CN119970736A - 组蛋白去乙酰化酶4小分子抑制剂的合成方法和抗血管内皮衰老的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组蛋白去乙酰化酶4小分子抑制剂的合成方法和抗血管内皮衰老的应用。本发明以简便高效的新方法合成了一种新的HDAC4小分子抑制剂，其结构式如下。该HDAC4小分子抑制剂与HDAC4具有较强亲和力，能够显著降低血管内皮细胞的HADC4和P21蛋白与mRNA的表达量以及炎症相关蛋白Il6、CCL2和Il‑1β的mRNA表达量，具有显著的抗血管内皮细胞衰老的作用，并且具有很好的成药性和安全性，可用于制备治疗血管内皮衰老及其相关疾病的药物。

Description

组蛋白去乙酰化酶4小分子抑制剂的合成方法和抗血管内皮 衰老的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体是涉及一种组蛋白去乙酰化酶4小分子抑制剂的合成方法和抗血管内皮衰老的应用。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。本发明的研究团队在前期的研究(Di Yang,Cardiovascular Research(2018)114,1016–1028)中证实HDAC4在血管紧张素II(Ang II)诱导的模型中上调，抑制HDAC4能够显著降低衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretoryphenotype，SASP)因子的表达，如促炎细胞因子(COX2)、白介素6(IL6)、纤连蛋白(VCAM-1)。而炎性衰老逐渐被本领域广泛认可。因此，HDAC4是有效的抑制炎性衰老的表观遗传靶点。

研究表明，HDAC4与血管内皮细胞衰老存在如下关系，一是，影响衰老标志物：HDAC4在血管内皮细胞中可能调控衰老相关的基因表达。例如，它可能影响细胞周期调控因子，从而导致内皮细胞的增殖能力下降，促进衰老。二是，氧化应激：内皮细胞的衰老与氧化应激水平的增加密切相关。HDAC4可能参与了调控与氧化应激相关的信号通路，从而影响内皮细胞的健康状态。三是，促炎反应：HDAC4还可能参与调节促炎因子的表达，炎症是内皮细胞衰老的另一重要促进因素。通过调节炎症反应，HDAC4可能间接影响内皮细胞的衰老过程。因此，针对HDAC4的干预能有助于延缓内皮细胞的衰老(尤其是炎性衰老)，从而改善血管健康。目前，文献报导的HDAC4分子抑制剂的研究还十分缺乏，并且大多数HDAC4抑制剂被报道具有抗肿瘤活性且毒性较大。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种新的HDAC4小分子抑制剂，其可以用于治疗血管内皮衰老等炎症性衰老。

实现上述发明目的的技术方案如下。

本发明的第一个方面，提供了一种环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备组蛋白去乙酰化酶4抑制剂中的应用，所述环二肽化合物的结构式为：

本发明的第二个方面，提供了所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制炎症性衰老的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供了所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备抗血管内皮衰老的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供了所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与血管内皮衰老相关的疾病的药物中的应用。

本发明的第五个方面，提供了一种所述的环二肽化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸在缩合剂和碱的作用下与L-酪氨酸甲酯盐酸盐反应，得到叔丁氧羰基保护的线性二肽；

(2)将所述叔丁氧羰基保护的线性二肽脱除叔丁氧羰基保护基，得到线性二肽；

(3)将所述线性二肽在80℃～100℃的温度下反应成环，得到所述环二肽化合物；

其反应式如下：

本发明具有以下有益效果：

本发明以简便高效的新方法合成了一种新的HDAC4小分子抑制剂(即本发明的环二肽化合物)，其与HDAC4具有较强亲和力，能够显著降低血管内皮细胞的HADC4和P21蛋白与mRNA的表达量以及炎症相关蛋白Il6、CCL2和Il-1β的mRNA表达量，具有显著的抗血管内皮细胞衰老的作用，并且具有很好的成药性和安全性，可用于制备治疗血管内皮衰老及其相关疾病的药物。

本发明的环二肽小分子抑制剂结构简单，合成相对容易，易储存与运输，具有可口服的优势，有望成为有前景的治疗血管内皮衰老及其相关疾病的小分子药物。

附图说明

图1为HDAC4小分子抑制剂结构确证核磁共振氢谱示意图。

图2为HDAC4小分子抑制剂结构确证核磁共振碳谱示意图。

图3为HDAC4小分子抑制剂结构表征质谱示意图。

图4为利用BLI实验检测CPT在不同浓度和HDAC4蛋白的亲和力示意图；图中：曲线a为200μM的结合解离曲线，曲线b为100μM的结合解离曲线，曲线c为50μM的结合解离曲线，曲线d为25μM的结合解离曲线，曲线e为12.25μM的结合解离曲线，曲线f为6.25μM的结合解离曲线；KD:平衡解离常数，Kon:结合常数，Kdis:解离常数，R2:线性回归决定系数。

图5为基于分子对接模拟的CPT与HDAC4蛋白的相互作用位点的示意图。

图6为利用CCK8方法检测不同浓度CPT对大鼠主动脉内皮细胞毒性作用示意图。

图7为HDAC4小分子抑制剂CPT显著降低HADC4和衰老相关蛋白P21的蛋白表达示意图。

图8为HDAC4小分子抑制剂CPT有效降低ROS与细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-Gal表达示意图。

图9为HDAC4小分子抑制剂CPT显著降低衰老与炎症相关蛋白P21，Il6，CCL2，Il-1β的mRNA表达量示意图。

图10为HDAC4小分子抑制剂CPT的成药性研究分析曲线示意图。

图11为CPT动物毒性实验示意图。

图12为HDAC4小分子抑制剂CPT抑制Ang II诱导的衰老模型小鼠的血管厚度示意图。

图13为HDAC4小分子抑制剂CPT抑制Ang II诱导的衰老模型小鼠HDAC4和衰老相关蛋白P21蛋白表达量示意图。

图14为HDAC4小分子抑制剂CPT抑制Ang II诱导的衰老模型小鼠衰老相关蛋白P21，炎症相关蛋白Il6，CCL2和Il-1βmRNA表达量示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。

在本明的一些实施例中涉及到一种环二肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环二肽化合物的结构式为：

在本发明的一些实施例中还涉及到所述的环二肽化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸在缩合剂和碱的作用下与L-酪氨酸甲酯盐酸盐反应，得到叔丁氧羰基保护的线性二肽；

(2)将所述叔丁氧羰基保护的线性二肽脱除叔丁氧羰基保护基，得到线性二肽；

(3)将所述线性二肽在80℃～100℃的温度下反应成环，得到所述环二肽化合物；

其反应式如下：

在其中一些实施例中，所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸和L-酪氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1-1.5。

在其中一些实施例中，所述缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。

在其中一些实施例中，所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1～2：1～2。

在其中一些实施例中，所述碱为N,N-二异丙基乙胺。

在其中一些实施例中，所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸和碱的摩尔比为1：2～4。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述反应在惰性气体的保护下进行。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述反应的温度为0℃～40℃，时间为1～4小时。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂中进行。

在其中一些实施例中，所述二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1：0.8～1.2。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在催化剂的作用下进行，所述催化剂优选为三异丙基硅烷。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在温度为0℃～40℃的条件下进行，时间为20min～2小时。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为异丁醇和甲苯的混合溶剂。

在其中一些实施例中，所述异丁醇和甲苯的体积比为1：0.8～1.2。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述反应的温度为85℃～95℃，时间为2小时～6小时。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述反应在惰性气体的保护下进行。

在其中一些实施例中，所述环二肽化合物的制备方法包括如下步骤：

(1)将所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶解于二氯甲烷中，冷却至0℃～5℃，然后加入所述L-酪氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺，在惰性气体保护和0℃～5℃条件下搅拌20分钟～40分钟，然后在20℃～35℃下搅拌40分钟～80分钟，得到叔丁氧羰基保护的线性二肽；

(2)将所述叔丁氧羰基保护的线性二肽在0℃～5℃下溶解于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂中，并加入催化量的三异丙基硅烷，将所得反应混合物在20℃～35℃下搅拌20分钟～40分钟，得到线性二肽；

(3)将所述线性二肽溶解于异丁醇和甲苯的混合溶剂中，在惰性气体保护和85℃～95℃的条件下回流反应3小时～5小时，得到所述环二肽化合物。

在本发明的一些实施例中还涉及到一种制备预防和/或治疗血管内皮衰老的药物，由活性成分和药物中可接受的辅料制备而成，所述活性成分包含权利要求1所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐。

本发明通生物膜层干涉实验(Bio-layerinterferometry，BLI)测试了所述环二肽化合物与HDAC4蛋白的亲和力；从2～3月龄SD大鼠胸主动脉分离大鼠主动脉内皮细胞(RaECs)测试了环二肽小分子化合物对RaECs的细胞毒性；经计算机分析了HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物的成药性；用C57小鼠测试了HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物安全性；建立了AngII诱导的衰老模型，灌胃给药4周后取材，收集主动脉血管并观察、统计、分析。这些测试结果显示，HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物与HDAC4蛋白呈剂量依赖性结合；HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物在250uM剂量内对大鼠主动脉内皮细胞无毒，能有效抑制HADC4和衰老相关蛋白P21的蛋白表达，能有效降低ROS与细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-Gal的表达，能显著降低衰老与炎症相关蛋白P21、Il6、CCL2和Il-1β的mRNA表达量，具有显著的抗血管内皮细胞衰老的作用；一次性给予C57小鼠HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物最大剂量灌胃给药后观察十四天，十四天内无一例小鼠死亡；HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物能抑制AngII诱导的衰老模型小鼠的血管厚度，能够在体内降低主动脉血管的HDAC4和P21蛋白表达量以及炎症相关蛋白Il6，CCL2和Il-1β的mRNA表达量。以上结果证明，本发明提供的HDAC4小分子抑制剂环二肽化合物对血管内皮衰老有显著治疗作用，并且安全有效，可用于制备治疗血管内皮衰老及其相关疾病的药物。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)小分子抑制剂(CPT)合成

用电子分析天平称取N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(Boc-L-Phe-OH,530mg,2mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT,405mg,3mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,575mg,3mmol)置于100mL烧瓶中，加入二氯甲烷(40mL)，搅拌使其溶解并冷却至0℃，然后在搅拌条件下缓慢加入L-酪氨酸甲酯盐酸盐(510mg,2.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,775mg,6mmol)，在反应体系内充入氮气，在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌1小时，通过TLC监测反应进程，待反应完成后，将反应混合物减压浓缩蒸干，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得到Boc保护的线性二肽(Boc-L-Phe-L-Tyr-OCH₃·HCl)，(815mg,85％)，无需进一步纯化，粗品即可用于下一步。

称取Boc保护的线性二肽(Boc-L-Phe-L-Tyr-OCH₃·HCl,480mg，1mmol)置于50mL烧瓶中，在0℃下溶解于二氯甲烷/三氟乙酸(DCM/TFA，1:1v/v，20mL)中，并加入催化量的三异丙基硅烷(TIPS,0.5mL)。将所得反应混合物在室温下搅拌30分钟。通过TLC监测反应进程，待反应完成后，将反应混合物减压蒸干并与甲苯共蒸发三次，得到线性二肽(H-L-Phe-L-Tyr-OCH₃·HCl)，(340mg,90％)，无需进一步纯化即可用于环化。

称取线性二肽(H-L-Phe-L-Tyr-OCH₃·HCl,308mg，0.9mmol)置于50mL烧瓶中，加入异丁醇/甲苯(1:1v/v，20mL)，搅拌使其溶解。在氮气保护下，将混合物在90℃下回流加热4小时。将反应混合物冷却至室温，过滤沉淀物，用冰冷乙醇(3×30mL)洗涤，真空干燥,得到组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)小分子抑制剂(本发明中命名为为CPT)223mg，产率为80％。核磁共振谱(如图1和图2所示)：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.24(s,1H),7.87-7.82(m,2H),7.27(t,J＝7.4Hz,2H),7.20(t,J＝7.4Hz,1H),7.03(d,J＝6.9Hz,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(d,J＝8.6Hz,2H),3.96–3.92(m,1H),3.91-3.87(m,1H),2.57(dd,J＝13.6,4.8Hz,1H),2.52(d,J＝4.6Hz,1H),2.18(ddd,J＝13.7,9.7,6.4Hz,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ166.36,156.15,136.68,130.89,129.80,128.25,126.52,126.46,115.08,55.77,55.45,38.58。分子量如图3所示，其分子式为：C₁₈H₁₈N₂O₃。

实施例2CPT与HDAC4蛋白结合力的实验

方法：将HDAC4-HIS标签蛋白固定在Ni-NTA生物传感器(Fortebio)上，CPT被稀释成不同的浓度(从6.25μM到200μM)。使用PBS进行基线设置后，将生物传感器尖端浸入含有化合物CPT的连续稀释液的孔中，进行300秒的结合，然后进行180秒的解离步骤，保存数据，使用数据分析软件9.0(Fortebio)计算KD值，以实时模式监测结合和解离曲线。

结果请参阅图4，曲线a为200μM的结合解离曲线，曲线b为100μM的结合解离曲线，曲线c为50μM的结合解离曲线，曲线d为25μM的结合解离曲线，曲线e为12.25μM的结合解离曲线，曲线f为6.25μM的结合解离曲线；根据结合解离曲线分析计算出线性回归决定系数R²＝0.8279，HDAC4和CPT之间相互作用的平衡解离常数(KD)为8.26μM，CPT与HDAC4的结合、解离呈剂量依赖，亲和力强。

实施例3CPT与HDAC4蛋白的相互作用位点

方法：CPT与HDAC4最佳结合模式和相互作用通过软件虚拟筛选结果导出并用Pymol(Version2.5.2)软件进行可视化分析。CPT与HDAC4结合能为53kcal/mol，结合口袋合理，有利于维持CPT与HDAC4稳定的构象，如图5所示，活性结合区域包括HIS-802,GLY-811,PHE-812,HIS-842和RPO-942等多个氨基酸残基，能够形成氢键，范德华力和Pi-Pi共轭等多种相互作用，其中GLY-811,PHE-812,HIS-842和RPO-942为维持CPT与HDAC4复合物的稳定性具有重要意义，尤其PHE-812和HIS-842可能是CPT产生药理作用的关键位点。

实施例4CPT细胞毒性实验

方法：从2～3月龄SD大鼠胸主动脉分离大鼠主动脉内皮细胞(RaECs)，即前3代RaECs培养于内皮培养基ECM，其中内皮培养基ECM由培养液、浓度为5％胎牛血清FBS和浓度为1％内皮细胞生长补充剂ECGS组成；第三代后培养于混合培养液中，混合培养液由培养基DMEM、浓度为20％胎牛血清FBS和浓度为1％青霉素/链霉素混合而成；细胞在37℃、浓度为5％CO₂的湿气培养箱中培养备用。实验前24小时，将RaEC(1x 10⁴细胞/孔)接种到96孔板中，并用不同浓度的100μL CPT溶液替换培养基，重复5个孔。然后将细胞再孵育24小时。用PBS清洁每个孔，随后用新鲜配制的含10％CCK-8(NCM Biotech，中国)的无血清培养基替换，然后将细胞再孵育4小时。使用多模式平板读数仪(Bioreader，德国)在450nm的波长下进行光密度读数。读取相对于空白孔的吸光度。通过(OD450测试-OD450空白)/(OD450对照-OD450空白)*100％计算每个孔中的细胞存活率(％)。使用无毒剂量来评估CPT对RaECs的影响。

如图6所示，CPT对大鼠主动脉内皮细胞在250uM剂量内没有明显增殖抑制作用。

实施例5体外衰老模型的建立与使用蛋白免疫印迹法检测蛋白水平变化

方法：在建模前12小时，仅给予无血清培养液进行饥饿培养各组(包括对照组、模型组、给药组)RaECs细胞，随后模型组和给药组给予终浓度为2μM/L血管紧张素II刺激RaECs细胞至少48小时，每隔24小时换一次新的无血清培养液，给药组的CPT的浓度分别为12.5μM，25μM，50μM。造模及给药结束后，细胞在加入1mM苯甲基磺酰氟的冰冷RIPA缓冲液中裂解；蛋白质在4℃下以12000rpm离心15分钟获得；等量的10μg蛋白加载到浓度为10-15％的SDS-PAGE单元上，通过电印迹转移到硝化纤维素NC膜上；NC膜用5％脱脂奶粉再封闭，用1∶1000稀释的一抗染色，然后在4℃孵育过夜；然后用过氧化物酶偶联二抗体在1:10000稀释下检测细胞膜；然后用增强化学发光试剂检测抗原-抗体复合物，使用AMERSHAmershamImage Quant 800系统进行可视化，并使用Image J软件进行分析。

分析结果如图7所示，CPT能有效降低RaECs HADC4和衰老相关蛋白P21的蛋白表达量。

实施例6细胞内活性氧(ROS)与细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-Gal检测

方法：ROS检测试剂盒购自Beyotime，将RaEC细胞以5×10⁴/孔的密度接种在96板中。接种一天后，用不同剂量的Ang II(2μM)和CPT溶液处理培养孔24小时。为了获得解离的小胶质细胞用于ROS测定，首先去除培养基并用PBS将细胞洗涤三次。将DCFH-DA用无血清培养基稀释至最终浓度为10μM，加入培养物中，在37℃下孵育20分钟。使用IN CellAnalyzer6000平板读数仪(Life，美国)在488nm处读取荧光。荧光强度指示细胞内的ROS。

如图8所示，CPT能明显降低ROS与细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-Gal的表达量。

实施例7体外衰老模型的建立与mRNA水平检测

方法：在建模前12小时，仅给予无血清培养液进行饥饿培养各组(包括对照组、模型组、给药组)RaECs细胞，随后模型组和给药组给予终浓度为2μM/L血管紧张素II刺激RaECs细胞至少48小时，每隔24小时换一次新的无血清培养液，给药组的CPT浓度分别为12.5μM，25μM，50μM，采用β-烟酰胺单核苷酸(NMN)作为阳性对照药，使用浓度是50μM。给予血管紧张素II刺激RaECs细胞至少48小时。刺激结束后，总RNA用TRIzol试剂分离获得；每个样品约1μg总RNA被transgene试剂盒反转录为cDNA，然后使用UltraSYBR混合液进行聚合酶链式反应PCR，从而进行体外衰老标志物与炎症指标的检测。

如图9所示，CPT能够显著降低衰老与炎症相关蛋白P21、Il6、CCL2和Il-1β的mRNA表达。

实施例8HDAC4抑制剂CPT的ADMET预测

方法：用Discovery Studio软件计算ADMET(药物的吸收Absorption,分配Distribution,代谢Metabolism,排泄Excretion和毒性Toxicity)性质，即25摄氏度下水溶解度(aqueous solubility)；血脑屏障通透性(Bloodbrainbarrierpenetration,BBB)；细胞色素P4502D6抑制性(Cytochrome P4502D6inhibition)，肝毒性(hepatotoxicity)；人类肠道吸收性(human intestinal absorption,HIA)，血浆蛋白结合率(plasmaproteinbinding)。通过Discovery Studio中Small Molecules|CalculateMolecular Properties|ADMET Descriptors，参数选择默认设置，计算CPT的ADMET性质。

其结果如图10所示，该ADMET plot是一个ADMET_PSA_2D vs ADMET_AlogP98的二维图，分别表示了血脑屏障通透性(BBB)模型95％和99％的置信区间，以及人体肠道吸收性(HIA)模型95％和99％的置信区间，实验结果表明，CPT具有较好的ADMET性质，成药性好。

实施例9CPT动物毒性实验

C57BL/6J小鼠分组：随机挑选周龄6周，体重22-26g，状态良好的C57BL/6J小鼠16只，随机分为空白组和给药组(n＝10)。经灌胃一次给予最大量2g/kg/次，连续观察14天。

如图11所示，实验结果显示给药后14天中无一例死亡，小鼠摄食、摄水、自发活动等未见异常。CPT的LD50>2g/kg。

实施例10CPT对Ang II诱导的衰老小鼠模型的治疗作用

小鼠分组：随机挑选周龄6周，体重22-26g，状态良好的C57BL/6J小鼠48只，随机分成6组(n＝8)，即：对照组、血管紧张素II输注组、CPT(胃管内分别为100、50、25mg/Kg/天)组和阳性对照(β-烟酰胺单核苷酸(NMN)，100mg/Kg/天，胃管内)组。

实验方法：用异氟烷麻醉小鼠，然后去掉背部的毛发，用手术刀切开1-2cm的切口，皮下植入Alzet渗透微型泵(型号2004；ALZA Scientific Products，MountainView，CA，USA)后缝合。对照组的渗透微型泵中仅含有生理盐水，模型组、给药组和阳性对照的渗透微型泵装有溶于生理盐水的血管紧张素II。给药组灌胃给予25-100mg/Kg/day药物浓度的CPT，阳性对照灌胃给予100mg/Kg/day药物浓度的NMN阳性对照药物。给药时间由造模7天后开始给药，即给药3周，共计21天。小鼠持续输注生理盐水或血管紧张素II(1.5mg/kg/d)4周后，通过颈脱位法对小鼠实施安乐死，并将每只小鼠的主动脉切成2段。将其中一段浸入液氮，并随后储存在-80℃下，使用时通过Trizol法以提取总RNA进行基因表达的检测。将另一段用4％多聚甲醛固定过夜，然后嵌入石蜡中进行免疫荧光染色，在本实例中进行了HDAC4和p21的免疫荧光双染实验。

如图12和图13所示，CPT能降低Ang II诱导的衰老模型小鼠主动脉厚度，降低小鼠体内主动脉HDAC4，衰老相关蛋白P21蛋白表达以及炎症相关蛋白Il6、CCL2和Il-1β的mRNA表达量(图14)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备组蛋白去乙酰化酶4抑制剂中的应用，其特征在于，所述环二肽化合物的结构式为：

2.权利要求1所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制炎症性衰老的药物中的应用。

3.权利要求1所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备抗血管内皮衰老的药物中的应用。

4.权利要求1所述的环二肽化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与血管内皮衰老相关的疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述环二肽化合物能够降低血管内皮细胞中衰老相关蛋白P21的蛋白表达量；和/或，

所述环二肽化合物能够降低血管内皮细胞中衰老相关蛋白P21的mRNA表达量；和/或，

所述环二肽化合物能够降低血管内皮细胞中ROS与细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-Gal的表达量；和/或，

所述环二肽化合物能够降低血管内皮细胞中炎症相关蛋白Il6、CCL2和Il-1β的蛋白表达量；和/或，

所述环二肽化合物能够降低血管内皮细胞中炎症相关蛋白Il6、CCL2和Il-1β的mRNA表达量。

6.一种权利要求1中所述的环二肽化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸在缩合剂和碱的作用下与L-酪氨酸甲酯盐酸盐反应，得到叔丁氧羰基保护的线性二肽；

(2)将所述叔丁氧羰基保护的线性二肽脱除叔丁氧羰基保护基，得到线性二肽；

(3)将所述线性二肽在80℃～100℃的温度下反应成环，得到所述环二肽化合物；

其反应式如下：

7.根据权利要求6所述的环二肽化合物的制备方法，其特征在于，所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸和L-酪氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1-1.5；和/或，

所述缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐；和/或，

所述碱为N,N-二异丙基乙胺；和/或，

步骤(1)所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为二氯甲烷；和/或，

步骤(1)所述反应在惰性气体的保护下进行；和/或，

步骤(1)所述反应的温度为0℃～40℃，时间为1～4小时；和/或，

步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂中进行；和/或，

步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在催化剂的作用下进行，所述催化剂优选为三异丙基硅烷；和/或，

步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在温度为0℃～40℃的条件下进行，时间为20min～2小时；和/或，

步骤(3)所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为异丁醇和甲苯的混合溶剂；和/或，

步骤(3)所述反应的温度为85℃～95℃，时间为2小时～6小时；和/或，

步骤(3)所述反应在惰性气体的保护下进行。

8.根据权利要求6所述的环二肽化合物的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1～2：1～2；和/或，

所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸和碱的摩尔比为1：2～4。

9.根据权利要求6所述的环二肽化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述脱除叔丁氧羰基保护基的反应在二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂中进行，所述二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1：0.8～1.2；和/或，

步骤(3)所述反应在异丁醇和甲苯的混合溶剂中进行，所述异丁醇和甲苯的体积比为1：0.8～1.2。

10.根据权利要求6所述的环二肽化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将所述N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶解于二氯甲烷中，冷却至0℃～5℃，然后加入所述L-酪氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺，在惰性气体保护和0℃～5℃条件下搅拌20分钟～40分钟，然后在20℃～35℃下搅拌40分钟～80分钟，得到叔丁氧羰基保护的线性二肽；

(2)将所述叔丁氧羰基保护的线性二肽在0℃～5℃下溶解于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂中，并加入催化量的三异丙基硅烷，将所得反应混合物在20℃～35℃下搅拌20分钟～40分钟，得到线性二肽；

(3)将所述线性二肽溶解于异丁醇和甲苯的混合溶剂中，在惰性气体保护和85℃～95℃的条件下回流反应3小时～5小时，得到所述环二肽化合物。