CN119913199A

CN119913199A - 细胞分裂素响应因子RhARR17在调节月季腋芽萌发中的应用

Info

Publication number: CN119913199A
Application number: CN202510387683.9A
Authority: CN
Inventors: 晏慧君; 景维坤; 付琪; 张颢; 蹇洪英; 王慧纯; 邱显钦; 唐开学; 王其刚; 陈敏
Original assignee: Flower Research Institute of YAAS
Current assignee: Flower Research Institute of YAAS
Priority date: 2025-03-31
Filing date: 2025-03-31
Publication date: 2025-05-02
Anticipated expiration: 2045-03-31
Also published as: CN119913199B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细胞分裂素响应因子RhARR17在调节月季腋芽萌发中的应用，本发明提供抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达的产品在促进月季腋芽萌发中的应用，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，本发明中根据RhARR17在月季花枝不同位点芽中的表达结果，瞬时沉默腋芽中的RhARR17，发现RhARR17的异常表达会影响腋芽的萌发和生长，沉默RhARR17能促进腋芽的生长；相反，瞬时过表达腋芽中的RhARR17，能抑制腋芽的生长。

Description

细胞分裂素响应因子RhARR17在调节月季腋芽萌发中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RhARR17基因在调节月季腋芽萌发中的应用。

背景技术

月季（Rosa hybrida）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）多年生常绿或者半常绿木本观赏植物。月季兼具花型端庄、花色艳丽、花香馥郁等特点，有很高的观赏和经济价值，位于世界四大切花之首，是切花市场消费数量最多的花卉之一广泛应用于园林绿化、庭院装饰、盆花、香料和化妆品工业等方面。

萌发是植物生长发育过程中一个重要的生物学特征，腋芽的萌发决定了植物分枝的形成，而分枝的数量直接影响营养器官的数量，从而对作物产量产生决定性影响。分生组织的分化过程形成腋芽，首先是分生组织分化为侧芽原基，进一步发育成腋芽，最终形成侧枝。植物侧枝的数量与腋芽的萌发密切相关，二者呈正相关关系。

月季的腋芽主要在叶腋部位发育，其进一步生长可形成开花枝，因此，这一过程对月季的生长及形态建成至关重要，腋芽也是月季最重要的增殖材料之一。在切花月季的生产过程中，腋芽萌发的速度直接影响其成活率；而在整个生长发育过程中，腋芽的特性则决定了切花月季的生长周期、产量和品质。因此，研究和调控月季腋芽萌发的相关因素，对于切花月季的育种以及产业提质增效具有重要的实践意义。

发明内容

本发明筛选出细胞分裂素相应因子RhARR17，发现该基因在月季组织腋芽和萼片中高表达，影响月季腋芽萌发，抑制该基因表达可促进月季腋芽萌发。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

本发明一方面，提供一种抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达在促进月季腋芽萌发中的应用，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供一种抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达的产品在促进月季腋芽萌发中的应用，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述产品为沉默、敲除或敲低RhARR17基因的产品。

进一步的，沉默RhARR17基因的产品含SEQ ID NO.2所述的碱基序列。

另一方面，本发明提供一种试剂盒在促进月季腋芽萌发中的应用，所述试剂盒含抑制RhARR17基因表达的试剂，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的碱基序列如SEQ IDNO.2所示，所述多核苷酸用于抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供一种载体，所述载体含如SEQ ID NO: 2所示的碱基序列。

另一方面，本发明提供一种工程菌，所述工程菌含所述的载体。

进一步的，本发明提供所述的多核苷酸，或所述的载体，或所述的工程菌在促进月季腋芽萌发中的应用。

另一方面，本发明提供一种促进月季腋芽萌发的方法，所述方法为抑制月季中RhARR17基因或其转录翻译蛋白的表达，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果：

本发明从月季基因组中鉴定出一个细胞分裂素相应因子RhARR17，发现该基因在月季组织腋芽和萼片中高表达，表达信号集中于腋芽内，在花瓣、茎段中几乎无表达。在月季花枝不同位点芽中RhARR17的表达情况分析中，发现RhARR17的表达在中间部位腋芽中表达量高。因此本申请推测RhARR17可能参与月季的腋芽萌发。

本发明中根据RhARR17在月季花枝不同位点芽中的表达结果，瞬时沉默腋芽中的RhARR17，发现RhARR17的异常表达会影响腋芽的萌发和生长，沉默RhARR17能促进腋芽的生长；瞬时过表达腋芽中的RhARR17，过表达RhARR17能抑制腋芽的生长。

附图说明

图1是本发明提供的RhARR17的表达分析图；注：分别是茎段、根、花瓣、叶片、萼片、腋芽、雄蕊、雌蕊。

图2是本发明提供的RhARR17的亚细胞定位图；注：（A）RhARR17亚细胞定位预测结果；（B）在本氏烟草叶片中的亚细胞定位，将RhARR17-GFP与NF-YA4-mCherry（核标记）共浸润到烟草叶片中，通过共聚焦显微镜观察荧光信号。

图3是RhARR17的不同节位芽点定量分析统计图；数据显示为平均值±SD （n=3）（****表示P ≤ 0.0001），分别是上部腋芽、中部腋芽、下部腋芽。

图4是本发明提供的瞬时沉默RhARR17后不同时间段腋芽萌发和生长的表型观察结果图；注：0d、4d、8d、表示侵染后第0、4、8天TRV2和TRV2-RhARR17沉默腋芽的生长情况。

图5是本发明提供的瞬时沉默RhARR17后不同时间段腋芽生长状态解剖图；注：0d、4d、8d表示侵染后第0、4、8天TRV2和TRV2-RhARR17沉默腋芽生长点的体式解剖观察情况。

图6是本发明提供的瞬时沉默RhARR17后的基因表达量及腋芽长度测量统计图；注：（A）沉默后的RT-qPCR分析RhARR17相对表达量；（B）沉默后0d、4d、8d，对照组TRV2和处理组TRV2-RhARR17沉默的芽长（*表示P≤0.05，**表示P≤0.01）。

图7 是本发明提供的瞬时过表达RhARR17后不同时间段腋芽萌发和生长的表型观察结果图；注：0d、6d、12d表示侵染后第0、6、12天pSuper-1300和pSuper-1300-RhARR17过表达腋芽的生长情况。

图8 是本发明提供的瞬时过表达RhARR17后不同时间段腋芽生长状态解剖图；注：0d、6d、12d表示侵染后第0、6、12天Super-1300和pSuper-1300-RhARR17过表达腋芽生长点的体式解剖观察情况。

图9是本发明提供的瞬时过表达RhARR17后的基因表达量及腋芽长度测量统计图；注：（A）过表达后的RT-qPCR分析RhARR17相对表达量；（B）过表达后0d、6d、12d，对照组pSuper-1300和处理组pSuper-1300-RhARR17过表达的芽长（*表示P≤0.05，**表示P≤0.01）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图进行详细说明。本申请通过对修剪后不同时间节点的腋芽进行转录组测序，并筛选出与月季腋芽萌发相关的显著差异的细胞分裂素相应因子RhARR17。在腋芽中高表达,并且发现RhARR17的表达量与腋芽活性相关，在上部腋芽表达最高，中部腋芽次之，在及下部腋芽中表达最低。瞬时沉默及瞬时过表达 RhARR17后发现腋芽萌发和生长速度受到影响。因此，本申请揭示了RhARR17在月季腋芽萌发中的生物学功能，从而对切花月季育种及产业提质增效具有极其重要的意义。

本发明提供RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，沉默RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO: 2所示。

本申请中出现的缩略词及其对应名称如表1所示。

表1 缩略词表

实施例

1．植物材料

1.1‘粉红雪山’

‘粉红雪山’为现代切花月季品种，取自云南省农业科学院花卉研究所宝峰基地，以带单芽茎段作为月季腋芽萌发实验的材料。

1.2烟草

亚细胞定位实验材料为本氏烟草，将种子撒播于湿润的营养基质中，并覆膜，于培养室内培养。

培养条件：温度24±1℃，相对湿度为60-65%，光周期16h/8h。

1.3菌株与载体

大肠杆菌：DH5α以及根癌农杆菌菌株：EHA105、pSuper-1300（Kan抗性）均购自北京擎科生物科技有限公司。VIGS载体为购自HonorGene（奥诺基因）的pTRV1、pTRV2。

1.4 案例中涉及的培养基配方

（1）LB培养基和YEB培养基（表2）

表2 LB和YEB培养基配方

2.研究方法

2.1 总RNA的提取

使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型），从‘粉红雪山’的花瓣、叶片、花托、萼片、腋芽中提取总RNA。

2.2 cDNA合成

（1）基因组DNA去除（表3）

表3 基因组DNA去除反应体系

混匀，42 ℃，2 min。

（2）配制逆转录反应体系（表4）

表4 转录反应体系

吹打混匀，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。产物于-20 ℃保存。

2.3 实时荧光定量PCR

用Primer premier5设计基因的特异性引物（表5）。将cDNA用ddH₂O稀释四倍，以反转录得到的cDNA为模板进行Real-Time PCR扩增。以GAPDH为内参，设置3个生物学重复。

表5 RT-qPCR引物序列

反应体系如表6所示：

表6 RT-qPCR反应体系

反应程序如表7所示：

表7 RT-qPCR反应程序

2.4 载体构建

2.4.1 PCR扩增目的基因片段

PCR目的基因扩增用高保真酶（PhusionTM Plus PCR Master Mix），反应体系如表8所示：

表8 PCR扩增反应体系

反应程序如表9所示：

表9 PCR扩增反应程序

扩增结束后进行1%凝胶电泳，选取目的条带进行后续胶回收。

2.4.2 胶回收

用DNA胶回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0）对PCR产物进行回收纯化。

2.4.3 载体双酶切

根据目的片段序列插入的酶切位点，用相应酶对载体进行双酶切。酶切体系如表10所示：

表10 双酶切体系

在冰上加好体系试剂后，根据具体酶的热变性温度进行载体双酶切。

2.4.4 同源重组

将双酶切后的载体与克隆的目的基因片段进行同源重组，以构建载体。同源重组体系如表11所示：

表11 同源重组体系

程序：于PCR仪中50 ℃跑15 min。

2.4.5 大肠杆菌转化

（1）从-80 ℃取出感受态，于冰中融化；

（2）取1.5 mL离心管，加入10 μL重组产物和50 μL DHα感受态，吹打混匀，在冰中静置30 min；

（3）42 ℃水浴锅热激90 s，迅速转至冰上静置2 min；

（4）离心管中加入500 μL LB，37 ℃，200 rpm，1 h；

（5）培养后的菌液，5000 rpm离心5 min；

（6）在超净工作台中弃400 μL上清，吹打混匀后涂布于含抗生素的LB固体培养基上，37 ℃过夜倒置培养。

2.4.6 菌检及测序

（1）摇菌：挑取过夜培养长出的单菌落，于500 μL含有抗生素的LB培养基中振荡培养3-4 h（37 ℃，200 rpm）。

（2）菌液PCR：培养起来的菌液用于PCR扩增，以检测所构建载体目的条带是否符合预期。菌液PCR扩增体系如表12所示：

表12 菌液PCR扩增体系

菌液PCR扩增程序如表13所示：

表13 菌液PCR扩增反应程序

扩增产物用于1%凝胶电泳成像，条带大小符合预期的送公司测序。

2.5 质粒提取

送测结果返回后进行序列比对，选择符合预期的样品摇菌，用质粒提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）提质粒。

2.6 农杆菌转化

（1）从-80 ℃冰箱取出农杆感受态融化至冰水混合物状态时插入冰中；

（2）每100 μL感受态加入0.01-1 μg质粒DNA，拨打混匀后依次于冰上静置5 min，液氮5 min，37 ℃水浴5 min，冰浴5 min；

（3）加入500 μL无抗生素的YEB液体培养基，28 ℃振荡培养2-3 h；

（4）5000 rpm离心2 min，于超净工作台弃400 μL上清，涂布到含抗生素的YEB固体培养基上，28 ℃倒置培养2-3 d。

2.7 亚细胞定位

（1）载体构建

选取SmaI和KpnI为酶切位点,将RhARR17的完整编码区（SEQ ID NO: 1）序列插入pSuper-1300载体中，利用同源重组的方法设计引物，以构建RhARR17-GFP载体，得到农杆阳性菌种后进行以下实验。

（2）摇菌

1）菌液划线培养：取出保存的菌液在含相应抗生素的YEB培养基上划线，28 ℃倒置培养2-3天；

2）摇菌：挑取单菌落于1.5 mL离心管中，加入500 μL含抗生素的YEB液体培养基进行过夜小摇（28 ℃，200 rpm），PCR菌检，条带正确的菌液继续进行中摇，大摇。

（3）烟草注射

1）集菌：将培养至OD₆₀₀=0.4-0.6的菌液进行离心（5000 rpm，8 min），弃上清，收集菌体。用侵染液重悬菌体，将OD₆₀₀调至1.0，按RhARR17-GFP/GFP：NF-YA4-mCherry：P19=1:1:0.5比例混合，黑暗静置3 h。

2）注射：静置结束后，用针头在烟草（长至4-6片叶）背面轻轻划个口，用1 mL注射器将按比例混合的菌液注射到烟草叶片中，并做好标记；

3）培养：将注射后的烟草放置在25 ℃培养箱中，先暗培养一天，后转至光下培养2天；期间注意浇水，保持烟草正常生长。

（4）观察拍照

选取烟草注射口附近的叶片，用刀片和镊子轻轻切成方形取下，放置在载玻片上，滴上蒸馏水，盖上盖玻片（注意避免气泡产生）。用云南省农科院生物所国家重点实验室的激光共聚焦显微镜进行观察拍照。

2.8 瞬时沉默

（1）载体引物设计与载体构建

以EcoRI和BamHI为酶切位点，将RhARR17的沉默片段（SEQ ID NO: 2）序列插入TRV2空载中，利用同源重组的方法设计引物，构建TRV-RhARR17载体。

（2）菌液培养

菌液平板划线（含Kan/Rif 50 mg/L），28 ℃倒置培养2-3天。挑取单菌落于500 μL含抗生素的YEB中小摇，菌检；条带正确的进行中摇，大摇（28 ℃，200 rpm）。

（3）集菌和重悬

用离心机5000 rpm，8 min离心集菌，倒掉上清，用侵染液重悬菌体，用移液枪吹打混匀，调至OD600 = 1.0。进行瞬时沉默实验时，将TRV1和TRV2、TRV2-RhARR17菌液按体积1:1混合，暗处静置4-6 h。

（4）真空抽吸

用真空泵对带单芽的茎段进行抽吸侵染，0.082 MPa，抽吸10 min，持压10 min，放气10 min，尽可能让整个茎段浸没在菌液中，重复处理三次。侵染完后，用无菌水漂洗，于8℃培养室放3 d后扦插，每隔两天进行观察，并取样，拍照记录。

2.10 RhARR17序列实验中用到的引物

表14 RhARR17序列及引物列表

3试验结果

3.1 RhARR17在不同组织部位的表达验证

本申请提取了月季的花瓣、叶片、花托、萼片、腋芽的总RNA并进行质量检测，选取响应分生组织和植物生长发育相关顺式作用元件最多的基因，进行荧光定量表达分析发现，不同基因在不同组织中的表达存在差异（图1）。其中，RhARR17在腋芽和萼片中表达较特异且表达量较高，表明RhARR17可能对月季腋芽的生长和发育至关重要。

3.2 RhARR17的亚细胞定位分析

为了探索RhARR17发挥功能的亚细胞位置，本申请首先用Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2）进行了在线预测，显示定位于细胞核（图2A）。为了进一步验证定位的准确性，克隆了RhARR17的CDS序列，构建RhARR17-GFP载体。以GFP空载为对照，转入农杆EH105后注射本氏烟草叶片，3 d后于激光共聚焦显微镜下观察，结果显示GFP空载和RhARR17-GFP均定位于细胞核（图2 B）。

3.4 不同活性芽中RhARR17的表达量分析

本申请对切花月季‘粉红雪山’花枝（花蕾未露白）不同位节位腋芽中RhARR17的表达水平进行实时荧光定量PCR分析，发现RhARR17的表达在上部腋芽表达量较高，中部腋芽次之，在下部腋芽表达量最低（图3）。因此，本申请推测RhARR17与腋芽的萌发紧密相关。

3.5 RhARR17抑制月季腋芽萌发

本申请基于RhARR17在不同位点芽中的表达量分析结果，选取RhARR17序列的特异区段（SEQ ID NO: 2），用同源重组的方法构建TRV-RhARR17瞬时沉默载体，将TRV1，TRV2和TRV2-RhARR17转入农杆EHA105后用于中部腋芽茎段的侵染以沉默RhARR17，于侵染后0 d、4d、8 d进行表型观察和记录（图4）。从芽的表型来看，与TRV2对照相比，TRV2-RhARR17芽的萌发速度较快，芽的解剖结果同样可以看出RhARR17沉默后芽的发育加快（图5）。为了确认沉默效果，提取RhARR17沉默前后芽的总RNA，对其表达量进行了RT-qPCR分析，发现RhARR17沉默后表达降低极显著，说明沉默有效（图6A）。此外，也对对照组TRV2和实验组TRV2-RhARR17不同时间点的芽长度进行了测量，发现沉默后第10 d差异能达到极显著（图6B）。

本申请基于RhARR17在不同位点芽中的表达量分析结果，选取RhARR17序列的CDS序列（SEQ ID NO:1），用同源重组的方法构建pSuper-1300-RhARR17瞬时过表达载体，将pSuper-1300和pSuper-1300-RhARR17转入农杆EHA105后用于中部腋芽茎段的侵染以过表达RhARR17，于侵染后0 d、6 d、12 d进行表型观察和记录（图7）。从芽的表型来看，与pSuper-1300对照相比，pSuper-1300-RhARR17芽的萌发速度较慢，芽的解剖结果同样可以看出RhARR17过表达后芽的发育减慢（图8）。为了确认过表达效果，提取RhARR17过表达前后芽的总RNA，对其表达量进行了RT-qPCR分析，发现RhARR17过表达后表达升高极显著，说明过表达有效（图9A）。此外，也对对照组pSuper-1300和实验组pSuper-1300-RhARR17不同时间点的芽长度进行了测量，发现沉默后第12d差异能达到极显著（图9B）。

需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达在促进月季腋芽萌发中的应用，其特征在于，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达的产品在促进月季腋芽萌发中的应用，其特征在于，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为沉默、敲除或敲低RhARR17基因的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沉默RhARR17基因的产品含SEQ ID NO.2所述的碱基序列。

5.一种试剂盒在促进月季腋芽萌发中的应用，其特征在于，所述试剂盒含抑制RhARR17基因表达的试剂，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述多核苷酸用于抑制RhARR17基因或其转录翻译蛋白表达，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含如SEQ ID NO: 2所示的碱基序列。

8.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌含权利要求7所述的载体。

9.权利要求6所述的多核苷酸，或权利要求7所述的载体，或权利要求8所述的工程菌在促进月季腋芽萌发中的应用。

10.一种促进月季腋芽萌发的方法，其特征在于，抑制月季中RhARR17基因或其转录翻译蛋白的表达，所述RhARR17基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。