。
本发明的一种实施方式中，所述步骤7中所采用的改性处理方法为将灭菌好的支架接枝不同浓度（0.5-10μg/ml）的YIGSR多肽，接枝时间为1h。
与现有技术相比，本发明的一种用于3D生物打印水凝胶支架及其制备方法，具有以下有益效果：
1、本发明的水凝胶支架可模拟细胞的三维生长环境，利于细胞的附着，可促进细胞的生长和增殖；
2、本发明中，具备生物相容性、无毒性和可剪切稀化行为的结冷胶能够和可塑性的可溶性结冷胶的复合支架满足支架移植的要求，可应用于神经再生。
附图说明
图1是本发明中组织再生的3D生物打印水凝胶支架制备示意图；
图2是本发明中实施例1所得的组织再生的3D生物打印水凝胶支架示意图；
图3是本发明中实施例2所得的组织再生的3D生物打印水凝胶支架示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
复合支架3D打印料由以下质量份的原料制得：
结冷胶16份
可溶性淀粉4份
水80份
本发明实例中，水为超纯水，可避免离子对支架的损伤。
本发明实例中，结冷胶为食品级，耐热、耐酸性能良好，对酶的稳定性亦高。加热即溶解成透明的溶液，冷却后，形成透明且坚实的凝胶。适用于熔融挤出3D打印。
本发明实例中，淀粉为可溶性淀粉，不溶于冷水，溶解于沸水中，冷却后形成凝胶。可溶性淀粉与结冷胶的比例为4:1。在这个比例下，打印料能够顺畅的挤出形成丝状物质，按照打印路径堆积成表面光滑且具备完整结构的复合支架。
具体步骤如下：
步骤1：在超纯水中加入16g的结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末4g，将其配制成结冷胶和淀粉混合溶液，其中温度为90℃，搅拌速度为1000rpm/min,搅拌时间为40min，如果天气较冷，可搅拌1h；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料；
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，导入的3D打印模型为1.5cm×1.5cm×0.3cm的长方体，3D打印机的打印速度为15mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为0.74mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.11MPa，得到复合支架；
步骤6：将打印好的支架放入-20℃进行定型，然后灭菌处理；
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
实施例2：
复合支架3D打印料由以下质量份的原料制得：
结冷胶16份
可溶性淀粉5.33份
水8.67份
本发明实例中，淀粉为可溶性淀粉，不溶于冷水，溶解于沸水中，冷却后形成凝胶。可溶性淀粉与结冷胶的比例为3:1。在这个比例下，打印料能够顺畅的挤出形成丝状物质，按照打印路径堆积成表面光滑且具备完整结构的复合支架。
本发明实例中，提供的3D打印料组分配比合理，在打印过程中凝胶速度快，能够快速成型，打印出的支架结构完整。
本发明所述的3D打印料的制备方法和后续处理包括:
步骤1：在超纯水中加入16g的结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末5.33g，将其配制成结冷胶和淀粉混合溶液，其中温度为90℃，搅拌速度为1000rpm/min,搅拌时间为40min，如果天气较冷，可搅拌1h；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料。
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，导入的3D打印模型为1.5cm×1.5cm×0.3cm的长方体，3D打印机的打印速度为15mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为0.74mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.11MPa，得到复合支架。
步骤6：将打印好的支架放入-20℃进行定型，然后灭菌处理。
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
实施例3：
复合支架3D打印料由以下质量份的原料制得：
结冷胶16份
可溶性淀粉8份
水76份
本发明实例中，淀粉为可溶性淀粉，不溶于冷水，溶解于沸水中，冷却后形成凝胶。可溶性淀粉与结冷胶的比例为2:1。在这个比例下，打印料能够顺畅的挤出形成丝状物质，按照打印路径堆积成表面光滑且具备完整结构的复合支架。
本发明实例中，提供的3D打印料组分配比合理，在打印过程中凝胶速度快，能够快速成型，打印出的支架结构完整。
本发明所述的3D打印料的制备方法和后续处理包括:
步骤1：在超纯水中加入16g的结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末8g，将其配制成结冷胶和淀粉混合溶液，其中温度为90℃，搅拌速度为1000rpm/min,搅拌时间为40min，如果天气较冷，可搅拌1h；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料。
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，导入的3D打印模型为2cm×2cm×0.5cm的长方体，3D打印机的打印速度为20mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为1mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.2MPa，得到复合支架。
步骤6：将打印好的支架放入-20℃进行定型，然后灭菌处理。
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
实施例4：
复合支架3D打印料由以下质量份的原料制得：
结冷胶16份
可溶性淀粉16份
水70份
本发明实例中，淀粉为可溶性淀粉，不溶于冷水，溶解于沸水中，冷却后形成凝胶。可溶性淀粉与结冷胶的比例为1:1。在这个比例下，打印料能够顺畅的挤出形成丝状物质，按照打印路径堆积成表面光滑且具备完整结构的复合支架。
本发明实例中，提供的3D打印料组分配比合理，在打印过程中凝胶速度快，能够快速成型，打印出的支架结构完整。
本发明所述的3D打印料的制备方法和后续处理包括:
步骤1：在超纯水中加入16g的结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末16g，将其配制成结冷胶和淀粉混合溶液，其中温度为90℃，搅拌速度为1000rpm/min,搅拌时间为40min，如果天气较冷，可搅拌1h；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料。
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，导入的3D打印模型为2cm×2cm×0.5cm的长方体，3D打印机的打印速度为20mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为1mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.3MPa，得到复合支架。
步骤6：将打印好的支架放入-20℃进行定型，然后灭菌处理。
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
本发明涉及组织工程领域，提供一种可应用于组织再生3D打印的结冷胶和可溶性淀粉的复合支架的制备方法。打印料是按照不同比例将结冷胶和淀粉进行混合，打印出表面光滑且具完整结构的复合支架。具体是结合结冷胶的生物相容性和可剪切稀化行为特性和淀粉的塑性特点，制备复合组织工程再生要求的支架。模拟体内细胞三维生长空间，让细胞能够充分生长和增殖。
Claims (10)
1.一种应用于组织再生的3生物打印水凝胶支架，其特征在于：所述应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架由结冷胶和可溶性淀粉复合而成。
2.根据权利要求1所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：在超纯水中加入结冷胶粉末，制备结冷胶溶液；
步骤2：基于步骤1的基础上，称取可溶性淀粉粉末，将其加入结冷胶溶液中配制成结冷胶和淀粉混合溶液；
步骤3：将步骤2的混合溶液，倒入50ml离心管中，在室温条件下放置冷却；
步骤4：将冷却过后的结冷胶和淀粉混合溶液放入4℃冰箱过夜，得到用于制备3D生物打印水凝胶支架的原料；
步骤5：将冷却的混合原料放入基于挤出的3D打印机料筒中，按照已经导入的模型进行打印，即得复合支架；
步骤6：将打印好的支架进行定型灭菌处理；
步骤7：对灭菌好的支架进行改性处理，达到对支架功能改性的目的，然后即可接种细胞。
3.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤1中超纯水和结冷胶的质量比例为70-100:16。
4.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤2中超纯水、结冷胶和可溶性淀粉的质量比例为70~100:16:4~16；制备结冷胶和淀粉混合溶液的水浴温度为90~100℃；其中，制备结冷胶和淀粉混合溶液需要搅拌30~40min。
5.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤2中制备结冷胶和淀粉混合溶液需要搅拌速度为1000rpm。
6.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤3中制备好的结冷胶和淀粉混合溶液需要在室温条件下冷却2h后，再放入50ml离心管中继续冷却1h。
7.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤5中导入的3D打印模型为不同边长的长方体或者正方体，所采用的模型制作软件为Solidworks。
8.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤5中3D打印机的设置：打印速度为15~20mm/s,喷头温度240℃，平台温度17℃，打印针头直径为0.74mm,打印层厚1mm,填充距离为2mm,气压为0.11~0.3MPa。
9.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤6中将打印好的支架放入-20℃冰箱冷冻48h,再将其放入-50℃的真空冷冻干燥机中36h,最后紫外灭菌2h。
10.根据权利要求2所述的一种应用于组织再生的3D生物打印水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤7中所采用的改性处理方法为将灭菌好的支架物理吸附不同浓度（0.5-10μg/ml）的YIGSR多肽，接枝时间为1h。
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