CN119930816A

CN119930816A - 抗cd39人源化抗体或其抗原结合片段及其应用

Info

Publication number: CN119930816A
Application number: CN202311451811.9A
Authority: CN
Inventors: 王媛媛; 周新新; 欧颖烨; 张喆; 詹莉珍; 邓文涛
Original assignee: Shenzhen Wenbo Investment Co ltd; Guangdong Fapon Biopharma Inc
Current assignee: Shenzhen Wenbo Investment Co ltd; Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority date: 2023-11-02
Filing date: 2023-11-02
Publication date: 2025-05-06

Abstract

本发明提供了一种抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段及其应用，涉及生物医药技术领域，该抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的CDR区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区的CDR区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。该人源化抗体或其抗原结合片段降低了抗体免疫源性的风险，并保持了抗体的功能活性，能够广泛用于制备与CD39相关的疾病、病症或状况的药物。

Description

抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

CD39即外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPDase1)，是一种单通道的II型跨膜蛋白，可将胞外的eATP或ADP转化为AMP，然后CD73将AMP转化为腺苷，腺苷是肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用的代谢产物。当产生的腺苷与CD4 T、CD8 T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面的腺苷受体结合时，能够抑制T细胞和NK细胞应答，从而抑制免疫系统并促进肿瘤的生长。此外，腺苷还与巨噬细胞和树突细胞上的A2A或A2B受体结合，从而抑制吞噬作用和抗原呈递，并增加促癌因子(例如VEGF、TGF和IL-6)的分泌。而腺苷对于Treg则会促进Treg的免疫抑制活性。在TME内，腺苷途径是指eATP在腺苷酸水解酶的作用下向腺苷转化，以及腺苷通过免疫细胞上的A2A/A2B腺苷受体的信号传导。在正常条件下，CD39维持免疫抑制性腺苷与免疫刺激性ATP的细胞外水平的平衡。在健康组织中，ATP在细胞外环境中几乎检测不到，因为ATP被CD39快速分解生成ADP或AMP，然后AMP被CD73转化为腺苷。在包括癌症在内的细胞应激条件下，eATP水平显著升高，但由于被CD39和CD73相继水解而转化为腺苷，从而导致免疫系统对肿瘤的识别以及对肿瘤的杀伤产生阻碍。

因此，开发并优化抗CD39抗体对预防或治疗肿瘤相关疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于对特异性结合CD39的抗体进行人源化改造，以降低抗体免疫原性风险，同时保持抗体的功能活性。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

第一方面，所述抗体或其抗原结合片段包括：

(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO.1～8中任一项所示重链可变区的HCDR1，HCDR2和HCDR3；以及，

(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO.9～16中任一项所示轻链可变区的LCDR1，LCDR2和LCDR3；

可选的实施方式中，所述HCDR1，所述HCDR2和所述HCDR3，及所述LCDR1，所述LCDR2和所述LCDR3按照IMGT定义方式、Kabat定义方式、Chothia定义方式、AbM定义方式或Contact定义方式确定。

第二方面，还提供了一种生物材料，所述生物材料选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

(ⅰ)多核苷酸，包括编码第一方面的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸。

(ⅲ)细胞，所述细胞携带(ⅰ)中多核苷酸，或含有(ⅱ)中载体，或表达第一方面的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段。

第三方面，还提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物由第一方面的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物。

所述诊断剂选自放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂中的一种或多种；

所述治疗剂选自细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、抗凋亡试剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物和寡核苷酸中的一种或多种。

第四方面，还提供了第一方面的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段，或第二方面的生物材料，或第三方面的免疫偶联物在如下任一项中的应用：

(ⅰ)非诊断和治疗目的的检测CD39或表达CD39的细胞；

(ⅱ)制备用于检测CD39或表达CD39的细胞的产品；

(ⅲ)非诊断和治疗目的的阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性；

(ⅳ)制备用于阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断剂；

(ⅴ)制备用于治疗、预防或减轻与CD39相关的疾病、病症或状况的药物。

第五方面，还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有第一方面的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段，或第二方面的生物材料，或第三方面的免疫偶联物；和任选地药物学上可接受的载体和/或赋形剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对鼠源单克隆抗体进行人源化改造，降低了抗体免疫源性的风险，并保持了抗体的功能活性。经实验验证，本发明提供的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段与细胞上的CD39具有结合活性，能够阻断细胞表面CD39的ATP酶水解活性；施用于小鼠可以改善小鼠肿瘤情况，说明本发明提供的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段能够减少肿瘤微环境中的腺苷，发挥抗肿瘤作用，为癌症的治疗和/或预防提供新的可能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为人源化人源化抗体(R1801、R1802、R1803、R1804、R1805、R1806和R1807)与Mino细胞的结合活性；

图1b为人源化人源化抗体(R1808、R1809、R1810、R1839、R1840、R1841和R1842)与Mino细胞的结合活性；

图1c为人源化人源化抗体(R1843、R1844、R1845、R1846、R1847、R1848和R1849)与Mino细胞的结合活性；

图1d为人源化人源化抗体(R1850、R1851、R1852和R1853)与Mino细胞的结合活性；

图2a为人源化抗体(R1801、R1802、R1803、R1804、R1805、R1806和R1807)对Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图2b为人源化抗体(R1808、R1809、R1810、R1839、R1840、R1841和R1842)对Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图2c为人源化抗体(R1843、R1844、R1845、R1846、R1847、R1848和R1849)对Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图2d为人源化抗体(R1850、R1851、R1852和R1853)对Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图3a为人源化抗体(R1801、R1802、R1803、R1804、R1805、R1806和R1807)对MOLP-8细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图3b为人源化抗体(R1808、R1809、R1810、R1841、R1847、R1850和R1853)对MOLP-8细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图4a为人源化抗体(R1801、R1802、R1803和R1804)对CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制曲线；

图4b为人源化抗体(R1805、R1806、R1807和R1808)对CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制曲线；

图4c为人源化抗体(R1809、R1810、R1841和R1847)对CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制曲线；

图4d为人源化抗体(R1850和R1853)对CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制曲线；

图5a为人源化抗体(R1803、R1804、R1806、R1807、R1841和R1847)与CHO-K1-cynoCD39细胞的结合活性；

图5b为人源化抗体(R1853)与CHO-K1-cynoCD39细胞的结合活性；

图6为人源化抗体(R2122和R2123)与Mino细胞的结合活性；

图7为人源化抗体(R2122和R2123)与MOLP-8细胞的结合活性；

图8为人源化抗体(R2122和R2123)对Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图9为人源化抗体(R2122和R2123)对MOLP-8细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断曲线；

图10为人源化抗体(R2122和R2123)对CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制曲线；

图11为小鼠注射MOLP-8细胞后，给予小鼠人源化抗体(R2122和R2123)后肿瘤体积变化曲线；

图12为小鼠注射MOLP-8细胞后，给予小鼠人源化抗体(R2122和R2123)后小鼠体重变化曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

定义：

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

在本文中，术语“CD39”也被称为ENTPD1或ENTPD酶1，是一种可将ATP转化为AMP的膜蛋白。CD39含有两个跨膜结构域、一个较小的胞质域和一个较大的胞外疏水结构域。

在本文中“抗体或其抗原结合片段”是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。此外，“抗体或其抗原结合片段”也包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体。

在本文中“抗原结合片段”是包含抗体CDR的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。抗原结合片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)。上述抗原结合片段能够与亲本抗体结合相同的抗原。

在本文中，术语抗体的“Fab”是指由单条轻链(包括可变区和恒定区)和单条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来组成的抗体的一部分。“Fab’片段”是指包含了部分铰链区的Fab片段。“F(ab’)₂”是指Fab’的二聚体。“Fv片段”由单条轻链的可变区和/或单条重链的可变区结合组成。“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相互连接或通过肽接头序列连接而成的抗体片段。“抗体最小识别单位”指的是仅含可变区中单一CDR结构，虽然最小识别单位分子量小、亲和力低，但是它具有与抗原结合的能力。

在本文中，抗体或其抗原结合片段的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变区可以被称为“VH”。轻链可变区可以被称为“VL”。可变结构域含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自由通过4个框架(frameworkregion，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determining region，CDR)(也被称作高变区)组成。通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本文中的抗体或其抗原结合片段的CDR边界可以根据IMGT、Kabat、Chothia、AbM、Contact定义方式定义或鉴定，以其他本领域可接受的方式定义的CDR也属于本发明的保护范围(Kaas,Q etal.IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorconstant domains and Ig super family C-like domains.Dev.Comp.Immunol.29,185-203,(2005)；

R.M.MacCallum et al.,.Antibody–antigen interactions:contact analysisand binding site topography J.Mol.Biol.(1996)；

Martin,A.C.R.Protein sequence and structure analysis of antibodyvariabledomains(Book chapter).In Antibody engineering lab manual Eds.Duebel,S.and Kontermann,R.(2001)；

Marie-Paule Lefranc et al.IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55–77)。

本文中，“人源化抗体”是保留非人抗体的反应性，同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，可以通过保留非人抗体CDR区并用人抗体对应物(即，恒定区以及可变区的框架部分)替换抗体的其余部分构建获得。

术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指结合蛋白对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，结合蛋白以大约小于10^-5M，例如大约小于10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D值结合。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的K_D值。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。

本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸包含编码上述抗体或其抗原结合片段的部分，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。

术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，例如在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。

在本文中，术语“Mino细胞”是一种人非霍奇金淋巴瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39蛋白。

在本文中，术语“MOLP-8细胞”是一种人多发性骨髓瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39蛋白，将该细胞接种到NOD-SCID小鼠上建立的多发性骨髓瘤模型，可用于检测抗CD39抗体的体内抗肿瘤效果。

在本文中，术语“药物组合物”是以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。在一些具体的实施方式中，上述药物组合物中包含的抗体或表达的抗体能够特异性的靶向结合CD39，阻断CD39水解ATP。

第一方面，提供了一种抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段，该抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段包括(a)和(b)：

(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO.9～16中任一项所示轻链可变区的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

表1中展示了示例性抗体1847(重链可变区H6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区L8的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)和1853(重链可变区H8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区L8的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)根据不同定义方式定义的CDR氨基酸序列。

表1示例性单克隆抗体的CDR氨基酸序列

可选的实施方式中，抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及，LCDR1、LCDR2和LCDR3按照IMGT定义方式确定：

所述HCDR1包括如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；所述HCDR2包括如SEQ IDNO.22所示的氨基酸序列；HCDR3包括如SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列；所述LCDR1包括如SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；所述LCDR2包括如YT所示的氨基酸序列；所述LCDR3包括如SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。

可选的实施方式中，抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～8任一所示。

可选的实施方式中，具有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～8任一所示的重链可变区的抗体或其抗原结合片段，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～16任一所示。

可选的实施方式中，抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～16任一所示。

可选的实施方式中，具有氨基酸序列如SEQ ID NO.9～16任一所示的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～18任一所示。

可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区选自如下任一组合，参见表2：

表2

可选的实施方式中，所述抗原结合片段包括F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；

所述重链恒定区含有IgG1、IgG1.8、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一的部分或全部恒定区的序列；

所述轻链恒定区为κ或λ链；

可选的实施方式中，所述恒定区来源物种包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种的组合。

可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1；所述重链恒定区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.39所示。

可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1.8；所述重链恒定区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.40所示；

可选的实施方式中，所述轻链恒定区为κ链；所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.41所示。

(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸。

放射性核素包括但不限于¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的一种或多种。

顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)中的一种或多种。

荧光标记包括但不限于Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。

寡核苷酸包括但不限于shRNA、miRNA和siRNA中的一种或多种。

药物包括但不限于甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、氮芥、环磷酰胺、噻替派、顺铂、丝裂霉素、博莱霉素、喜树碱、鬼臼毒素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、长春碱、紫杉醇、三尖杉生物碱和L-门冬酰胺酶。

免疫调节剂包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞生长因子中的一种或多种。

放射性核素包括但不限于¹¹¹In、¹¹¹At、¹⁷⁷Lu、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹³³I、³²P、³³P、⁴⁷Sc、¹¹¹Ag、⁶⁷Ga、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁵²Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁶¹Ho、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、²¹¹Pb、²¹²Pb、²²³Ra、²²⁵Ac、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Rh、¹⁴⁹Pm、¹⁶⁹Er、¹⁹⁴Ir、⁵⁸Co、⁸⁰mBr、⁹⁹mTc、¹⁰³mRh、¹⁰⁹Pt、¹¹⁹Sb、¹⁸⁹mOs、¹⁹²Ir、²¹⁹Rn、²¹⁵Po、²²¹Fr、²⁵⁵Fm、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁵Br、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²²⁴Ac、⁷⁷Br、¹¹³mIn、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、²⁰³Hg、¹²¹mTe、¹²²mTe、¹²⁵mTe、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁹⁷Pt、¹⁰⁹Pd、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁶¹Tb、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵¹Cr、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、²⁰¹Tl、⁷⁶Br和¹⁶⁹Yb中的一种或多种。

(ⅰ)非诊断和治疗目的的检测CD39或表达CD39的细胞；

(ⅱ)制备用于检测CD39或表达CD39的细胞的产品；

(ⅲ)非诊断和治疗目的的阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性；

(ⅳ)制备用于阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断剂；

可选的实施方式中，上述第(ⅰ)方面的应用可以利用抗CD39抗体或其抗原结合片段能够特异性靶向结合CD39，基于免疫检测技术实现CD39或表达CD39的细胞的检测，如当抗体或其抗原结合片段链为免疫偶联物，例如连接有荧光基团，可以采用荧光检测装置实现对CD39的定位或实时检测。例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀或流式细胞技术等涉及到利用CD39抗原和抗体的特异性结合性能来检测CD39或表达CD39的细胞。相应的，上述第(ⅱ)方面，本领域技术人员可以根据实际的检测手段选择试剂盒中的试剂组成，包括但不限于拮抗剂、抗CD39抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。

可选的实施方式中，上述第(ⅲ)的应用可以使待阻断ATP酶水解活性的细胞与抗CD39抗体或其抗原结合片段充分接触，例如但不限于使待阻断ATP酶水解活性的细胞置于含有抗CD39抗体或其抗原结合片段的培养基中孵育。

可选的实施方式中，用于阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断剂还含有本领域可接受的辅料，包括但不限于培养基、防腐剂和缓冲组分等。

其中“任选地”表示所述药物组合物中含有或者不含有药物学上可接受的载体和/或赋形剂。可选的实施方式中，所述药物组合物中含有药物学上可接受的载体和/或赋形剂。所述可接受的载体以及药学上可接受的赋形剂可选择本领域已知的、常规的任何载体和/或赋形剂。载体的实例包括但不限于生理学上相容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等，用来延长抗体的保存限期或效力；赋形剂的实例包括但不限于填充剂、崩解剂、防腐剂、助溶剂和乳化剂等。

可选的实施方式中，所述药物组合物还包括具有其他治疗作用的一种或几种药物活性成分，包括但不限于化疗剂、抗癌药、放疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向治疗剂、细胞治疗剂、基因治疗剂、激素治疗剂、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂和细胞因子中的一种或几种的组合。

可选的实施方式中，所述药物组合物用于治疗、预防或减轻与CD39相关的疾病、病症或状况的药物。

上述第四方面和第五方面中的与CD39相关的疾病、病症或状况，是指由CD39的表达或活性的增加或减少引起的、加剧的或与之相关的任何疾病或状况。在一些实施方式中，CD39相关的疾病、病症或状况是与过度细胞增殖有关的病症，例如癌症。在一些实施方式中，CD39相关的疾病或状况的特征在于表达或过表达CD39和/或CD39相关基因，例如ENTPD1、2、3、4、5、6、7或8基因。

可选的实施方式中，“CD39相关”的疾病、病症或状况包括但不限于：癌症、自身免疫性疾病和感染。

可选的实施方式中，“CD39相关”的癌症包括在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达CD39，并且在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达CD39的水平显著高于正常细胞所预期的水平的癌症。

可选的实施方式中，“CD39相关”的癌症的实例包括但不限于肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆囊癌、胃癌、肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、肾盂和输尿管癌、唾液腺癌、小肠癌、尿道癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、食道癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、喉癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T或B细胞淋巴瘤、胃肠道间质瘤、软组织肿瘤、肝细胞癌和腺癌。在一些实施方式中，所述癌症是白血病、淋巴瘤、膀胱癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌或乳腺癌。

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1针对CD39的单克隆抗体的人源化

采用重组人CD39融合蛋白和构建的CHOK1-hCD39作为免疫原产生抗人CD39的抗体，进一步筛选后得到的#110鼠单抗对CHO-hCD39、Mino、Molp-8以及cynoCD39有较优的结合亲和力，在Mino和Molp-8上可以检测到该抗体可以很好的阻断CD39的酶活，并且在功能实验部分也能够看到该抗体通过阻断T细胞上CD39的酶活减少ADO的产生，从而促进T细胞的增殖(#110鼠单抗的重量可变区和轻链可变区如表3所示)；因此，本实施例对上述#110鼠单抗进行人源化，具体方法如下：

通过互补决定区移植(CDR-grafting)的方法进行人源化改造。首先，使用MOE(Molecular Operating Environment)软件对#110鼠单抗的Fv区进行抗体同源建模。根据模型结构，分析能影响抗原结合区域构象稳定的关键组成氨基酸残基。随后，检索人免疫球蛋白数据库，搜索人种系抗体库中与#110同源性高的人IGVH、IGVK序列作为人源化改造模板。分别将#110与匹配的人IGVH、IGVK序列进行比对，重点分析原始鼠单抗上能影响抗原结合区域构象稳定的关键组成氨基酸残基与人IGVH、IGVK序列不一致的位点，并在模型中观察是否能进行人源化的替换。根据不同的人源化替换程度，基于一条母本序列可以同时产生多条人源化后的序列。

对于#110分子，人源化后的重链序列如下表3所示：

表3

对于#110分子，人源化后的轻链序列如下表4所示：

表4

将不同的人源化轻、重链进行组合又可以产生不同的人源化抗体分子。不同组合方式主要考虑的是人源化程度高低及跟人源化后抗体活性维持之间的平衡。简单而言，将人源化程度最高的轻、重链进行配对，可以得到人源化程度最高的抗体分子，这意味着可能较低的免疫原性，但是人源化程度高可能会导致改造后分子的活性降低(影响母本抗体活性的关键氨基酸残基被替换为人源化的氨基酸，导致改造后抗体的抗原结合区域发生变化)。反之，将人源化程度最低的轻、重链进行配对，可以得到与母本抗体更一致的功能活性(因为大部分的关键氨基酸残基都被保留)，但是人源化程度也较低，可能会面临较高免疫原性的风险。这是一个平衡的过程，在制备人源化抗体过程中需要进行多种轻、重链组合表达制备，并进一步通过体内、外的功能试验进行验证，最终筛选合适的人源化抗体分子。

对于#110分子，人源化后的抗体序列如下表5所示：

表5

构建完整抗体可以使用恒定区序列如下表6所示：

表6

实施例2.人源化抗体表达及纯化

用常规方法进行抗体的制备，表达上清采用ProA亲和层析纯化。过程如下，使用AKTA avant 150层析设备，用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX，GE)，加载样品至层析柱，使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱，随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc，pH＝3.4)洗脱目标蛋白，收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris，pH8.0)，中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定，一般加入10％洗脱体积量。

样品使用Biotek-Epoch-Take-3进行浓度测定，利用A280方法检测抗体浓度，即以消光系数E.C.＝1.37，光程＝0.05mm(Take-3板不同孔光程有细微差异，会自动校正)，通过设备检测样品吸光值，按照Lambert-Beer law计算待测抗体的浓度。样品浓度过低则需要进行超滤浓缩，使用超滤浓缩管(Ultra-15Centrifugal Filter Devices，30kD)按照说明书提供的通用操作方法，将样品浓度浓缩至＞0.5mg/ml；收集浓缩端样品，0.22μm无菌针头滤器除菌过滤(科百特，PES，0.22μm，直径13mm)后分装冻存备用。

#110人源化抗体的制备数据如下表7。

表7

备注：表中纯度列中，最左侧的值为聚体百分比，最右侧的值为碎片百分比，中间的值为抗体单体百分比，“-”表示值为0％，例如“8.98％/91.02％/-”，其表明抗体溶液中，聚体百分比为8.98％，抗体单体纯度百分比91.02％，碎片百分比为0％。

实施例3.人源化抗体与Mino细胞的结合活性

收集Mino细胞，350G,离心5分钟，用PBS重悬，按照2E5/孔铺板到V型96孔板，分别加入CD39单克隆抗体和对照抗体，4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后按照100μl/孔加入PE Goat anti mouse IgG Fc(1：500稀释)，重悬细胞后4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后每孔加入100μL的PBS将细胞重悬后用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Countler)评估CD39抗体对Mino细胞的结合差异。结合曲线如图1a～图1d所示，其中R1839，R1840,R1842,R1843,R1844,R1845,R1846,R1848,R1849,R1851和R1852与Mino细胞无结合活性或是弱结合活性，这11株人源化抗体亲和力显著低于嵌合抗体R1796(#110-hIgG1)和阳性对照抗体R1800(ES002-hIgG1)，其余抗体优于或与阳性抗体持平。

嵌合抗体R1796(#110-hIgG1)的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。

阳性对照抗体R1800(ES002-hIgG1)的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。

实施例4.人源化抗体阻断Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性检测

将Mino细胞调整密度为4E6 cells/mL后按每孔50μl转移至96孔U底细胞培养板中(务必用新鲜的培养基重悬)；抗体用培养基配置为60μg/ml起始。3倍稀释，共10个浓度，将抗体按每孔添加100μL到细胞当中，混匀后，37℃孵育60min；将ATP用培养基配置成200μM，按50μL/孔加入细胞当中，混匀后，37℃孵育45min；将细胞350G离心，5min，取上清80μL，转移到白板中，再加入等体积的Cell Titer-Glo，室温避光孵育10min，上机检测。阻断曲线如图2a～图2d所示，与在Mino细胞上检测的结合活性结果相似，其中R1839，R1840,R1842,R1843,R1844,R1845,R1846,R1848,R1849,R1851和R1852对Mino细胞上CD39的酶活无阻断活性或是弱阻断活性，这11株人源化抗体亲和力以及阻断活性均显著低于嵌合抗体R1796，因此予以排除，后续的检测中将不再检测这11株人源化抗体。

实施例5.人源化抗体阻断MOLP-8细胞上CD39的ATP酶水解活性检测

将MOLP-8细胞调整密度为3E6 cells/ml后按每孔50μL转移至96孔U底细胞培养板中(务必用新鲜的培养基重悬)；抗体用培养基配置为60μg/ml起始。3倍稀释，共10个浓度，将抗体按每孔添加100μL到细胞当中，混匀后，37℃孵育60min；将ATP用培养基配置成200μM，按50μL/孔加入细胞当中，混匀后，37℃孵育35min；将细胞350G离心5min，取上清80μL，转移到白板中，再加入等体积的Cell Titer-Glo，室温避光孵育10min，上机检测。抗体的阻断活性曲线如图3a和图3b所示，其中R1803,R1804,R1805,R1806,R1807,R1841,R1847,R1850和R1853对MOLP-8细胞上CD39水解酶的阻断活性与嵌合抗体R1796相近或优于嵌合抗体，而剩余的R1801,R1802,R1808,R1809和R1810的阻断活性则相对较差。后续将再通过功能实验对这14株抗体进行检测。

实施例6.人源化抗体阻断CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制分析

首先将T细胞密度调整为5E6/mL，用DPBS为Buffer进行CFSE(10mM母液)标记T细胞，终浓度为0.5μM，在37摄氏度水浴锅中避光标记20min；加入12mL完全培养基(10％ FBS，4℃预冷)，用于终止CFSE反应；用细胞培养基稀释抗体，配置浓度为400nM，10×梯度稀释，设5个点；标记好的细胞300G、离心5min去上清，加完全培养基重悬并细胞计数，调整密度为2E6/ml(此处计总细胞，不计活细胞)，50μL/well加入96孔U形板，即最终细胞1E5/孔；将配置好的抗体按照50μL/well加入到细胞中；根据细胞的数量稀释beads，保证最终体系中细胞：beads为20:1，按50μL/well加入96孔U形板；三天(72h)后培养基稀释ATP为1200μM，加入至96孔板，50μL/孔，即最终体系为200μL。将细胞置于培养箱静置培养两天(48h)细胞板离心弃上清，BSA配置流式抗体(anti-humanCD8T，400×稀释，不能用FITC荧光抗体)，4℃孵育30min，流式检测T细胞增殖情况(收10000细胞，保证峰形平滑)，按照《CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程》上机检测。拟合曲线如图4a～图4d所示，其中R1847和R1853优于嵌合抗体R1796。

实施例7.人源化抗体与CHO-K1-cynoCD39细胞的结合活性

收集CHO-K1-cynoCD39细胞，350G，离心5分钟，用PBS重悬，按照2E5/孔铺板到V型96孔板，抗体用培养基配置为60μg/mL起始。3倍稀释，共10个浓度，分别加入CD39人源化抗体和嵌合抗体，4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后按照100μL/孔加入PE Goat anti mouse IgG Fc(1：500稀释)，重悬细胞后4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后每孔加入100μL的PBS将细胞重悬后用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Countler)评估CD39抗体对CHO-K1-cynoCD39细胞的结合差异。结合曲线如图5a和图5b所示，CD39的人源化抗体与嵌合抗体对CHO-K1-cynoCD39细胞的结合活性相似。

综合以上结果，我们筛选到在结合阻断及功能实验中表现较优的抗体R1847和R1853，因此挑选这2株抗体进行后续抗体亚型的改造。

实施例8.候选的人源化抗体的Fc改造

为了使抗体在机体中不会产生强的ADCC和ADCP效应，我们将候选蛋白的hIgG1-Fc进行了突变改造，改造前后分子编号的对应关系如下表8所示：

表8

hIgG1亚型	hIgG1.8亚型
		R1847	R2122
R1853	R2123
		阳性对照抗体R1800	R1289

实施例9.更换亚型后的人源化抗体与Mino细胞的结合活性

收集Mino细胞，350G，离心5分钟，用PBS重悬，按照2E5/孔铺板到V型96孔板，分别加入CD39单克隆抗体和对照抗体，4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后按照100μL/孔加入PE Goat anti mouse IgG Fc(1：500稀释)，重悬细胞后4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后每孔加入100μL的PBS将细胞重悬后用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Countler)评估CD39抗体对Mino细胞的结合差异。结合曲线如图6所示，其中R2122和R2123与Mino细胞的结合活性相近，且平台值优于阳性对照抗体R1289。

实施例10.更换亚型后的人源化抗体与MOLP-8细胞的结合活性

收集MOLP-8细胞，350G，离心5分钟，用PBS重悬，按照2E5/孔铺板到V型96孔板，分别加入CD39单克隆抗体和对照抗体，4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后按照100μL/孔加入PE Goat anti mouse IgG Fc(1：500稀释)，重悬细胞后4℃孵育30分钟。离心后每孔加入200μL的PBS洗一遍细胞，然后每孔加入100μL的PBS将细胞重悬后用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Countler)评估CD39抗体对Mino细胞的结合差异。结合曲线如图7所示，其中R2122和R2123与MOLP-8细胞的结合活性相近，且平台值优于阳性对照抗体R1289。

实施例11.人源化抗体阻断Mino细胞上CD39的ATP酶水解活性检测

将Mino细胞调整密度为4E6 cells/ml后按每孔50μL转移至96孔U底细胞培养板中(务必用新鲜的培养基重悬)；抗体用培养基配置为60μg/mL起始。3倍稀释，共10个浓度，将抗体以及杂交瘤上清按每孔添加100μL到细胞当中，混匀后，37℃孵育60min；将ATP用培养基配置成200μM，按50μL/孔加入细胞当中，混匀后，37℃孵育45min；将细胞350G离心5min，取上清80μL，转移到白板中，再加入等体积的Cell Titer-Glo，室温避光孵育10min上机检测。阻断曲线如图8所示，R2122和R2123在Mino细胞上展示出较优的阻断活性。

实施例12.人源化抗体阻断MOLP-8细胞上CD39的ATP酶水解活性检测

将MOLP-8细胞调整密度为3E6 cells/ml后按每孔50μL转移至96孔U底细胞培养板中(务必用新鲜的培养基重悬)；抗体用培养基配置为60μg/mL起始。3倍稀释，共10个浓度，将抗体以及杂交瘤上清按每孔添加100μL到细胞当中，混匀后37℃孵育60min；将ATP用培养基配置成200μM，按50μL/孔加入细胞当中，混匀后，37℃孵育35min；将细胞350G离心5min，取上清80μL，转移到白板中，再加入等体积的Cell Titer-Glo，室温避光孵育10min，上机检测。抗体的阻断活性曲线如图9所示，R2123在MOLP-8细胞上的阻断活性IC50与R2122相似，平台值优于R2122和阳性抗体R1289。

实施例13.人源化抗体阻断CD39水解ATP介导的T细胞增殖抑制分析

首先将T细胞密度调整为5E6/ml，用DPBS为Buffer进行CFSE(10mM母液)标记T细胞，终浓度为0.5μM，在37摄氏度水浴锅中避光标记20min；加入12mL完全培养基(10％ FBS，4℃预冷)，用于终止CFSE反应；用细胞培养基稀释抗体，配置浓度为400nM，10×梯度稀释，设5个点；标记好的细胞300G、离心5min去上清，加完全培养基重悬并细胞计数，调整密度为2E6(此处计总细胞，不计活细胞)，50μL/well加入96孔U形板，即最终细胞1E5/孔；将配置好的抗体按照50μL/well加入到细胞中；根据细胞的数量稀释beads，保证最终体系中细胞：beads为20：1，按50μL/well加入96孔U形板；三天(72h)后培养基稀释ATP为1200μM，加入至96孔板，50μL/孔，即最终体系为200μL。将细胞置于培养箱静置培养两天(48h)细胞板离心弃上清，BSA配置流式抗体(anti-humanCD8T，400×稀释，不能用FITC荧光抗体)，4℃孵育30min，流式检测T细胞增殖情况(收10000细胞，保证峰形平滑)，按照《CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程》上机检测。拟合曲线如图10所示，R2122在该实验体系下检测到的阻断T细胞增殖抑制的活性优于R2123。由于仅有两个候选分子，且在阻断活性和功能实验上各有优势，因此两个候选抗体均保留用于后续的功能实验检测。

实施例14.在MOLP-8异种移植的小鼠上检测人源化抗体的作用

在第0天给6-8周的雌性NOD SCID小鼠皮下注射5×10⁶个MOLP-8细胞，分别在第1天，第5天，第8天和第12天按照30mg/kg的剂量给与CD39抗体。图11曲线描绘了平均肿瘤体积，误差条表示SEM，X轴的红色三角标注给压迫的时间点，X轴显示植入后的天数，Y轴表示肿瘤的体积；图12曲线描绘了平均小鼠体重，误差条表示SEM，X轴的箭头标注给压迫的时间点，X轴显示植入后的天数，Y轴表示小鼠体重。结果显示与空白对照相比，CD39人源化抗体均有抑瘤作用，其中R2123的抑瘤效果优于R2122，并且在给药的过程中小鼠的体重在组间没有显著差异。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：

优选地，所述HCDR1，所述HCDR2和所述HCDR3，及所述LCDR1，所述LCDR2和所述LCDR3按照IMGT定义方式、Kabat定义方式、Chothia定义方式、AbM定义方式或Contact定义方式确定。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的CDR区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区的CDR区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；

所述HCDR1包括如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；所述HCDR2包括如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列；HCDR3包括如SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列；所述LCDR1包括如SEQ IDNO.30所示的氨基酸序列；所述LCDR2包括如YT所示的氨基酸序列；所述LCDR3包括如SEQ IDNO.36所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～8任一所示。

4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～16任一所示。

5.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～16任一所示。

6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～8任一所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区选自如下任一组合：

组合重链可变区轻链可变区 H6L8 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.9 H8L8 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.9 H1L1 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.16 H1L2 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.10 H1L3 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.11 H1L4 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.12 H1L5 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.13 H2L2 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.10 H3L2 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.10 H3L3 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.11 H3L4 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.12 H3L5 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.13 H4L6 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.14 H4L7 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.15 H4L8 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.9 H5L6 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.14 H5L7 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.15 H5L8 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.9 H6L6 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.14 H6L7 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.15 H7L6 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.14 H7L7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.15 H7L8 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.9 H8L6 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.14 H8L7 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.15

8.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段包括F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。

9.根据权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；

所述轻链恒定区为κ或λ链；

优选地，所述恒定区来源物种包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种的组合；

优选地，所述重链恒定区选自IgG1；所述重链恒定区的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.39所示；

优选地，所述重链恒定区选自IgG1.8；所述重链恒定区的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.40所示；

优选地，所述轻链恒定区为κ链；所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示。

10.生物材料，其特征在于，所述生物材料选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

(ⅰ)多核苷酸，包括编码权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；

(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸；

(ⅲ)细胞，所述细胞携带(ⅰ)中多核苷酸，或含有(ⅱ)中载体，或表达权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

11.免疫偶联物，其特征在于，权利要求1～9任一权利要求所述的抗CD39人源化抗体或其抗原结合片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物；

所述诊断剂选自放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂和光敏剂中的一种或多种；

12.权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求10所述的生物材料，或权利要求11所述的免疫偶联物在如下任一项中的应用：

(ⅰ)非诊断和治疗目的的检测CD39或表达CD39的细胞；

(ⅱ)制备用于检测CD39或表达CD39的细胞的产品；

(ⅲ)非诊断和治疗目的的阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性；

(ⅳ)制备用于阻断细胞上CD39的ATP酶水解活性的阻断剂；

13.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求10所述的生物材料，或权利要求11所述的免疫偶联物；和任选地药物学上可接受的载体和/或赋形剂。