CN119909025B - 一种多功能级联纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多功能级联纳米酶及其制备方法和应用，属于医药纳米材料技术领域，其为掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料并在其表面修饰靶向配体或稳定剂。该纳米材料由金离子、血红素和盐酸多巴胺在碱性条件下自组装形成纳米粒子，进一步通过化学反应修饰靶向配体或稳定剂。本发明公开的多功能级联纳米酶能够将疾病微环境中的葡萄糖原位转化为过氧化氢，同时还可将其转化为毒性的羟基自由基，破坏肿瘤细胞及细菌的氧化还原平衡，诱导其凋亡、死亡,可以有效避免对正常细胞及组织的毒副作用，具备一定的微环境调控能力，因此可用于制备肿瘤或感染伤口的光热治疗剂、药物治疗剂、光热药物联合治疗剂。

Description

一种多功能级联纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药纳米材料技术领域，具体涉及一种基于疾病微环境的多功能级联纳米酶及其制备方法以及其在肿瘤及糖尿病慢性伤口感染治疗方面的应用。

背景技术

微环境生物学功能及其重构在肿瘤、慢性伤口愈合等疾病发生发展中的作用正受到越来越多的关注和重视，成为肿瘤、感染伤口、糖尿病溃疡等疾病诊疗研究的一个关键和核心方向。基于酶促反应的催化疗法是疾病微环境干预的一个极佳的切入点。但天然酶具有稳定性差，可变性、水解性差、不能耐受恶劣的反应条件、难以纯化、可重用性差等局限，限制了其在疾病治疗中的应用。纳米酶（Nanozyme）是一类本身蕴含酶学特性的纳米材料，能够催化酶的底物，产生同天然酶类似的催化反应，并具有酶促反应动力学等特征，属于一类新型模拟酶。与天然酶类似，纳米酶可以在温和的生理条件下高效催化酶的底物，因其可调的催化活性、苛刻条件下的高稳定性、组成和结构设计的灵活性以及优异的生物相容性等优势。开发具有疾病微环境干预功能的纳米酶，对自身免疫损伤、慢性功能退化、组织修复、恶性肿瘤等一系列疾病的治疗有着重要意义。

尽管基于微环境调控的纳米酶的研究取得了长足的进展，但微环境是一个复杂的动态系统，单一因素的调控难以实现理想的治疗效果。众所周知，经过数百万年的进化，生命体内的化学转化和信号传导具有高效和高特异性的特征，多酶的级联反应在生命过程中起着至关重要的作用。不仅如此，生命体内的级联反应通常发生在限域空间内，这不仅可以提高各酶促反应对底物的选择性，而且还能够有效防止中间产物的损失，提高反应效率。受这些系统优点的启发，将酶在框架结构上进行整合，开发基于多酶协同催化的级联纳米酶具有重要意义。目前专利公开了一些基于疾病微环境的级联纳米酶用于肿瘤及慢性伤口的治疗。专利CN202111462047.6公开了一种HABT-C纳米材料，其具有三重拟酶活性，能够协同声动力及级联酶模拟活性，进而达到杀灭肿瘤且抑制其复发的目的。专利CN202110582078.9公开了一种负载金属有机框架纳米酶与葡萄糖的抗菌纤维，葡萄糖和金属有机框架纳米酶之间存在级联抗菌特性，无需外源提供可原位起抗菌作用，对多种细菌有高效的抗菌性能。专利CN202010838122.3公开了一种双纳米酶抗菌剂（AuFe₃O₄@DMSNs），通过负载的金纳米与四氧化三铁两种纳米酶之间的级联反应生成羟基自由基·OH进行杀菌。但上述专利技术大都存在合成过程相对复杂、生物相容性、稳定性较差，一定程度上限制了其生物应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种以生物相容性的聚多巴胺为基底的多功能级联纳米酶及其制备方法以及其在肿瘤及糖尿病慢性感染伤口治疗中的应用。本发明提供的多功能级联纳米酶可在肿瘤及糖尿病慢性伤口感染环境下，通过消耗内源性的葡萄糖原位产生过氧化氢，同时还可将其转化为毒性的羟基自由基，破坏肿瘤细胞及细菌的氧化还原平衡，诱导其凋亡、死亡。此外，该多功能级联纳米酶还具有优异的光热性能，可实现光热治疗及多酶活性的增强，达到肿瘤及糖尿病慢性感染伤口治疗的效果。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的一种多功能级联纳米酶材料，其为掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料并在其表面修饰上不同的靶向配体或稳定剂。该纳米材料由金离子、血红素和盐酸多巴胺在碱性条件下自组装形成纳米粒子，进一步通过化学反应修饰靶向配体或稳定剂，以增强其功能性和靶向性。

本发明所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的制备：

将盐酸多巴胺溶液加入到三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液中，剧烈搅拌溶解，缓慢加入四氯金酸（HAuCl₄）和血红素（Hemin），室温搅拌，反应结束后离心收集产物，得到掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料。

步骤2、修饰靶向配体或稳定剂：

将步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料与靶向配体或稳定剂按照方式一、方式二或者方式三进行反应，透析冻干得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶。所述的靶向配体或稳定剂，包括含有羧基或巯基或氨基的肽、DNA配体、多糖、聚乙二醇（PEG）、叶酸。

方式一、通过酰胺缩合反应修饰靶向配体或稳定剂：

向步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，加入含有羧基的靶向配体或稳定剂以及缩合剂和碱，通过酰胺缩合反应，得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶。

方式二、通过巯基偶联的方式修饰靶向配体或稳定剂：

将含有巯基的靶向配体或稳定剂溶于含有三(2-羧乙基)膦（TCEP）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温搅拌1h-3h还原巯基，随后加入步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，室温搅拌，反应10h-24h，通过巯基与聚多巴胺纳米材料发生迈克尔加成反应偶联得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶。

方式三、通过氨基偶联的方式修饰靶向配体或稳定剂：

将含有氨基的靶向配体或稳定剂溶于磷酸盐缓冲液（PBS）或水中，随后缓慢加入步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液，室温搅拌12h-24h，通过氨基与聚多巴胺纳米材料发生迈克尔加成反应偶联得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶。

上述一种多功能级联纳米酶的制备方法，其中：

进一步地，步骤1中，所述盐酸多巴胺溶液浓度为1mg/mL-4mg/mL，Tris-HCl缓冲溶液浓度为0.01M-0.05M，pH 8.0-9.5。

进一步地，步骤1中，所述HAuCl₄的加入方式为逐滴加入；HAuCl₄浓度为0.005%-0.2% (w/v)，最优为0.1% (w/v)；血红素浓度为1mg/mL-4mg/mL，最优为1mg/mL。

进一步地，步骤1中，室温搅拌条件为10℃-40℃下搅拌6h-48h，最优为室温搅拌24h。

进一步地，步骤1中，离心转速条件为8000rpm-15000rpm，最优为10000rpm；离心时间为5min-35min，最优为10min。

进一步地，步骤2方式一中，掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有羧基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0；含有羧基的靶向配体或稳定剂与缩合剂、碱的摩尔比为1:(1.0-2.0):(2.0-6.0)。

进一步地，步骤2方式一中，缩合剂/碱为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）/ N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉（EEDQ）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）/ N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）/ 4-二甲氨基吡啶（DMAP）、1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）/DMAP或1-羟基苯并三唑（HOBT）/DMAP/ N,N-二乙基乙胺（TEA）。

进一步地，步骤2方式二中，含有巯基的靶向配体或稳定剂与三(2-羧乙基)膦（TCEP）的摩尔比(0.8-1.2):1；所述的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有巯基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0。

进一步地，步骤2方式三中，掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有氨基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0。

进一步地，步骤2方式三中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液浓度为0.01M-0.05M，pH 8.0-9.5。

本发明所述多功能级联纳米酶材料具有显著的多酶催化活性，包括葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）三种类酶活性（图2）。这种纳米酶材料能够在肿瘤及糖尿病慢性伤口感染环境下，通过消耗内源性的葡萄糖原位产生过氧化氢（H₂O₂），并进一步将其转化为毒性的羟基自由基。这一过程破坏了肿瘤细胞及细菌的氧化还原平衡，诱导其凋亡和死亡。

本发明所述的多功能级联纳米酶在药物浓度高达1000μg/mL时，对细胞也没有明显的毒性，表明其具有良好的生物相容性。

本发明所述的多功能级联纳米酶具有显著的光热效应和良好的光热稳定性，在808nm近红外激光照射下，能够将光能转化为热能，因此可用于肿瘤或感染伤口的光热治疗、光热药物联合治疗。

本发明所述的多功能级联纳米酶还具有类过氧化物酶活性，能够催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸，因此可用于制备检测葡萄糖含量的物质。

本发明所述的多功能级联纳米酶能够将疾病微环境中的葡萄糖原位转化为过氧化氢，同时还可将其转化为毒性的羟基自由基，破坏肿瘤细胞及细菌的氧化还原平衡，诱导其凋亡、死亡。

本发明所述的多功能级联纳米酶能抑制肿瘤细胞的增殖，并且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用，808nm近红外照射后效果进一步加强。

相对于现有技术，本发明具有以下显著优势：

(1)利用多巴胺的在碱性条件下的自氧化特性及对金属的螯合及还原性，一步合成法构建具有多酶活性和光热特性的纳米材料。

(2)相较于传统的单酶模拟物，本发明所制备的多功能级联纳米酶具有葡萄糖氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶等多酶级联活性。

(3)本发明公开的多功能级联纳米酶制备过程绿色简便、成本低廉，易于大批量制备。

(4)本发明公开的多功能级联纳米酶易于多种靶向配体或稳定剂修饰。

(5)本发明公开的多功能级联纳米酶能够将疾病微环境中的葡萄糖原位转化为过氧化氢，同时还可将其转化为毒性的羟基自由基，破坏肿瘤细胞及细菌的氧化还原平衡，诱导其凋亡、死亡, 可以有效避免对正常细胞及组织的毒副作用，具备一定的微环境调控能力。

附图说明

图1为本发明的多功能级联纳米酶合成示意图。

图2为本发明的多功能级联纳米酶多酶催化活性示意图。

图3为本发明实施例1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料透射电镜图和粒径分布图；其中a为透射电镜图；b为粒径分布图。

图4为本发明实施例1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的光热性能分析；其中a为50µg/mL纳米材料在不同红外功率条件下升温情况；b为不同浓度的纳米材料在0.75W/cm²条件下升温情况；c为纳米材料的热稳定性。

图5为本发明实施例1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的多酶活性；其中a为纳米材料的过氧化物酶活性；b为不同浓度的纳米材料处理后溶液中GSH消耗量；c为纳米材料的葡萄糖氧化酶活性；d为纳米材料级联催化活性。

图6为本发明多功能级联纳米酶的细胞毒性；其中a为多功能级联纳米酶对小鼠肺成纤维细胞（L929）增殖活性影响；b为多功能级联纳米酶对小鼠乳腺癌细胞（4T1）增殖活性影响。

图7为本发明多功能级联纳米酶的体内抗肿瘤效果。

图8为本发明多功能级联纳米酶抗菌效果；其中a为多功能级联纳米酶对金黄色葡萄球菌的抗菌效果；b为多功能级联纳米酶对大肠杆菌的抗菌效果。

图9为本发明多功能级联纳米酶加速糖尿病创面愈合；其中a为使用PBS、PBS+NIR（0.75W/cm²）、APH、APH+NIR（0.75W/cm²）、APHC、APHC+NIR（0.75W/cm²）治疗S. aureus感染糖尿病伤口后的愈合过程；b为伤口面积量化图。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一种多功能级联纳米酶的制备方法，如图1所示，将金离子、血红素和盐酸多巴胺在碱性条件下自组装形成纳米离子，并通过酰胺缩合、巯基偶联、氨基偶联等方式修饰上靶向配体或稳定剂。具体操作步骤如下：

步骤1、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的制备：

将3.6mL盐酸多巴胺溶液（4mg/mL）加入到72mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液（0.01M，pH=8.5）中，剧烈搅拌。随后滴加入5.4mL四氯金酸（HAuCl₄）超纯水（0.1%, w/v）和1mL含血红素N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（1mg/mL），室温搅拌20h。反应完成后离心机10000rpm离心10min，弃上清，超纯水洗涤离心2次，真空干燥得掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料。

表征与性能：本实施例得到的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料经透射电子显微镜（Hitachi TEM, 日本）表征，结果如图3所示，纳米材料呈现菊花状（图3a），粒径呈正态分布，分散度良好（图3b），粒径为150.1±16.3nm。

本实施例所制备的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，经光热测试，结果如图4所示。其具有高效光热转换能力，随着材料浓度（10、25、50、75、100µg/mL）和NIR808功率（0.25、0.50、0.75W/cm²）的增大，体系温度出现了进一步的升高（图4a-b），且具有较好的光热稳定性，在5个光热循环内不衰减（图4c）。

本实施例所制备的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料具有多酶活性，结果如图5所示。其类过氧化物酶活性通过过氧化氢存在下3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的显色反应进行测定，将100μL掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料（30μg/mL）、100μL TMB（1.2mM）、50μL不同浓度的H₂O₂（6.25、12.5、25.0、50.0和100mM）依次加入到2mL NaAc缓冲液中（pH=5.4，0.01M），使用紫外分光光度计的时间扫描模式测量652nm处吸光度，结果如图5a所示，该纳米材料可以有效催化过氧化氢（H₂O₂）的氧化，具有较高的类过氧化物酶活性，反应过程中所产生的活性氧为羟基自由基。使用5,5 ' -二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）为探针，检测纳米材料对GSH的消耗能力，将不同浓度的纳米酶（0、50、100、200、500μg/mL）与 GSH（2mM）溶液混合，37℃孵育3h后，加入10μL DTNB（5mM），混匀静置反应3min，使用紫外分光光度计在412nm处检测吸光度变化，结果如图5b所示，随着纳米材料浓度的增加GSH水平逐渐下降，这表明纳米材料能够通过氧化还原反应协同有效地消耗GSH，从而增加肿瘤微环境中ROS的浓度。此外，该纳米材料具有显著的葡萄糖消耗能力，使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定葡萄糖的消耗，将不同浓度的纳米酶溶液（0、100、200μg/mL）与含葡萄糖（1mg/mL）的PBS混合，在特定的时间间隔收集以上0.5mL溶液并与1.5mL DNS试剂混合，在100℃下加热5min，然后快速转移到冰水冷却20min，使用紫外分光光度仪检测450nm处吸光度，结果如图5c所示，葡萄糖的浓度呈指数下降，纳米材料浓度升高加速葡萄糖的消耗速度。通过TMB法定量检测不同浓度葡萄糖溶液TMB的变化，将100μg/mL纳米材料溶液与不同浓度的葡萄糖溶液（0、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL）混合，37℃下孵育6h后加入TMB（2mM），使用紫外分光光度计的时间扫描模式测量652nm处吸光度，结果如图5d所示，葡萄糖浓度增加和反应时间延长均可氧化oxTMB的特征吸光度持续增加，证实本发明制备的纳米材料具有显著的级联催化活性。

步骤2、修饰靶向配体或稳定剂：

（1）含有巯基的DNA适配体的靶向修饰：

将0.2mg的巯基DNA适配体Aptamer1（Apt1）（武汉金开瑞生物工程有限公司）于1mL含有0.1mM TCEP的磷酸盐缓冲液（PBS）中室温搅拌1h。随后加入步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的磷酸盐缓冲液（PBS）（1mL，1mg/mL），室温搅拌，反应16h，然后将0.2mg的Aptamer2（Apt2）（武汉金开瑞生物工程有限公司）溶解在1mL PBS中，并加入混合物中，在60℃下反应2h。冷却至室温后继续搅拌6h。将溶液在透析袋（Mw 14000）中透析48h，冷冻干燥得到Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶。其粒径分布图见图3b。5′-SH巯基修饰的Apt1的DNA序列（5′→3′）如SEQ ID NO: 1所示，5′-FAM (5′-Carboxyfluorescein) 绿色荧光探针修饰的Apt2的DNA序列（5′→3′）如SEQ ID NO: 2所示。

（2）含有羧基的叶酸（C-FA）靶向修饰：

向0.5mM的叶酸二甲基亚砜（DMSO）溶液（1mL）中加入0.55μM 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）和0.55μM N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合搅拌，而后缓慢加入到步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料水溶液（1mL，1mg/mL）中，室温搅拌，反应24h。将溶液在透析袋（Mw 14000）中透析48h，冷冻干燥得到叶酸靶向修饰的多功能级联纳米酶。

（3）含有氨基的聚乙二醇（PEG）修饰：

将1mg单氨基的聚乙二醇（PEG）（Mw=5000）溶解于水中，缓慢地滴加步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料（1mL，1mg/mL）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液（0.01M，pH=8.5），室温搅拌24h，将溶液在透析袋（Mw 10000）中透析48h，冷冻干燥得到聚乙二醇（PEG）修饰的多功能级联纳米酶。

应用实施例1

Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶（APHA）的细胞毒性测试：

利用经典的甲基噻唑基四唑（MTT）法评价了Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶对小鼠肺成纤维细胞（L929）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）增殖活性的影响。不同浓度的APHA超分子纳米酶组装体共孵育24h后，对小鼠正常细胞L929没有明显的细胞毒性，即使在高浓度（1000μg/mL）下，细胞活力仍保持在95%以上（图6a），证实纳米材料APHA具有很好的生物相容性。在4T1肿瘤细胞中，伴随APHA浓度升高细胞活力显著下降，呈剂量依赖性，50μg/mL的抑制率超过75%（图6b）。表明纳米酶可以通过其多种类酶活性产生毒性的活性氧，诱导肿瘤细胞的凋亡、死亡，近红外光的引入可以在进行光热治疗的同时进一步提高类酶活性，增强杀伤肿瘤细胞的能力。

Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶的体内抗肿瘤效果测试：

将处于对数增长期生长状态良好的4T1细胞用胰酶消化，离心后磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。对细胞悬液计数后，以2×10⁶个/只的标准在Balb/c雌性小鼠的右下肢皮下接种4T1细胞，接种后每天观察成瘤情况并测定瘤体积。待肿瘤生长至100mm³左右时，将4T1荷瘤小鼠随机分为6组（n=5）: PBS组、PBS+NIR组（PBS+L组）、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料组（APH组）、Aptamer DNA适配体级联纳米酶组（APHA组）、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料+NIR组（APH+L组）、Aptamer DNA适配体级联纳米酶级联纳米酶+NIR组（APHA+L组）。腹腔给药9h后，相应的NIR激光照射组给予808nm激光（0.75W/cm²）照射5min。治疗期间，每隔一天记录肿瘤体积和体重。待14天治疗期结束后，脱颈处死小鼠。抗肿瘤效果如图7所示，与对照组相比Aptamer DNA适配体级联纳米酶组对肿瘤有明显的抑制作用，808nm近红外照射后抑制作用进一步加强。

应用实施例2

PEG修饰的多功能级联纳米酶的抗菌效果测试：

采用平板计数法研究聚乙二醇（PEG）修饰的多功能级联纳米酶对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的协同抗菌作用。选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在新鲜的LB肉汤的液体培养基中培养至对数生长期，稀释至10⁷个菌落形成单位（CFU）/mL。将细菌添加葡萄糖的培养液中，在有或没有近红外照射的情况下加入不同浓度的纳米酶。近红外照射组用808nm激光（0.75W/cm²）照射5min。磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组作为对照组。将处理过的细菌悬浮液（60μL）涂布在固体琼脂培养基上，在37℃下孵育24h后，拍照菌落计数。结果见图8。随着PEG修饰的多功能级联纳米酶浓度的增加，抗菌效果增强，且808nm近红外照射后对细菌杀伤作用进一步加强。在1.5mg/mL纳米酶处理及808nm近红外照射条件下，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果分别达到了98.2.%和94.2%。

应用实施例3

叶酸（C-FA）靶向修饰的多功能级联纳米酶加速糖尿病创面愈合效果测试：

糖尿病小鼠模型的建立，5周龄C57BL/6小鼠（17~20g体重）连续3天禁食12h后腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50mg/kg），构建1型糖尿病模型。注射后观察7天，血糖浓度高于16.7mM的小鼠被认为是糖尿病小鼠。将小鼠随机分为6组，每组3只，分别命名为Control组（PBS组）、Control+NIR组（Control+L组）、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料组（APH组）、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料+NIR组（APH+L组）、叶酸靶向修饰的多功能级联纳米酶组（APHC组）、叶酸修饰的多功能级联纳米酶+NIR组（APHC+L组）。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（0.2mL/10g）麻醉，用电剪剃背部毛发。剃须区域用75%乙醇消毒。然后，用直径6毫米的无菌真皮活检穿孔机对剃光的背部的全层等大小的皮肤进行伤口穿刺。将10µL制备的金黄色葡萄球菌悬浮液（1×10⁶CFU/mL）接种于创面24h，形成创面感染。从第二天开始，每天在伤口表面涂覆不同的纳米酶及进行光热治疗（0.75W/cm²，5min），治疗感染伤口。第0、3、7、14天采集创面光学图像，记录创面大小。在第7天和第14天，采集创面及周围组织进行组织学苏木精伊红（H&E）染色评价。实验结果如图9所示，在第7天，APHC+NIR组的伤口面积显著减少至13.17% ，伤口愈合效果最好 。在第14天，APHC+NIR组的伤口几乎愈合，伤口面积减少到1.52%，而Control组的伤口仍未愈合，伤口面积为29.17%。

Claims (7)

1.一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的制备：

将盐酸多巴胺溶液加入到Tris-HCl缓冲溶液中，剧烈搅拌溶解，缓慢加入四氯金酸和血红素，室温搅拌6h-48h，反应结束后离心收集产物， 得到掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，该纳米材料呈现菊花状，粒径为150.1±16.3nm；盐酸多巴胺溶液浓度为1mg/mL-4mg/mL，Tris-HCl缓冲溶液浓度为0.01M-0.05M，pH 8.0-9.5；

步骤2、修饰靶向配体或稳定剂：

将步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料与靶向配体或稳定剂按照方式一、方式二或者方式三进行反应，透析冻干得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶；

方式一、通过酰胺缩合反应修饰靶向配体或稳定剂：

向步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，加入含有羧基的靶向配体或稳定剂以及缩合剂和碱，通过酰胺缩合反应，得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶；掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有羧基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0；含有羧基的靶向配体或稳定剂与缩合剂、碱的摩尔比为1:(1.0-2.0):(2.0-6.0)；所述含有羧基的靶向配体或稳定剂为叶酸；

方式二、通过巯基偶联的方式修饰靶向配体或稳定剂：

将含有巯基的靶向配体或稳定剂溶于含有三(2-羧乙基)膦的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌还原巯基，随后加入步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料，室温搅拌，反应，通过巯基与聚多巴胺纳米材料发生迈克尔加成反应偶联得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶；所述含有巯基的靶向配体或稳定剂为巯基DNA适配体Aptamer1和Aptamer2，DNA序列如SEQ ID NO:1~ 2所示；

方式三、通过氨基偶联的方式修饰靶向配体或稳定剂：

将含有氨基的靶向配体或稳定剂溶于磷酸盐缓冲液或水中，随后缓慢加入步骤1中制得的掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的Tris-HCl缓冲溶液，室温搅拌，通过氨基与聚多巴胺纳米材料发生迈克尔加成反应偶联得到靶向配体或稳定剂修饰的多功能级联纳米酶。

2.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤1中，四氯金酸的加入方式为逐滴加入；四氯金酸浓度为0.005%-0.2%，血红素浓度为1mg/mL-4mg/mL；离心转速条件为8000rpm-15000rpm，离心时间为5min-35min。

3.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2方式二中，含有巯基的靶向配体或稳定剂与三(2-羧乙基)膦的摩尔比(0.8-1.2):1；掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有巯基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0。

4.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2方式三中，掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的浓度为0.5g/mL-4mg/mL；含有氨基的靶向配体或稳定剂与掺杂金纳米及血红素的聚多巴胺纳米材料的质量比为(0.1-2.0):1.0；Tris-HCl缓冲溶液浓度为0.01M-0.05M，pH 8.0-9.5。

5.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2方式一中，所述含有羧基的靶向配体或稳定剂为叶酸，得到叶酸靶向修饰的多功能级联纳米酶，该叶酸靶向修饰的多功能级联纳米酶用于制备加速糖尿病创面愈合的药物。

6.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2方式二中，所述含有巯基的靶向配体或稳定剂为巯基DNA适配体Aptamer1和Aptamer2，DNA序列如SEQ ID NO:1~ 2所示，得到Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶，该Aptamer DNA适配体靶向修饰的多功能级联纳米酶用于制备抑制肿瘤细胞增殖药物。

7.根据权利要求1所述的一种多功能级联纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2方式三中，所述含有氨基的靶向配体或稳定剂为单氨基的聚乙二醇，得到PEG修饰的多功能级联纳米酶，该PEG修饰的多功能级联纳米酶用于制备抗炎抗菌药物。