CN119936405A - 血浆IL-1Ra作为生物标志物在儿童脓毒症诊断和预后中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血浆IL‑1Ra作为生物标志物在儿童脓毒症预后中的应用。所述预后产品应用在脓毒症诊断后的第1天测量IL‑1Ra水平，用于评估脓毒症患者的免疫状态和预后。本发明揭示了IL‑1Ra作为脓毒症免疫反应调节因子的潜力，并且其升高水平可以作为脓毒症临床结局的预测标志物，尤其是在免疫功能异常的患儿中，具有重要的临床意义。该发现为脓毒症的早期诊断、预后评估及治疗提供了新的生物标志物，并为临床管理提供了重要依据。

Description

血浆IL-1Ra作为生物标志物在儿童脓毒症诊断和预后中的 应用

技术领域

本发明涉及血浆IL-1Ra作为生物标志物在儿童脓毒症诊断和预后中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

脓毒症是一种因宿主对感染反应失调而引起的多器官功能障碍。脓毒症中的免疫反应非常复杂，涉及宿主免疫系统的多方面失调。在脓毒症的早期阶段，免疫系统通常会被激活以对抗感染，产生大量免疫细胞和抗体以清除病原。同时，强烈的细胞因子反应，也常被称为“细胞因子风暴”，也会被启动。然而，随着脓毒症的进展，免疫失调发生，表现为过度激活和免疫抑制的双重反应。这种双重反应不仅未能有效清除病原，还可能引发广泛的全身性炎症反应，导致严重的器官功能障碍和高死亡率。

以往的研究表明，各种炎症标志物和细胞因子在预测脓毒症的严重程度和预后方面具有一定的价值。例如，降钙素原(PCT)被广泛认为是脓毒症早期诊断的敏感且特异的生物标志物；C反应蛋白(CRP)，另一种常用的炎症标志物，在脓毒症的重症病例中常常升高；白细胞介素-6(IL-6)水平升高与脓毒症患者较差的预后相关，而白细胞介素-10(IL-10)水平升高反映免疫抑制状态，并预测较差的预后。此外，临床指标如儿科序贯器官衰竭评估(pSOFA)评分和血乳酸(LAC)水平与脓毒症的早期诊断、病情严重性和死亡风险密切相关。

脓毒症中免疫反应的失调引发了对靶向特定细胞因子的治疗方法的广泛关注，这些细胞因子参与了炎症级联反应。已有多种此类药物在临床试验中开发并测试。例如，妥珠单抗作为IL-6受体拮抗剂，已被证明能有效减少炎症并改善脓毒症和脓毒性休克患者的生存率。同样，靶向IL-1通路也显示出巨大的潜力。阿那白滞素(Anakinra)作为重组IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)，被用于阻断IL-1的有害作用，减轻过度的炎症反应。然而，IL-1Ra在脓毒症中的作用似乎复杂且多面。IL-1Ra是IL-1活性的天然抑制剂，其水平在脓毒症的过程中经历显著的动态变化。一些研究表明，IL-1Ra在脓毒症中常常异常升高。这种升高可能反映了身体为了调节脓毒症相关的过度炎症反应而做出的适应性反应。然而，这种矛盾的升高表明IL-1Ra在脓毒症的病理机制中发挥的作用比以往理解的更加复杂。因而，外源性IL-1Ra在脓毒症中的潜在治疗应用并非没有挑战。尽管理论上它能够进一步抑制过度的炎症反应并减轻病情，但外源性IL-1Ra的使用可能会干扰内源性IL-1Ra的精细平衡。这种失衡可能会导致意想不到的后果，从而强调了深入了解内源性IL-1Ra水平与脓毒症结局之间内在关系的必要性。澄清这种关系能够为IL-1Ra在脓毒症治疗中的临床应用提供更为科学和合理的基础。

发明内容

本发明的目的是：针对儿童脓毒症的早期诊断和预后评估问题，提供一种基于血浆IL-1Ra(白细胞介素-1受体拮抗剂)水平的生物标志物，用于儿童脓毒症的诊断与预后评估。

为了实现上述目的，本发明提供了血浆IL-1Ra作为生物标志物在儿童脓毒症诊断和预后中的应用。所述血浆IL-1Ra水平的变化可用于评估儿童脓毒症的严重程度，并初步判断其临床预后。研究表明，儿童脓毒症患者在脓毒症早期血浆中IL-1Ra的浓度显著升高，且其水平与脓毒症的严重程度和患者预后生存率密切相关，尤其是在自身免疫异常的患儿中。

第一方面，本申请提供IL-1Ra在制备儿童脓毒症预后产品中的应用。

进一步地，所述预后产品应用在脓毒症诊断后的第1天测量IL-1Ra水平，用于评估脓毒症患者的免疫状态和预后。

进一步地，所述儿童脓毒症预后产品指的是评估儿童脓毒症的免疫反应、疾病严重程度及预后相关的预后产品。

优选地，所述应用包括通过所述预后产品检测儿童脓毒症患者血浆中IL-1Ra的水平，结合患儿的临床症状、实验室检测结果等，进行脓毒症的预后监测。

进一步地，所述预后产品为试剂盒。

第二方面，本申请提供一种儿童脓毒症预后试剂盒，包括检测受试者IL-1Ra水平的试剂。

进一步地，所述检测样本为血浆样本。

第三方面，本发明还提供了血浆IL-1Ra作为预后生物标志物，用于预测儿童脓毒症患者的生存率及免疫恢复状况。通过监测IL-1Ra水平的变化，能够在脓毒症早期识别出高风险患者，并指导临床医生制定个性化的治疗方案。

进一步地，所述应用，包括以下步骤：

S1，筛选出儿童脓毒症患者纳入研究，采集患者脓毒症第1天的IL-1Ra水平；

S2，根据脓毒症第1天测得的IL-1Ra水平，根据四分位数间距法得到中位数[25-75％四分位数范围]作为阈值；

S3，将患者脓毒症第1天的IL-1Ra水平与步骤S2得到的阈值对比，高于该阈值划分为IL-1Ra高组，提示患者具有显著较高的死亡风险和较差的临床预后。

第四方面，本发明还提供IL-1Ra在制备免疫异常的脓毒症儿童的预后产品中的应用。

优选地，所述血浆IL-1Ra水平的升高与儿童脓毒症的预后相关，尤其是自身免疫异常的患儿，IL-1Ra水平往往升高，成为重要的预后标志物。

其中，血浆中IL-1Ra的升高反映了自身免疫异常的脓毒症患者体内免疫失衡状态。IL-1Ra通过抑制IL-1的作用，调节机体的免疫反应，过高的IL-1Ra水平可能意味着自身免疫异常的脓毒症患者正处于严重的免疫失衡状态，并且该免疫失衡状态可能与较差的临床预后相关。

本发明发现，血浆IL-1Ra在儿童脓毒症早期的水平显著升高，并与疾病的严重程度患者预后密切相关。IL-1Ra能帮助评估患者的免疫恢复进程，进而为临床治疗决策提供指导。

与过去的研究相比，本发明明确了血浆IL-1Ra在儿童脓毒症诊断和预后评估中的重要性，IL-1Ra浓度升高具有较强的预测性。通过监测IL-1Ra水平，能够有效识别出免疫功能受损的儿童脓毒症患者，进而采取及时和适宜的治疗措施，改善患者的预后。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本申请发现IL-1Ra在脓毒症第1天显著升高，并且该升高水平与脓毒症的临床结局，包括脓毒性休克发生率、死亡率及ICU住院时间显著相关。揭露了血浆IL-1Ra浓度的变化与脓毒症患者的临床预后密切相关，监测IL-1Ra的水平可预测患者的免疫恢复情况及生存率，为个性化治疗提供指导。IL-1Ra作为反映免疫功能的重要生物标志物，可以帮助监测脓毒症患者免疫恢复过程，为治疗方案的调整提供依据。血浆IL-1Ra的检测是一种非侵入性的方法，相较于传统的临床检测手段，更加安全、便捷，适用于儿童脓毒症的广泛应用。

因此，本发明为儿童脓毒症的诊断和预后评估提供了一个新的生物标志物，能够早期识别高风险患者，监测免疫抑制状态，并为临床提供更精准的治疗决策，显著提高儿童脓毒症的治疗效果和生存率。

附图说明

图1.Luminex检测概述：(A)Luminex检测中细胞因子浓度(log10)均值的热图；(B)显示在脓毒症第一天显著升高或降低的指标；(C)脓毒症第1天、第3天和第7天IL-1Ra、PD-L1和IL-10的动态变化；(D)IL-1Ra与其他细胞因子之间的Spearman相关性分析。

图2.IL-1Ra偏高组和偏低组的差异分析：(A)IL-1R偏高组与IL-1Ra偏低组，脓毒性休克患者数量和死亡人数的差异；(B)IL-1Ra偏高组与IL-1Ra偏低组之间IL-1Ra水平(脓毒症第1天)与pSOFA评分之间的Spearman相关性分析；(C)IL-1Ra偏高组与IL-1Ra偏低组之间相关临床指标的差异；(D)IL-1Ra偏高组与IL-1Ra偏低组的生存分析。

图3.正常免疫组和异常免疫组的生存分析：(A)正常免疫组的生存分析；(B)免疫异常组的生存分析；(C)Spearman IL-1Ra与其他临床指标的相关性分析。

p<0.05时被认为有统计显著性；以上附图中ns代表p>0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图附表作详细说明如下。

以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规市售产品；所涉及的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中，部分实验材料与方法包括：

1.Luminex检测

血浆细胞因子的定量分析使用了人类XL细胞因子Luminex性能检测46-plex固定面板(LKTM014B，R&D Systems)，并结合Luminex200平台的磁珠格式进行，按照制造商的说明书操作(Labex，上海)。细胞因子浓度以pg/mL表示，低于检测下限的值被排除在分析之外。

2.酶联免疫吸附法(Elisa)

依据Elisa试剂盒(Abclonal)说明书完成上样、孵育、洗涤等操作。按照说明书设置波长，在酶标仪上测量OD值。根据标准品浓度梯度和对应的OD值绘制标准曲线，计算样品浓度。

3.统计分析方法

连续变量以均值±标准差(SD)或中位数和四分位数间距(IQR)表示，分类变量以频率(百分比)表示。使用IQR法识别离群值，其中低于第一个四分位数或高于第三个四分位数1.5倍IQR范围之外的值被视为离群值。对于离群值占总数超过10％的数据，进行了对数转换，转换后重新评估离群值。

卡方检验或Mann-Whitney U检验用于比较组间的临床特征和IL-1Ra水平。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)评估对照组与脓毒症患者在诊断后第1、3、7天炎症细胞因子水平的差异。使用Spearman相关分析评估IL-1Ra、炎症细胞因子与脓毒症患者临床参数之间的关联。采用Kaplan-Meier生存曲线评估IL-1Ra水平对累积生存率的影响。Log-rank检验用于比较IL-1Ra高低水平分类的组间生存差异。

为处理缺失数据，应用了多重插补(MI)方法。缺失值使用链式方程的多变量插补(MICE)方法，并采用预测均值匹配(PMM)进行插补，最终估算结果通过结合来自20个插补数据集的结果，并依据Rubin的规则得出。分层Cox回归分析用于分别分析IL-1Ra与异常免疫组和正常免疫组死亡风险的关联。通过E值评估未测量混杂因素的潜在影响。

所有统计分析均使用R软件(版本4.2.2)进行。p值<0.05被认为具有统计学意义。图表使用GraphPad Prism(版本9.0)和R软件(版本4.2.2)制作。

实验例1脓毒症期间整体细胞因子水平变化分析

本实施例中，通过Luminex检测技术对对照组(健康儿童)和实验组(已确诊的脓毒症儿童)整体细胞因子水平进行了检测。炎症细胞因子水平在脓毒症诊断后的第1天、第3天和第7天进行了纵向测量。与对照组相比，第1天，24种细胞因子显著升高，包括IL-1Ra、MIP-3β、MCP-1、MIP-3α、PD-L1、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、IL-8、FIT-3、G-CSF、GM-CSF、颗粒酶B、TNF-β、IL-10、IL-6、IL-12p70、IL-15、IL-17A、IL-9、IL-2、IL-33、TNF-α和VEGF。相反，8种细胞因子显著下降，包括Eotaxin、INF-β、IL-17E、IL-5、PDGF-BB、RANTES、TRAIL和FGF基础型(图1A)。在升高的细胞因子中，抗炎因子IL-1Ra、IL-10和PD-L1尤其值得注意，其中IL-1Ra在第1天表现出最为显著的升高，随后在接下来的几天内逐渐下降(见图1B、C)。在脓毒症第1天进行的Spearman相关分析显示，IL-1Ra与其他细胞因子之间存在显著的正相关关系，包括MIP-3α、MIP-1β、IL-1α、IL-15、IL-12p70、IL-33、IL-6、TNF-α和Granzyme B(见图1D)。

以上结果表明，IL-1Ra在儿童脓毒症的早期免疫反应中发挥了关键作用，突显其作为免疫调节的重要调控因子的潜力。

实验例2IL-1Ra水平与不良预后呈正相关

本实施例中根据脓毒症第1天测得的IL-1Ra水平，患者被分为IL-1Ra高组和IL-1Ra低组(以中位数[25-75％四分位数范围]为判别标准，高于该中位数划分为IL-1Ra高组，低于该中位数划分为IL-1Ra低组)。与IL-1Ra低组相比，IL-1Ra高组的儿童发生脓毒性休克的可能性显著增加，且脓毒症诊断后90天的死亡率显著较高(见图2A)。此外，IL-1Ra高组在诊断第1天表现出更高的白细胞计数(WBC)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)和pSOFA评分，同时ICU住院时间(ICU LOS)较短(见图2C)。为探索IL-1Ra水平与脓毒症第1天pSOFA评分之间的相关性，进行了Spearman相关分析。尽管在IL-1Ra低组中未观察到统计学显著的相关性，但在IL-1Ra高组中发现了中等程度的正相关，Spearman相关系数为0.39(p<0.01)(见图2B)。值得注意的是，Kaplan-Meier生存曲线显示，IL-1Ra高组的患者与IL-1Ra低组的患者相比，生存概率显著较低(Log-rank p<0.01)(见图2D)。

表1存活和死亡患者的基线特征分析(数据以中位数[25-75％四分位数范围]或频率(百分比)表示)

这些结果表明，脓毒症诊断第1天IL-1Ra水平的升高与不良临床结局相关，包括疾病严重程度增加和死亡风险升高。

实验例3IL-1Ra水平升高可能与免疫异常中死亡风险增加相关

本实施例为了进一步评估免疫状态的影响，我们将脓毒症儿童分为免疫异常组和免疫正常组。两组在基线信息和临床指标上未观察到统计学差异(见表2)，IL-1Ra水平也无显著差异。随后，生存分析显示，在免疫异常的儿童中，IL-1Ra高组的生存概率显著低于IL-1Ra低组(Log-rank p<0.01)(见图3A)。相反，在免疫正常组中，IL-1Ra高组与低组之间的生存概率差异不显著(见图3B)。

表2免疫异常和免疫正常患儿的基线特征分析(数据以中位数[25-75％四分位数范围]或频率(百分比)表示)

为了评估IL-1Ra水平与90天死亡率的相关性，采用了分层Cox回归模型，并对年龄、性别、体重、WBC、PCT、CRP、乳酸(LAC)和pSOFA评分等变量进行了调整。结果显示，在免疫正常组中，IL-1Ra水平与死亡风险之间未发现显著关联(p>0.05)(见表3)。然而，IL-1Ra水平升高与死亡风险增加显著相关。IL-1Ra高组的风险比(HR)为7.53(95％ CI:1.57-36.16,p<0.05)，表明与IL-1Ra低组相比，死亡风险显著增加。此外，pSOFA评分在该组中与死亡风险独立相关，HR为1.34(95％ CI:1.14-1.56,p<0.01)(见表3)

表3分层的COX回归分析(以是否存在自身免疫异常分组进行分层的COX回归分析)

上述结果说明，IL-1Ra水平与90天死亡率有较强的相关性，尤其是在自身免疫功能异常的患儿中。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.IL-1Ra在制备儿童脓毒症预后产品中的应用，其特征在于，所述预后产品应用在脓毒症诊断后的第1天测量IL-1Ra水平，用于评估脓毒症患者的免疫状态和预后。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述儿童脓毒症预后产品指的是评估儿童脓毒症的免疫反应、疾病严重程度及预后相关的预后产品。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括通过预后产品检测儿童脓毒症患者血浆中IL-1Ra的水平，结合患儿的临床症状、实验室检测结果等，进行脓毒症的预后监测。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预后产品为试剂盒。

5.一种儿童脓毒症预后试剂盒，其特征在于，包括检测受试者IL-1Ra水平的试剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测样本为血浆样本。

7.IL-1Ra作为脓毒症预后标志物的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1，筛选出儿童脓毒症患者纳入研究，采集患者脓毒症第1天的IL-1Ra水平；

S2，根据脓毒症第1天测得的IL-1Ra水平，根据四分位数间距法得到中位数[25-75％四分位数范围]作为阈值；

S3，将患者脓毒症第1天的IL-1Ra水平与步骤S2得到的阈值对比，高于该阈值划分为IL-1Ra高组，提示患者具有显著较高的死亡风险和较差的临床预后。

8.IL-1Ra在制备免疫异常的脓毒症儿童的预后产品中的应用。