CN110157818B

CN110157818B - 一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110157818B
Application number: CN201910609770.9A
Authority: CN
Inventors: 李祥; 赵桂英; 牛元力; 龙罡; 富国文; 李志勋; 秦建鹏; 邱丙姗
Original assignee: Yunnan Dongheng Economic And Trade Group Pig Breeding Co ltd; Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Dongheng Economic And Trade Group Pig Breeding Co ltd; Yunnan Agricultural University
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2039-07-08
Also published as: CN110157818A

Abstract

本发明公开了一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记，所述分子标记包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中第63位的碱基是C或T，第92bp处的碱基是G或A。当利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物组合对该分子标记进行PCR扩增，并利用Taq I限制性内切酶处理扩增产物后，得到不同的条带类型。如果包括大小分别为287bp、152bp、124bp和28bp的四个条带，则可鉴定该猪具有眼肌高产性状。利用此分子标记可以进行眼肌高产性状猪的辅助选育，并能辅助选育瘦肉率高及胴体品质好的猪，尤其是大河乌猪，并能显著缩短选育进程。

Description

一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及动物育种领域，具体地，涉及一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

猪肉组成我国饮食文化的重要元素，是我国居民动物蛋白的主要来源之一，对居民的生活有着重要影响。我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国，生猪饲养量和猪肉消费量约占世界总量的50％，在我国猪肉占肉类总消费量的比重长期保持在60％以上，目前人均猪肉消费量达40kg。虽然我国的猪肉消费量已达到相当高的水平，但是随着人们生活水平的提高，对猪肉品质的要求也越来越高，因此在生猪养殖中改善猪肉品质是非常重要的。猪的肉质性状由微效多基因控制，是典型的数量性状，其遗传力在0.15-0.30之间，有的性状达0.50左右，通过常规选育改进胴体、肉质品质进程缓慢。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人以大河乌猪为实验材料，目的是提供一种眼肌面积高产基因型，为大河乌猪提高瘦肉率及胴体品质的选育提供理论依据，缩短选育进程。发明人意外地发现，大河乌猪MSTN基因第3外显子存在2个突变位点并产生两个Taq I酶的切割位点，经酶切后呈现多态性，可分为CTGA基因型与CTGG基因型。进一步通过将大河乌猪MSTN基因第3外显子的多态性与眼肌面积的关联分析，意想不到地发现，CTGG基因型的眼肌面积极显著高于CTGA基因型，即表明MSTN基因第3外显子多态性对眼肌面积有显著影响，从而完成本发明。

本发明一方面提供一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记，该分子标记包括SEQID NO.1所示核苷酸序列，其中第63位的碱基是C或T，第92bp处的碱基是G或A。

在本发明的一些实施方案中，所述分子标记为猪MSTN基因第3外显子的一部分。

在本发明的一些实施方案中，所述分子标记为猪MSTN基因第3外显子。

本发明的第二方面提供检测本发明第一方面所述分子标记的试剂在制备用于鉴定猪眼肌高产性状的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂包括能够特异性扩增具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因片段的引物组合和Taq I限制性内切酶。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物。

本发明的第三方面提供一种用于鉴定猪眼肌高产性状的试剂盒，包括本发明第一方面所述分子标记的试剂。

本发明的第四方面提供一种利用本发明第一方面所述的分子标记鉴定待测猪眼肌高产性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得所述待测猪的组织样本；

(2)扩增本发明第一方面所述的分子标记；

(3)利用Taq I限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物；

(4)凝胶电泳观察步骤(3)限制性内切酶处理后得到的酶切产物，

如果酶切产物包括大小分别为287bp、152bp、124bp和28bp的四个条带，则所述待测猪具有眼肌高产性状；如果酶切产物为其他类型，则所述猪不具有眼肌高产性状。

在本发明的一些实施方案中，所述分子标记具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

在本发明的实施方案中，所述组织样本为耳组织样本。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中利用具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物扩增本发明第一方面所述的分子标记。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的反应体系为：DNA模板2μL，引物正向和反向各1μL，1.1×T3Supre PCR Mix 21.5μL。所述扩增的扩增程序为98℃预变性2min30s；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸6s，35个循环；72℃保温2min，4℃保存。

在本发明的又一些具体实施方案中，所述限制性内切酶处理的体系为：PCR产物19μL，限制性内切酶Taq I 1μL，10×酶切反应Buffer 2μL，加ddH2O至25μL。所述限制性内切酶处理的程序为37℃6h。

在本发明的一些实施方案中，如果酶切产物包括大小分别为439bp、315bp、287bp、152bp、124bp、28bp的六个条带，则所述待测猪不具有眼肌高产性状。

在本发明中，所述猪可以是任意品种的家猪，优选为大河乌猪。

在本发明中，所述眼肌高产是指眼肌面积高于一定域值。在本发明的一些实施方案中，所述眼肌高产是指眼肌面积不小于31.60m²。

本发明的有益效果

本发明提供了一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用，相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明通过简单的PCR扩增和酶切处理即可鉴定猪是否具有眼肌高产性状，操作简便，时间较快。

利用本发明的分子标记可以进行眼肌高产性状猪的辅助选育，并能辅助选育瘦肉率高及胴体品质好的猪，尤其是大河乌猪，并能显著缩短选育进程。

附图说明

图1示出了大河乌猪MSTN基因第3外显子突变位点。

图2示出了部分大河乌猪全基因组DNA凝胶电泳检测结果。

图3示出了部分大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR扩增产物凝胶电泳检测结果。

图4示出了部分大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR扩增产物酶切产物电泳检测结果。TCGA(1、2、3、6、7、8、9)：439bp、315bp、287bp、152bp、124bp、28bp；TCGG(4、5、10)：287bp、152bp、124bp、28bp。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

1试验时间、地点

本实施例于2019年在云南农业大学动物科学技术学院318猪生产研究室进行。

2实验材料

2.1样品采集

采集大河乌猪活体耳组织79头，采集的耳组织放入准备好的1.5mL的Eppendorf试管中，再加入75％乙醇，-20℃储存，备用。采集的大河乌猪是不同家系，同胎次，产仔日期相近，饲养管理、环境条件一致，体重达100kg左右的育肥猪。样品是由云南东恒经贸集团猪育种有限公司提供。

2.2眼肌面积的测定

将采耳组织后的79头大河乌猪屠宰，测定其眼肌面积，测定部位是胸腰椎结合处，测定眼肌的长、高(眼肌面积＝长×高×0.7)，并做好相关记录。

3耳组织中DNA的提取

提取耳组织中DNA的方法采用常规酚/氯仿法，具体参照《分子克隆实验指南》。

4DNA原液的检测

检测时制备1％的琼脂糖凝胶进行电泳，取4μL待检测的DNA原液和1μL10×Loading buffer混合进行点样，第一孔加入DNA Marker(DL 2000)5μL作为参照，120V稳压电泳20min，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察有无DNA条带及亮度情况，以检测DNA是否提取成功，将提取成功的DNA原液储于4℃待用。

大河乌猪耳样中提取的DNA原液经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察，结果显示基因组DNA条带清晰明亮、整齐没有拖尾现象，浓度均匀、质量较好，符合PCR扩增实验要求(如图2)。

5大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR引物的设计与合成

根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公布的猪MSTN基因序列(GENEBANK ID：EF490990)，选取一段包含第3外显子的序列，长度为439bp(SEQID NO.1)。

AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCTATTGCTAACTATTAACTCTTCTTTCATTTTCACACAGAATCCCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACACACCAAAAAGATCCAGGAGAGATTTTGGACTCGACTGTGATGAGCACTCAACAGAATCTCGATGCTGTCGTTACCCTCTAACTGTGGATTTTGAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGAGTGTGAATTTGTATTTTTACAAAAATACCCTCACACTCATCTTGTGCACCAAGCAAACCCCAGAGGTTCAGCAGGCCCCTGCTGTACTCCCACAAAGATGTCTCCAATCAATATGCTATATTTTAATGGCAAAGAACAAATAATATATGGGAAAATTCCAGCCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGCTC

使用NCBI blast功能查找基因突变位点，发现MSTN基因第3外显子有两个突变位点，一是第3外显子63bp处C→T的突变，二是第3外显子92bp处G→A的突变，如图1。

使用DNA CLUB软件查找酶切位点发现突变的两个点都位于TaqI酶识别的限制性位点(TCGA)，可将基因型分为9种，各基因型定义见表1。

表1大河乌猪MSTN基因第3外显子的基因分型

根据引物设计的一般原则使用Premier 5.0软件设计大河乌猪MSTN基因第3外显子的引物(引物由擎科生物技术有限公司合成)，引物序列见表2。

表2大河乌猪MSTN基因第3外显子的引物序列与退火温度

6大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR反应体系和反应过程

反应体系中采用1.1×T3Super PCR Mix试剂，反应体积为25μL，见表3；反应过程见表4。

表3大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR反应体系

表4大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR反应过程

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察，结果如图3。大河乌猪MSTN基因第3外显子的PCR产物均为439bp的单一条带，无非特异性扩增，条带清晰、明亮，符合所要扩增的目的片段大小，可以进行后续的酶切实验。

7大河乌猪MSTN基因第3外显子PCR-TaqI-RFLP的反应体系和过程

反应体系中采用10×TaqI buffer试剂，反应体积为25μL，见表5；反应过程见表6。

表5大河乌猪MSTN基因第3外显子酶切反应体系

表6大河乌猪MSTN基因内切酶种类和酶切反应时间

8酶切反应产物的检测

检测时制备3％的琼脂糖凝胶进行电泳，上样量为4μL，第一孔加入DNAMarker(DL500)5μL作为参照，60V稳压电泳90min。电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察只检测到两种基因型，结果见表7。

表7大河乌猪酶切反应产物

酶切产物经3％的琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察，结果如图4，可见PCR产物经限制性内切酶TaqI酶切后呈现多态性，分为2种基因型，一种是含有439bp、315bp、287bp、152bp、124bp、28bp六个条带的CTGA基因型，另一种是含有287bp、152bp、124bp、28bp四个条带的CTGG基因型。因28bp片段长度过小，电泳时跑出凝胶，无法观测到，但不影响基因型的判断。

9大河乌猪MSTN基因第3外显子基因型与眼肌面积关联分析

使用Excel表格，根据大河乌猪基因型，整理眼肌面积和屠宰体重的原始数据，用SAS9.0软件的GLM(General Linear Model))过程，配合下列回归方程

进行协方差分析，数据表示为平均值±标准误

眼肌面积(y)与屠宰体重(x)间直线回归方程：y＝14.98+0.16x

CTGA基因型的大河乌猪眼肌面积为27.23±0.56cm₂，样本数为69头；CTGG基因型的大河乌猪眼肌面积为31.60±1.48cm²，样本数为10头。CTGG基因型大河乌猪的眼肌面积比CTGA基因型大河乌猪大4.37cm²，差异极显著(P<0.01)，见表8。

表8大河乌猪MSTN基因第3外显子基因型与眼肌面积的关联分析

注：同列肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南东恒经贸集团猪育种有限公司/云南农业大学

<120> 一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用

<130> XY-2019-1-W-061

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggtaggaa agtgattcag gatctattgc taactattaa ctcttctttc attttcacac 60

agaatccctt tttagaagtc aaggtaacag acacaccaaa aagatccagg agagattttg 120

gactcgactg tgatgagcac tcaacagaat ctcgatgctg tcgttaccct ctaactgtgg 180

attttgaagc ttttggatgg gactggatta ttgcacccaa aagatataag gccaattact 240

gctctggaga gtgtgaattt gtatttttac aaaaataccc tcacactcat cttgtgcacc 300

aagcaaaccc cagaggttca gcaggcccct gctgtactcc cacaaagatg tctccaatca 360

atatgctata ttttaatggc aaagaacaaa taatatatgg gaaaattcca gccatggtag 420

tagatcgctg tgggtgctc 439

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggtaggaa agtgattcag gat 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagcacccac agcgatctac 20

Claims

1.检测分子标记的试剂在制备用于鉴定大河乌猪眼肌高产性状的试剂盒中的应用，所述分子标记位于猪MSTN基因第3外显子92bp处，第92bp处的碱基是G或A。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括扩增具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的基因片段的引物组合和Taq I限制性内切酶，所述引物组合包括具有SEQ IDNO. 2所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的下游引物。

3.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定待测大河乌猪眼肌高产性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得所述待测猪的组织样本；

（2）利用具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的下游引物扩增权利要求1所述的分子标记；

（3）利用Taq I限制性内切酶处理步骤（2）得到的扩增产物；

（4）凝胶电泳观察步骤（3）限制性内切酶处理后得到的酶切产物，

如果酶切产物包括大小分别为287bp、152bp、124bp和28bp的四个条带，则所述待测猪具有眼肌高产性状；如果酶切产物包括大小分别为439bp、315bp、287bp、152bp、124bp、28bp的六个条带，则所述待测猪不具有眼肌高产性状。