CN110055335B - 一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂盒和快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记、试剂盒和快速鉴定方法。本发明首先通过构建星洲红全同胞罗非鱼家系及结合QTLseq连锁作图技术分析标记与表型关系，确定性别决定QTL区域，进一步设计微卫星引物，最终筛选出星洲红罗非鱼LG1染色体上与性别性状紧密连锁的微卫星标记‑SSR147微卫星分子标记引物，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。通过应用性别决定区紧密连锁的微卫星分子标记引物SSR147开展雌雄鱼的筛选与鉴定，能够高效高准确率的鉴定星洲红罗非鱼的雌雄性别，从而能提高选育的准确性。因此本发明的研究能为开展星洲红罗非鱼全雄苗种生产奠定基础。

Description

一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂 盒和快速鉴定方法

技术领域：

本发明属于水产遗传育种领域，具体涉及一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂盒和快速鉴定方法。

背景技术：

星洲红鱼具有重要的经济价值，是罗非鱼属种间杂交选育的一个优质品种，在广东首先引进试养成功,其生长速度比普通罗非鱼快30％以上。星洲红鱼体色全红,但有分化，如桃红、桔红等色，有花斑，极少黑斑，食性为杂食性，耐低温，肉质爽甜，无肌间刺，养殖优势明显。由于其具有很高的环境适应性、好的肉质及体色，近年来，星洲红鱼养殖区域不断扩大，产量大幅增加。目前已成为我国水产养殖优质品种。

星洲红鱼雌雄鱼生长存在明显的差异。雄鱼比雌鱼生长快，一般雄鱼体重比雌鱼重30％-50％。另外，由于星洲红鱼繁殖周期短、成熟早，养殖过程中容易造成繁殖过剩、密度过大、个体过小等不利情况，从而影响养殖产量的提高。为了避免过度繁殖又可以利用雄鱼的生长优势，生产上普遍采用激素对星洲红鱼进行性别控制，生产雄性鱼苗，养殖全雄鱼。

单性全雄鱼的生产主要有以下几种方法:人工定性、杂交、遗传操作、激素性逆转处理等。目前使用雄性激素，如甲基睾丸酮(17-methyltestosterone)诱导遗传上的雌鱼转换为功能上的雄鱼生产全雄星洲红鱼被认为是最有效及经济可行的方法。然而,近年来对罗非鱼的研究发现停药后甲基睾丸酮后期消解较为缓慢，且甲基睾丸酮浓度越大，在鱼苗体内残留时间也越长。如果不能确保上市之前完全代谢掉，甲基睾丸酮在水产动物体内很少的残留都可对人体造成危害。同时，激素的使用也造成了一些环境问题，如水产行业水底沉淀物中甲基睾丸酮的积累，能造成阴阳鱼和不育雌鱼的产生及形态异常，内分泌紊乱，激素水平改变等负面影响，而且对实际进行激素处理的水产工作者的身体健康也会有很大的影响。因此，由于其潜在的食品安全性及环境危害性，许多国家包括我国农业部规定甲基睾丸酮等激素禁止在鱼类性逆转过程中使用。近年来，人们对水产品质量安全越来越关注和重视，要求越来越高。世界各国特别是发达国家普遍加强了对进口水产品质量的检测。我国水产品的质量安全情况已成为影响其在国际贸易市场上的竞争力的主要因素。生产无公害星洲红鱼水产品，保障星洲红鱼养殖业可持续健康发展的首要条件就是解决星洲红鱼养殖质量控制问题。

星洲红鱼是罗非鱼属种间杂交的一个优质品种，应用前景广阔。然而，由于星洲红鱼遗传背景非常复杂，目前科学家对其性别的决定机制仍然缺乏足够的了解。开展优质超雄星洲红鱼的分子标记辅助选育的首要前提是对其性别性状基因组决定区进行QTL定位，鉴定与性状QTL紧密连锁的分子标记。

发明内容：

本发明的目的是提供一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物。

本发明首先通过构建星洲红全同胞罗非鱼家系及结合QTLseq连锁作图技术分析标记与表型关系，确定性别决定QTL区域，进一步设计微卫星引物，最终筛选出星洲红罗非鱼LG1染色体上与性别性状紧密连锁的微卫星标记-SSR147微卫星分子标记引物，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的星洲红罗非鱼鉴别雌雄鱼的微卫星分子标记引物，如下所示：

F：5'-TACTCTCCCCAACACCCACA-3'；具体序列如SEQ ID NO.1所示；

R：5'-TGCTGCTTACAGACCTTGTGT-3'；具体序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的快速鉴定方法，包括以下步骤：

提取待测星洲红罗非鱼的基因组DNA，利用上述星洲红罗非鱼鉴别雌雄鱼的微卫星分子标记引物作为PCR引物进行PCR扩增，得到扩增产物，然后对扩增产物进行电泳和染色，根据电泳结果判断待测星洲红罗非鱼的性别。

所述的PCR反应，其反应体系是：20μL反应体系，包括10μL PCR Master Mix，6.4μL超纯水，0.8μL PCR上游引物、0.8μL PCR下游引物，2μL模板基因组DNA，所述的PCR，其反应程序是：95℃、3min；95℃、30s；61℃、30s，72℃、15-30s，34个循环。

本发明的第三个目的是提供一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的检测试剂盒，包括PCR引物，PCR反应试剂，所述的PCR引物为：

F：5'-TACTCTCCCCAACACCCACA-3'；

R：5'-TGCTGCTTACAGACCTTGTGT-3'。

相比于现有技术，本发明的优点和效果如下：

通过应用性别决定区紧密连锁的微卫星分子标记引物SSR147开展雌雄鱼的筛选与鉴定，能够高效高准确率的鉴定星洲红罗非鱼的雌雄性别，从而能提高选育的准确性。因此本发明的研究能为开展星洲红罗非鱼全雄苗种生产奠定基础。

附图说明：

图1是QTLseq法定位的星洲红罗非鱼性别QTL区间(Fst＝0.12为基因组水平阈值)；

图2是使用微卫星标记引物SSR147筛选鉴定星洲红罗非鱼遗传雌雄鱼示意图；其中1～12泳道为群体的表型雌性，13～24泳道为群体的表型雄性；可推测K为雄性特异带，J为雌性特异带，雄性基因型为K/J，雌性基因型为J/J。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范畴。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1家系构建

2016年3月份在广东省五龙岗水产发展科技有限公司挑选优质星洲红罗非鱼亲鱼1对成功构建了1个全同胞家系。实验鱼在广州市五龙岗水产发展有限公司进行养殖及实验处理(共204尾)。待星洲红罗非鱼生长至约4个月性腺发育成熟后，通过人工分辨其外生殖器进行表型性别鉴定并记录性别和体重，剪取亲本和子一代的鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-70℃保存备用。同时，基于性别性状，挑选出30尾雌雄鱼作为育种群体(对照)，为每条鱼注射电子标签，记录个体身份信息用于育种。

实施例2基因组DNA来源与制备

1.亲代及子代基因组DNA样品提取

本实验用于性别连锁分子标记的鉴定的样品有：星洲红罗非鱼雌性和雄性亲本、30尾星洲红罗非鱼表型雌性个体及30尾星洲红罗非鱼表型雄性个体。

2.DNA提取方法

(1)亲本DNA

使用东盛基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取的DNA稀释5倍后放入-20℃保存备用。

(2)子一代DNA

a、取一1.5ml的96孔板，置于冰上，每孔加入300μl的Set buffer(10mM TrispH8.0，50mM EDTA pH 8.0，200mM NaCl，0.5％SDS)，50μl蛋白酶K(20mg/ml)；

b、用灭过菌的剪刀剪下3*3mm²大小的鱼鳍样品，放在滤纸上，按压吸干样品上残留的无水乙醇，放入裂解液中；

c、简单离心后放入摇床中，将温度设置为55℃，转速70-100r/min，裂解3hr；

d、取硅胶柱(96孔)，下面用96孔板承接滤液，每孔加入240ul 6M NaI，再加入80μl的裂解液，2000g离心1min，倒去滤液；

e、每孔加入240μl的wash buffer(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA pH7.5，100mMNaCl，50％乙醇)，2000g离心3min后，静置干燥2-5min；

f、每孔加入120μl的纯水，在室温下静置2min后，2000g离心2min得到DNA样品；

g、1％琼脂糖凝胶电泳，120v电泳30min，凝胶成像系统拍照。提取的DNA稀释5倍后放入-20℃保存备用。

实施例3QTL-seq测序与遗传图的制作和性状定位

采用了QTL-seq法进行QTL分析。即在204尾红罗非鱼之中挑选出30尾雄性红罗非鱼和30尾雌性红罗非鱼的DNA样品，每个个体各自提取300ng的量，然后混合成一雌一雄两个大样品，由公司进行基因组测序。使用PoPoolation2软件对对照组中30个雄性个体和30个雌性个体的基因型数据进行连锁作图，鉴定性别性状QTL区间(如图1所示)。

测序结果进行过滤后，利用bowtie2软件将群体中雌雄2个极端性状的pooling样品的序列数据分别与罗非鱼基因组序列进行比对。PoPoolation2软件可用于比较两个群体中等位基因的频率，通过滑动窗口的方法计算基因组范围内的Fst值。PoPoolation2软件使用时的参数设置为min-qual 20，--min-count 5，--max-coverage 500--min-covered-fraction0.0--window-size 10000--step-size 5000。过滤包含SNPs数量少于20的窗口。每个窗口至少有两个最高Fst值超过Fst值阈值时，认为是一个QTL区间。

实施例4微卫星标记开发与群体分析

1.引物设计

在得到性别QTL区间数据之后，从网上下载罗非鱼的序列，搜索高Fst值区间的微卫星标记，然后用软件primer select设计引物。

2.PCR扩增

将得到的核酸样品，配制成10μL mix，6.4μL超纯水，0.8μL上游引物、0.8μL下游引物，2μL样本(模板DNA)的20μL反应体系。PCR反应程序设定：95℃预变性3min，然后95℃30s，退火温度61℃30s，72℃30s，共34个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取3μL产物在琼脂糖胶上电泳检测，然后再取3μL产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后用银染法得到PCR产物的条带。微卫星分子标记引物为SSR147(F：5'-TACTCTCCCCAACACCCACA-3'，R:5'-TGCTGCTTACAGACCTTGTGT-3')。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测

1)制胶

取纯水25ml，5×TBE 4ml，Acr-bis(30％)10.7ml，TEMED 26μl，APS(10％)280μl，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置1-2小时，待其凝固。

2)电泳

待胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次序进行点样，每孔3μl；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600v，继续电泳1.5小时。

3)银染

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500ml的染色液(1％AgNO₃)，染色约5分钟后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5-10秒，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4ml甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷)，显色约10-15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照。以星洲红罗非鱼鉴别雌雄鱼的微卫星分子标记引物SSR147的银染图如图2所示，从图2可以推测K为雄性特异带，J为雌性特异带，雄性基因型为K/J，雌性基因型为J/J。

4.群体基因型与表型数据分析

利用微卫星分子标记引物SSR147对204尾红罗非鱼全同胞家系进行基因型测定。用表格记录每个个体的基因型，并对基因型数据和表型数据进行分析，鉴定与星洲红罗非鱼性别性状紧密连锁的分子标记。结果显示处于Fst值最高区域的微卫星分子标记引物SSR147在204尾红罗非鱼全同胞家系中对于遗传性别为雄性的罗非鱼鉴定的准确率达到92.0％，准确率无法到达100％的原因可能是由于罗非鱼的性别受到许多因素影响。除了遗传因素，在性别分化的过程中，环境中的多种因素如温度、环境激素等也可能使其发生性逆转，导致某些个体的基因型和表现型相悖。

序列表

<110> 中山大学

广东五龙岗水产科技发展有限公司

<120> 一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物、试剂盒和快速鉴定方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactctcccc aacacccaca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctgcttac agaccttgtg t 21

Claims (2)

1.一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的微卫星分子标记引物，其特征在于，引物如下：

F：5'-TACTCTCCCCAACACCCACA-3'；

R：5'- TGCTGCTTACAGACCTTGTGT-3'。

2.一种鉴别星洲红罗非鱼雌雄鱼的检测试剂盒，包括PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物为：

F：5'-TACTCTCCCCAACACCCACA-3'；

R：5'- TGCTGCTTACAGACCTTGTGT-3'。

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