CN119899266A

CN119899266A - 一种抗cd24抗体及其应用

Info

Publication number: CN119899266A
Application number: CN202510041073.3A
Authority: CN
Inventors: 郑艳波; 弓建华; 李育净; 郑毅佳; 洪菡雨; 张均怡; 高漫; 魏菡锐; 甄永苏
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Priority date: 2025-01-10
Filing date: 2025-01-10
Publication date: 2025-04-29
Anticipated expiration: 2045-01-10
Also published as: CN119899266B

Abstract

本发明公开了一种抗CD24抗体及其应用。具体地公开了抗CD24抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区(SEQ ID NO:1、5、9或13)和轻链可变区(SEQ ID NO:3、7、11或15)。本发明通过杂交瘤技术以及CDR移植法获得了抗CD24抗体(包括鼠源单抗和三个人源化单抗)。本发明的抗CD24抗体亲和力高，能显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率可达82.3％，抗肿瘤疗效显著，并且与多种肿瘤细胞和组织具有较强的结合能力，而不与正常细胞结合，具备良好的肿瘤选择性。该抗体可制成CD24靶点相关疾病的预防治疗药物、诊断药物、检测试剂盒等，在肿瘤的治疗和诊断等领域具有十分广阔的临床应用前景。

Description

一种抗CD24抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗CD24抗体及其应用。

背景技术

吞噬细胞在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，巨噬细胞是主要的吞噬细胞，可直接清除肿瘤细胞。吞噬作用受到多种信号分子的调控，肿瘤细胞可通过表达抗吞噬蛋白如CD47、PD-L1、CD24等，产生“别吃我”信号，诱导免疫逃逸。

CD24(分化抗原簇24)是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白，是一种先天免疫检查点分子。研究表明CD24可与多种免疫细胞表面的Siglec-10(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素10)受体相互作用，抑制炎症反应。Siglec-10胞内区含有免疫受体酪氨酸抑制基序，可以通过SHP1和SHP2磷酸酶的参与调节细胞内信号，抑制TLR(Toll-likereceptor)介导的炎症和细胞骨架的重排，进而抑制巨噬细胞的吞噬，促进肿瘤的免疫逃逸。CD24在多种肿瘤中高表达，且显著高于CD47及PD-L1，肿瘤微环境中的巨噬细胞则高表达Siglec-10分子。敲除CD24能够增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，抑制免疫逃逸。CD24在卵巢癌及三阴性乳腺癌中的高表达最为明显，CD24的高表达还与卵巢癌及乳腺癌的不良预后密切相关。

CD24作为重要的免疫检查点分子，在肿瘤和其他免疫系统疾病的治疗中具有巨大的潜力。但CD24是一个非常小并且高度糖基化的蛋白，这给抗体药物的开发带来了很大挑战，目前该领域的研究仍处于起步阶段。CD24除了在癌细胞中广泛表达外，在正常细胞如部分上皮细胞中也有表达。鉴于此，开发亲和力高、抗肿瘤能力强、同时具备良好肿瘤选择性的新型CD24抗体，对于精确靶向肿瘤细胞、减少对正常细胞的损伤、提高治疗效果并降低副作用，具有重要的意义，可以为患者提供更加安全、有效的治疗选择，在肿瘤治疗领域将具有广泛的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗CD24抗体及其应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为实现上述目的，本发明首先提供了抗CD24抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1的第31-35位、SEQ ID NO:1的第50-66位和SEQ ID NO:1的第99-102位的三个互补决定区；所述轻链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID NO:3的第24-39位、SEQ IDNO:3的第55-61位和SEQ ID NO:3的第94-102位的三个互补决定区。

其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、抗体可变区(Fv)、二硫键稳定的Fv(dsFv)、单链抗体(ScFv)、单域抗体(sdAb，即纳米抗体)、微型抗体(minibody)和最小识别单位(MRU)等但不限于此。

所述互补决定区(CDR)的序列可根据Kabat编号系统定义。

所述重链可变区和轻链可变区均包含框架区(framework region，FR，在可变区中CDR以外的区域)。所述框架区可来源于人或非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、骆驼等)。

进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包括选自下述A1)-A4)中任一项的重链可变区和轻链可变区：

A1)所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:1，或将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:1相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:3，或将SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:3相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A2)所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:5，或将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:5相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:7，或将SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:7相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A3)所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:9，或将SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:9相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:11，或将SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:11相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A4)所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:13，或将SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:13相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID NO:15，或将SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:15相比具有80％以上同一性的氨基酸序列。

含有A1)中所述重链可变区和轻链可变区的抗体可为鼠源单克隆抗体，名称可为IMB4H7。

含有A2)中所述重链可变区和轻链可变区的抗体可为人源化抗体，名称可为IMB4H7h1。

含有A3)中所述重链可变区和轻链可变区的抗体可为人源化抗体，名称可为IMB4H7h2。

含有A4)中所述重链可变区和轻链可变区的抗体可为人源化抗体，名称可为IMB4H7h3。

进一步地，所述置换可为保守置换。所述氨基酸序列的不一致处可在框架区，例如在框架区中具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加。所述几个可以是2-10个或更多个。

进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还可包括重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。所述重链恒定区可选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区。所述重链恒定区还可选自CH1、Fc和CH3结构域。所述轻链恒定区可选自Kappa(κ)或lambda(λ)型轻链恒定区。所述重链恒定区和轻链恒定区可来源于人或非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、骆驼等)。

进一步地，所述重链恒定区可选自人IgG亚类如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的重链恒定区。所述重链恒定区也可选自小鼠IgG亚类如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4、IgG5和IgG6的重链恒定区。

进一步地，所述重链恒定区可为人IgGl、小鼠IgGl或小鼠IgG2b的重链恒定区。

进一步地，所述轻链恒定区可为人kappa或小鼠kappa的轻链恒定区。

具体地，所述重链恒定区的核苷酸序列可为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20。所述轻链恒定区的核苷酸序列可为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

B1)编码所述抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组宿主细胞。

上述生物材料中，所述重组载体可以是克隆载体也可以是表达载体。

进一步地，所述重组载体可为将编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子克隆到表达载体(如原核表达载体、真核表达载体和病毒表达载体)中得到的重组表达载体。虽然本发明提供的实施例利用的表达载体是pcMV3载体，但本发明不限于该特定载体。本领域技术人员可采用其它合适的载体，只要该载体能够表达编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子即可。

所述原核表达载体可选自大肠杆菌表达载体(例如pET系列载体等)。所述真核表达载体可选自酵母表达载体(如pYES2、pPICZaA等)、昆虫细胞表达载体(如pFastBac1、pMT-Bip-V5-HisA、pAc5.1等)和哺乳动物细胞表达载体(如pCMV3、pcDNA3.1等)。所述病毒表达载体可选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、慢病毒(LV)载体、痘病毒载体、逆转录病毒载体、棒状病毒(rhabdovirus，杆状病毒)载体、乳头瘤病毒载体、仙台病毒载体和猿猴病毒(Simian virus)表达载体。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的DNA分子；

C2)编码序列是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的DNA分子；

C3)编码序列是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的DNA分子；

C4)编码序列是SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的DNA分子。

本文所述核酸分子还可包括在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定点突变(包括寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变和盒式突变等)或定向进化(包括易错PCR、DNA改组和体外随机引发重组等)的方法，对本发明的编码本文中任一所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工改造的、与本发明的编码本文中任一所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列具有75％以上同一性的核苷酸序列，只要编码本文中任一所述抗体或其抗原结合片段，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

在某些实施方案中，可以在本发明中任一所述抗体或其抗原结合片段的一个或多个互补决定区或框架区内发生置换、插入或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对互补决定区和/或框架区做出保守变化(例如，保守置换，本领域技术人员所熟知，氨基酸的保守性取代不改变蛋白质的性质和功能)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在互补决定区中的抗原接触残基以外。

本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段，或所述生物材料在下述任一项中的应用：

D1)在制备用于预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用；

D2)在制备用于预防和/或治疗CD24靶点相关疾病的产品中的应用；

D3)在制备用于抑制CD24阳性肿瘤细胞增殖的产品中的应用；

D4)在制备用于抑制CD24阳性肿瘤生长的产品中的应用；

D5)在制备用于诊断、辅助诊断或筛查CD24靶点相关疾病的产品中的应用；

D6)在制备用于检测CD24蛋白或表达CD24的细胞的产品中的用途；

D7)在制备用于结合CD24蛋白的产品中的用途。

上述应用中，所述CD24靶点相关疾病包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌、结肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、胆管癌、肾癌、甲状腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、脑部肿瘤、头颈部肿瘤、口腔肿瘤、淋巴瘤、软组织瘤和白血病但不限于此。

所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。所述肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。

D1)中所述肿瘤或D2)中所述CD24靶点相关疾病可为CD24阳性肿瘤。

进一步地，所述CD24阳性肿瘤可为CD24阳性癌症。所述癌症包括早期癌症、中期癌症、中晚期癌症、晚期癌症、复发性癌症、转移性癌症和难治性癌症等。

D5)所述应用可包括基于抗原抗体特异性反应原理，利用本发明所述抗体或其抗原结合片段检测CD24蛋白表达水平，进而用于CD24靶点相关疾病(如CD24高表达的三阴性乳腺癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌等)的筛查和诊断(包括预后诊断、评估肿瘤的恶性程度等)。例如，可将本文中任一所述抗体或其抗原结合片段制备成免疫组化试剂盒，用于筛查或诊断CD24阳性肿瘤患者，并进一步指导用药及治疗。

D6)中所述检测CD24蛋白或表达CD24的细胞包括基于抗原抗体特异性反应原理的任何体内或体外的CD24蛋白的检测。所述检测CD24蛋白可为检测待测样品中是否含有CD24蛋白和/或检测待测样品中CD24蛋白的含量。所述表达CD24的细胞进一步可为表达CD24的肿瘤细胞。

D7)中所述用于结合CD24蛋白的产品包括CD24蛋白抑制剂、用于分离或纯化CD24蛋白的产品和CD24蛋白的体内显像产品但不限于此。例如：可将本发明所述抗体或其抗原结合片段制备成免疫亲和层析柱，基于抗原经过层析柱时可被抗体捕获、改变pH值等环境条件使抗原从中解离的原理，筛选分离出CD24蛋白。也可将本发明所述抗体或其抗原结合片段与具有成像功能的分子(包括但不限于放射性核素、近红外染料、荧光素酶、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点)偶联，注入患者体内后，基于抗体的靶向功能，可自行到达相应组织部位，进行免疫显像，即可实现针对CD24蛋白的活体成像。此外，本领域技术人员熟知，抗体是常用的蛋白抑制剂，它能够抑制其配体的活性，因此可将本发明所述抗体或其抗原结合片段制成CD24抑制剂或CD24参与的信号通路抑制剂(如CD24-Siglec10信号通路抑制剂)。

本文所述产品包括但不限于试剂、试剂盒(如治疗试剂盒或检测试剂盒)、制剂、药物、药物组合物、芯片、试纸、检测卡、免疫传感器等。

本发明还提供了抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含所述抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述抗体部分和偶联部分可直接连接，或通过接头(如腙键、二硫键、硫醚键、肽键)共价连接。

进一步地，所述偶联部分可选自化学药物、细胞毒素和可检测的标记。

进一步地，所述化学药物可以是预防或治疗疾病的化学药物，包括化疗药物、抗肿瘤药物、抗炎药物等，例如细胞因子、凋亡诱导剂(Bcl-xL抑制剂)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗代谢药物、硼药、烷化剂、激素和抗激素类药物、皮质类固醇、光动力治疗药物等。

进一步地，所述细胞毒素可以是抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的物质，包括微管蛋白抑制剂(如美登素、阿里他汀(MMAE和MMAF)、多西他赛、紫杉醇、长春新碱、秋水仙碱)、DNA损伤剂(如奥佐米星、卡奇霉素、杜卡霉素、喜树碱、倍癌毒素、丝裂霉素C(MMC)、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、异丙铂)、RNA合成抑制剂(如鹅膏毒素、泰兰司他丁及其类似物、卡莫司汀)或蛋白质合成抑制剂(如蓖麻毒素)。

进一步地，所述可检测的标记包括酶(如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶等)、化学发光试剂(如吖啶酯类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物等)、荧光染料(如AMCA、FITC、CFSE、GFP、DAPI、7-AAD、Hoechst 33342、Pacific Blue、PE、PE-TR、PE-Cy7、PE-Cy5、PI、PerCP-Cy5.5、APC、APC-CY7、APC-H7、V500、Alexa 700、BV605、BV480、BV785、BV510、BV711、BV421等)、近红外染料(如菁类染料、BODIPY类、罗丹明类、方酸类、卟啉类染料等)、放射性核素(如125I、18F、11C、99mTc、123I等)、生物素、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点、磁性物质(如磁珠、含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒)和胶体金等但不限于此。

所述接头(连接子)包括不可裂解连接子和可裂解连接子。所述连接子可选自N-琥珀酰亚基-4-(马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)、N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH)、琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)、Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)二肽、GGFG四肽、磷酸酶和焦磷酸酶连接子、β-半乳糖苷酶连接子和硫酸酯酶连接子。

进一步地，所述抗体偶联物可为抗体药物偶联物(ADC)。

进一步地，所述偶联部分也可为标签。为了使本发明所述抗体或其抗原结合片段便于分离、纯化、检测和/或定位，可在所述抗体或其抗原结合片段的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、Trx(硫氧还蛋白)标签蛋白、氮利用底物A(NusA)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA(流感血凝素)标签蛋白、Myc标签蛋白、LacZ标签蛋白、CBD(纤维素结合域)标签蛋白、噬菌体T7蛋白激酶(T7PK)标签蛋白、GFP(绿色荧光蛋白)、CFP(青色荧光蛋白)、YFP(黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的标签蛋白。标签的使用不改变抗体的功能，其目的在于分离、纯化、检测或示踪，因此适用于本申请的标签蛋白并不局限于特定种类。标签可以通过本领域已知的化学裂解法或酶法(如引入蛋白酶切位点利用TEV蛋白酶切割去除标签)与抗体进行分离。

本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包括所述抗体或其抗原结合片段、所述生物材料或所述抗体偶联物，以及一种或多种药学上可接受的载体。

所述药物组合物可具有下述至少一种用途：

(1)用于预防和/或治疗肿瘤；(2)用于预防和/或治疗CD24靶点相关疾病；(3)用于抑制CD24阳性肿瘤细胞增殖；(4)用于抑制CD24阳性肿瘤生长；(5)用于诊断、辅助诊断或筛查CD24靶点相关疾病。

进一步地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体选自赋形剂、防腐剂、保护剂、助溶剂、稀释剂(如水、生理盐水、PBS(磷酸盐缓冲液)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、PEG-400、二甲基亚砜等)、润湿剂、崩解剂(如干淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯比咯烷酮等)、润滑剂(如山梨坦三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠等)、填充剂(如淀粉、糊精等)、黏附剂(如明胶、果胶、阿拉伯胶、羟丙基纤维素(CP)、PVP、CMC-Na等)、促渗剂(如Brij-78)、pH调节剂、稳定剂(如亚硫酸钠、枸橼酸、酒石酸、EDTA等)、表面活性剂(如吐温、斯盘、桉叶油、聚山梨酯-80、十二烷基硫酸钠、豆磷脂、胆酸钠、去氧胆酸钠等)、吸收促进剂(如壳聚糖)、增稠剂(如透明质酸钠、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇等)、抗氧剂(如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素C等)、增塑剂(如甘油、山梨醇、苯二甲酸酯等)、抛射剂(如氢氟烷烃、二甲醚等)、烟雾化剂、悬浮剂、分散剂、着色剂(如TiO₂、色素等)和矫味剂。本领域技术人员知晓，一种载体通常具有多种功能，例如淀粉既可以作为崩解剂，又可以作为黏合剂。本领域技术人员可以根据药物性质和给药途径对上述载体进行常规选择。

赋形剂通常在药品中用于使药品成型，改变药物的物理状态，起到支架作用。赋形剂包括但不限于：(1)注射液的赋形剂：如溶剂水、醇类、醚类、酰胺类、亚枫类、酯类等；(2)注射用粉针剂的赋形剂：如蔗糖、乳糖、甘露醇等；(3)喷雾剂的赋形剂：如大豆卵磷脂、丙二醇、冰片、乙醇、苯酚等；(4)片剂的赋形剂：如淀粉、蔗糖、糊精、甲基纤维素、明胶、聚乙二醇、酒石酸、硼酸等；(5)滴眼剂的赋形剂：如玻璃酸钠、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)等；(6)栓剂的赋形剂：如可可豆脂、半合成或全合成脂肪酸甘油酯、甘油明胶、聚乙二醇等；(7)颗粒剂的赋形剂：如玉米粉、膨润土、沸石粉等；(8)胶囊剂的赋形剂：如明胶等；(9)凝胶剂的赋形剂：如明胶、果胶、阿拉伯胶等；(10)软膏剂的赋形剂：如凡士林、石蜡、液状石蜡、羊毛脂、羊毛醇、蜂蜡、豚脂、植物油、硅油、硅酮、皂类、高级脂肪醇、脂肪醇硫酸酯、多元醇、聚乙二醇、FAPG等；(11)贴剂的赋形剂：如乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)、压敏胶(PSA)等；(12)膜剂的赋形剂：如明胶、虫胶、阿拉伯胶、聚乙烯醇类化合物、丙烯酸共聚物等。

生物药物制剂在生产、运输及保存过程中容易受到外源微生物的污染，从而可能会影响药品质量，因此通常可加入防腐剂来抑制微生物的生长和繁殖。所述防腐剂包括但不限于硫柳汞、甲醛、苯酚和间甲酚。

保护剂通常可指能够保护药品活性的任何物质，包括冻干保护剂。冻干保护剂可用于改变生物样品在冻干时的物理化学环境、减轻细胞的损伤、保持原有的生物活性、提高蛋白质及细胞的稳定性等。所述冻干保护剂包括但不限于糖类/多元醇(如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、甘露醇、山梨醇等)、聚合物(如HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等)、无水溶剂(如聚乙二醇、乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等)、表面活性剂(如Tween-80等)、氨基酸(如L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、乙酰色氨酸等)，以及盐和胺(如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐等)。

所述药物组合物的剂型包括但不限于注射剂(包括注射液和注射用粉针剂)、凝胶剂、滴眼剂(包括滴眼液和眼内注射溶液)、口服溶液剂、栓剂、泡腾片、胶囊剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、气雾剂、外用溶液剂、片剂、粉剂、丸剂、散剂、划痕剂、颗粒剂、滴剂、涂剂、贴片和长效缓控释制剂。本领域技术人员知晓，利用活性组分(如本发明的抗体或其抗原结合片段)，配以合适的药学上可接受的载体，按照制剂常规制备工艺，可制成上述各种剂型。

进一步地，所述药物组合物的剂型可为注射制剂。

注射剂通常是指药材经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液，以及供临用前配制成溶液的无菌粉末，其包括注射液和注射用粉针剂。注射剂的制备方法是本领域技术人员熟知的，例如可通过真空冷冻干燥技术、喷雾干燥技术、喷雾冷冻干燥技术制备注射用粉针剂。也可通过将药物与合适的稀释剂、助溶剂和/或润湿剂等通过浓配法或稀配法配制成溶液，再通过滤过(如表面滤过和/或深层滤过)、灌封、灭菌等步骤制备注射液。

为了将所述药物组合物制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的稀释剂如水、生理盐水、PBS(磷酸盐缓冲液)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、PEG-400、二甲基亚砜等作为溶剂配制注射液。另外，为了制备等渗注射液，还可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油等载体，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等载体。

所述药物组合物的给药方式包括但不限于注射给药(如通过注射剂形式给药)、黏膜给药(如通过喷雾剂、气雾剂、片剂、滴眼剂、栓剂、颗粒剂、胶囊剂等形式给药)和经皮给药(如通过凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂等形式给药)。

所述药物组合物的施用方式包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、透皮注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、腹膜内注射、鞘内注射、微针注射、瘤内注射、颅内注射、粘膜给药、口服、皮肤涂抹、口鼻腔喷入、雾化吸入、体内植入和体外携带装置给药。

所述药物组合物的活性成分可为本文中任一所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有所述抗体或其抗原结合片段。

所述试剂盒可具有下述至少一种用途：(1)诊断、辅助诊断或筛查CD24靶点相关疾病；(2)检测CD24蛋白或表达CD24的细胞；(3)抑制或结合CD24蛋白(如CD24蛋白的分离、纯化和体内显像)。

进一步地，所述试剂盒可用于检测表达CD24的肿瘤细胞，或用于检测CD24阳性癌症是否存在于受试者中。

所述试剂盒的检测样本可为血液样本(如全血、血浆、血清)、组织样本、细胞样本等但不限于此。

所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、免疫沉淀检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒但不限于此。

进一步地，所述试剂盒还可包括免疫检测所需试剂，如标记抗体或抗原、磁微粒、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液等但不限于此。

所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

所述试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，组分的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

本发明还提供了抗CD24抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并回收或分离所述抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述制备方法可包括如下步骤：将编码本发明所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子克隆到表达载体(如原核表达载体、真核表达载体和病毒表达载体)中得到重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述抗体或其抗原结合片段的重组宿主细胞；培养所述重组宿主细胞，从培养的重组宿主细胞培养物中回收或分离所述抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述回收或分离可通过沉淀法(如盐析法、有机溶剂沉淀法、辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、等电点沉淀法)或层析技术(如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析)从培养物(包括培养容器内的所有物质)中分离。

所述导入的方法可包括以下任一种：(1)通过化学转化法(如Ca离子诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法等)或物理转化法(如电穿孔转化法)将目的基因或含有目的基因的重组载体导入宿主菌。(2)通过噬菌体转导的方法将目的基因转导进入宿主菌。(3)通过物理或化学方法将目的基因直接转入植物受体细胞，如化学刺激法、电击法、脂质体介导法、显微注射法、基因枪法、激光微束法、花粉管通道法、超声波法、气枪法和涡流法等。(4)以载体为媒介将目的基因转入植物受体细胞，如农杆菌Ti质粒载体(包括Ti质粒衍生的载体如共整合载体系统和双元载体系统)介导法。(5)通过磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法(如DEAE-葡聚糖转染法)、阳离子脂质体法、电穿孔法(即电转染法)、显微注射、基因枪法或病毒介导法(如腺病毒感染法、慢病毒感染法)等将目的基因导入离体动物细胞(转染)。

本发明的抗体可为单克隆抗体或人源化抗体(包括嵌合抗体、CDR移植抗体和SDR移植抗体)。

CD24在癌细胞中广泛表达，但其在正常细胞如部分上皮细胞上也有表达。因此，本领域需要能够将肿瘤细胞与正常细胞区分开的方法。肿瘤细胞与正常细胞表达的CD24糖基化程度不同。本发明通过杂交瘤技术，采用KLH偶联CD24抗原多肽经皮下免疫+细胞冲击免疫(CHO-hCD24细胞)的方法，成功筛选到了亲和力高，针对非糖基化修饰的CD24的单克隆抗体(IMB4H7)。本发明进一步利用CDR移植法对获得的鼠源单克隆抗体IMB4H7进行人源化改造，得到了3种人源化抗体：IMB4H7h1、IMB4H7h2和IMB4H7h3。

本发明的抗CD24抗体(IMB4H7、IMB4H7h1、IMB4H7h2和IMB4H7h3)与商业化CD24抗体SN3相比，对肿瘤细胞的亲和力有较大提升，与多种肿瘤细胞和肿瘤组织结合较强，但与正常细胞结合较弱。本发明的抗CD24抗体与去糖基化的CD24结合显著增强，说明该抗体与CD24的结合可能被正常细胞而非癌细胞中的糖基化所阻断，使得该抗体具备良好的肿瘤选择性。体内治疗实验结果表明，本发明的抗CD24抗体有显著抗肿瘤疗效，能显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率可达82.3％。

本发明的抗CD24抗体可以在原核细胞、真核细胞及各类重组系统中表达和生产，可制成临床上用于CD24靶点相关疾病的预防和/或治疗药物、诊断药物、CD24蛋白的检测试剂盒或CD24蛋白的体内显像产品等，可单独使用也可与其他治疗药物联合使，或作为载药系统携带相关药物进行靶向递送，在肿瘤的治疗和诊断等领域具有十分广阔的临床应用前景。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

术语“同一性”通常是指两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。本文所述同一性可指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。此外可以使用序列分析软件(如CLC Main Workbench和MegAlignTM)进行测定，例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本文所述75％以上同一性可为至少75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。本文所述80％以上同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。

术语“保守置换(保守性取代)”通常是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser，Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守置换。本领域己知保守置换通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，基本上不改变蛋白质的生物学活性。蛋白质序列中预计对蛋白质结构或功能只有极小影响或根本无影响的保守置换可由本领域普通技术人员很容易地进行设计。

术语“抗体偶联物”在本文中不仅包括抗体通过连接子与药物(预防、治疗、诊断疾病的物质)偶联形成的抗体药物偶联物(ADC)，还包括抗体与可检测的标记或标签偶联得到的偶联物。

术语“CD24阳性肿瘤”通常是指表达CD24蛋白的肿瘤。检测肿瘤CD24蛋白表达的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以通过基于抗原抗体特异性反应的免疫学检测法(如免疫组织化学法、FACS等)测定CD24蛋白的表达，也可以通过实时荧光定量PCR、Northernblotting或RNA原位杂交的方法来测定CD24 mRNA的表达。

术语“抗原结合片段”通常是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。本领域技术人员熟知，所述抗原结合片段可以可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。

附图说明

图1为纯化后的抗体SDS-PAGE电泳图。

图2为流式细胞术检测IMB4H7抗体的亚型。

图3为流式细胞术检测IMB4H7及SN3与CHO-hCD24及CHO-K1细胞的结合，同时以小鼠IgG作为同型对照。

图4为流式细胞术检测IMB4H7g1与CHO-hCD24及CHO-K1细胞的结合，同时以小鼠IgG作为同型对照。

图5为流式细胞术检测IMB4H7及SN3与去除了N-聚糖(SKOV3+PNGase F)及唾液酸(SKOV3+唾液酸)的CD24的结合。

图6为流式细胞术比较人源化抗体IMB4H7h1、IMB4H7h2及IMB4H7h3与SN3对CHO-hCD24及CHO-K1细胞的结合活性。

图7为流式细胞术检测人源化抗体IMB4H7h1、IMB4H7h2、IMB4H7h3及鼠源抗体IMB4H7的半数有效结合浓度。

图8为流式细胞术检测IMB4H7h2抗体与多种肿瘤细胞的结合。

图9为流式细胞术比较人源化抗体与人正常细胞及癌细胞结合的差异。

图10为组织芯片检测IMB4H7与不同瘤组织的结合(平均值±SEM)。

图11为IMB4H7h2抗体在双侧荷瘤小鼠体内分布。

图12为IMB4H7体内抗肿瘤活性。

图13为IMB4H7对小鼠体重的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CD24抗体的制备及结合活性检测

本发明选用人CD24胞外区片段(SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAP，SEQ ID NO:17)接种小鼠，取其血清，筛选出滴度高的小鼠。通过杂交瘤技术制备CD24抗体，具体步骤如下：

1、构建高表达人CD24的中国仓鼠卵巢癌细胞

将人CD24(hCD24，Uniprot:P25063)编码基因克隆至PHBLV慢病毒载体(由杭州来伯生物技术有限公司制备)，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，得到重组载体，将该重组载体转染CHO-K1细胞((武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0062)，运用有限稀释法得到高表达人CD24的中国仓鼠卵巢癌细胞株，命名为CHO-hCD24细胞。上述细胞使用Ham's F-12K培养基培养，添加10％(v/v)胎牛血清及1％青霉素-链霉素溶液。

2、小鼠免疫

通过商业途径合成SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPC-KLH肽，每只BALB/c小鼠(6-8周龄)使用30μg KLH偶联多肽经皮下免疫，免疫前使用弗式完全佐剂乳化，每两周一次，共三次；两周后，再运用1×10⁷个CHO-hCD24细胞冲击免疫一次。

3、细胞融合

经过上述免疫后，取小鼠血液，运用CHO-hCD24细胞进行抗体效价检测，将阳性率最高的两只小鼠处死，取脾脏细胞与SP2/0细胞(杭州来伯生物技术有限公司)融合。对融合细胞进行效价检测，筛选阳性融合细胞，使用有限稀释法挑取单克隆。

4、杂交瘤细胞筛选

通过流式细胞术挑选与CHO-hCD24细胞结合活性较高的克隆。流式检测步骤如下：收集处于对数期生长的CHO-hCD24细胞1×10⁶个，300g离心5分钟后收集沉淀，使用染色液(含有1％BSA的预冷PBS)重悬细胞，每种细胞按照每管100μL的量分装到流式检测管中。加入按不同比例稀释的待检测抗体(即杂交瘤细胞培养上清液)，4℃孵育30分钟，染色液洗3次后，使用FITC标记的抗鼠IgG二抗4℃孵育30分钟，染色液洗3次后，用于流式细胞仪检测荧光强度。将流式挑选的克隆再进行亚克隆的筛选，最终得到与CHO-hCD24细胞具有较强结合活性的阳性单克隆。将获得的一株与CHO-hCD24细胞具有最强结合活性的、能分泌CD24单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4H7细胞。该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为IMB4H7。

将获得的杂交瘤细胞株4H7注射8-12周龄BalB/c小鼠腹腔，细胞浓度为1×10⁶个细胞/只。7-10天后收集含有单克隆抗体的腹水。使用Protein A亲和柱纯化腹水中的抗体。纯化方法为：(1)20mM PB，pH 7.0平衡1mL-Protein A亲和柱，1.0mL/min；(2)上样培养液50mL，1mL/min，使用平衡液平衡；(3)0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7洗脱，1mL/min，收集280nm吸收峰；(4)20-50mM PB，150mM NaCl，pH 6.7平衡Superdex 200Increase10/300GL柱，1mL/min；(5)上样，收集280nm吸收峰2mL。得到鼠源抗CD24单克隆抗体IMB4H7。10％ SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，可见抗体重链及轻链、无杂带(图1)。

5、单克隆抗体序列和亚型的确定

对单克隆抗体进行亚型鉴定及测序分析。步骤如下：1)分装适量的杂交瘤细胞于1.5mL Ep管中，4000rpm，离心5分钟，吸弃上清。2)50μL由PBS1:500稀释的Goat anti-mouseIgG-FITC，Goat anti-mouseIgG1-FITC，Goat anti-mouseIgG2a-FITC，Goat anti-mouseIgG2b-FITC(杭州来伯生物技术有限公司)重悬上述细胞，4℃静置15分钟。3)4000rpm，5分钟，吸弃上清。6)400μL PBS重悬细胞，流式分析。结果如图2所示，IMB4H7抗体亚型为IgG2b。

在Sanger测序获得核苷酸序列的基础上，利用三联密码子编码一个氨基酸的规则，获得对应氨基酸序列。最终确定单克隆抗体IMB4H7重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；单克隆抗体IMB4H7轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

其中：

单抗IMB4H7重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第31-35位所示；

单抗IMB4H7重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第50-66位所示；

单抗IMB4H7重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第99-102位所示；

单抗IMB4H7轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3的第24-39位所示；

单抗IMB4H7轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3的第55-61位所示；

单抗IMB4H7轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3的第94-102位所示。

6、单克隆抗体结合活性的检测

采用流式细胞术检测单抗IMB4H7及商业化CD24抗体SN3(Invitrogen公司，货号11-0247-42)与CHO-K1细胞及CHO-hCD24细胞的结合，同时以小鼠IgG作为同型(Invitrogen公司，货号02-6502)对照。检测结果如图3所示，IMB4H7与CHO-hCD24细胞表现出较强的结合，且结合力强于SN3，两种抗体均与CHO-K1细胞结合较弱。

7、基因工程方法制备抗体

基因工程方法制备抗体时，将IMB4H7抗体的重链恒定区替换为小鼠IgG1重链恒定区，该抗体命名为IMB4H7g1,分别制备重链表达载体和轻链表达载体：单抗IMB4H7g1重链基因的核苷酸序列是将IMB4H7重链可变区编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)与小鼠IgG1重链恒定区编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)直接连接而得。

单抗IMB4H7g1轻链基因的核苷酸序列是将IMB4H7轻链可变区编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)与小鼠kappa轻链恒定区编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)直接连接而得。

将单抗IMB4H7g1重链基因和轻链基因分别克隆到pcMV3载体(北京义翘神州科技股份有限公司)中，得到重链表达载体和轻链表达载体。

将重链表达载体和轻链表达载体转染HEK293细胞，细胞在无血清培养基中37℃培养6天，收集培养上清液，使用Protein A亲和柱进行纯化，方法同施例1中步骤4。流式检测IMB4H7g1(4μg/mL)与CHO-K1及CHO-hCD24的结合，方法同实施例1步骤4，同时以小鼠IgG为同型对照，结果显示IMB4H7g1与CHO-hCD24细胞具有良好的结合活性，但与CHO-K1细胞结合较弱(图4)。

实施例2、单抗IMB4H7能结合于低糖基化的CD24

唾液酸酶(NEU1、NEU3)及CD24在卵巢癌中均高表达(Nomura H et al.,2006)，提示CD24在肿瘤中可能被低糖基化。运用唾液酸酶(NEW ENGLAND Biolabs,货号P0722S)及PNGase F(肽N-糖苷酶F，NEW ENGLAND Biolabs,货号P0704S)处理卵巢癌SKOV3细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0215)后，流式检测IMB4H7及SN3抗体与细胞的结合。实验参照说明书进行，具体步骤如下：胰酶消化收集SKOV3细胞，PBS洗两遍；分3个EP管，每管1×10⁶个细胞；唾液酸酶组：加2μL唾液酸酶+2μL GlycoBuffer 1(10×,50mM CaCl2,500mMsodium acetate,pH 5.5)+18μL水；PNGase F组：加2μL PNGase F+2μL GlycoBuffer 2(10×,500mM Sodium Phosphate,pH 7.5)+18μL水；空白组：加1μL GlycoBuffer 1(10×)+1μLGlycoBuffer 2(10×)+20μL水；37℃孵育24小时；PBS洗样品两次，离心弃上清，每个EP管分两个样品，分别加IMB4H7及SN3抗体(4μg/mL)，4℃孵育45分钟，PBS洗两遍离心弃上清，加FITC标记二抗(1:100)，4℃孵育45分钟，PBS洗两遍，加500μL PBS，流式检测。

结果如图5所示，SKOV3细胞经唾液酸酶或PNGase F处理后，与SN3的结合均减弱，但与IMB4H7的结合均显著增强。说明抗体SN3与CD24的结合依赖于唾液酸聚糖及N-糖基化，而单抗IMB4H7能够结合于低糖基化的CD24。

实施例3、单抗IMB4H7的人源化及其结合活性检测

运用CDR移植法对IMB4H7抗体进行人源化改造，保留鼠源CDR，用人的框架区(FR)替代鼠FR，选用人源恒定区(C区)，得到3种人源化抗体：IMB4H7h1、IMB4H7h2及IMB4H7h3。

人源化抗体IMB4H7h1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；人源化抗体IMB4H7h1轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。人源化抗体IMB4H7h2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；人源化抗体IMB4H7h2轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。人源化抗体IMB4H7h3重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示；人源化抗体IMB4H7h3轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

人源化抗体IMB4H7h1、IMB4H7h2及IMB4H7h3的重链恒定区均为人IgG1，重链恒定区编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。人源化抗体IMB4H7h1、IMB4H7h2及IMB4H7h3的轻链恒定区均为人kappa链，轻链恒定区编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:21。

参照实施例1中步骤7的基因工程方法制备人源化抗体，将人源化抗体轻、重链序列克隆到pcMV3载体，瞬时转染HEK293细胞，37℃培养6天，收集培养上清液，亲和纯化抗体。流式细胞术比较3种人源化抗体及抗体SN3与CHO-hCD24细胞结合能力的强弱，同时以CHO-K1细胞为对照。结果显示3种人源化抗体均能与CHO-hCD24细胞结合，且结合能力显著强于SN3抗体(图6)，4种抗体均不能与CHO-K1细胞结合。流式细胞术检测不同浓度3种人源化抗体及鼠源IMB4H7抗体与CHO-hCD24细胞的结合能力，计算半数有效浓度EC₅₀值。结果如图7所示，3种人源化抗体及IMB4H7抗体的EC₅₀值分别为2.039μg/mL、1.491μg/mL、1.089μg/mL及2.608μg/mL。

实施例4、CD24抗体与多种肿瘤细胞的结合检测

本实施例以IMB4H7h2抗体为例，流式细胞术检测人源化抗体与多种不同组织来源的肿瘤细胞的结合。人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人肝癌HuH-7细胞及人黑色素瘤细胞A375培养于DMEM培养基，人肺癌A549细胞培养于Ham's F-12K培养基，人胃癌NUGC-4细胞培养于RPMI-640培养基，人卵巢癌细胞SKOV3培养于McCoy's 5A培养基。所有细胞培养基中均加入10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素，在37℃含5％ CO₂的培养箱(Thermo Scientific，3131二氧化碳培养箱)中培养。以上肿瘤细胞株均为常见细胞株，取自中国医学科学院医药生物技术研究所保存，或者商业途径如ATCC细胞库(Rockville,MD，USA)、国家实验细胞资源共享平台等购得。流式检测方法同实施例1步骤4，二抗为抗人IgG-FITC，同时以人IgG1 kappa(北京义翘神州科技股份有限公司，货号：HG1K)作为同型对照。实验结果如图8所示，IMB4H7h2抗体与以上肿瘤细胞均具有较强的结合。

实施例5、CD24抗体与肿瘤细胞及正常组织细胞的结合检测

流式细胞术比较三种人源化抗体与人正常乳腺上皮细胞MCF 10A及人乳腺癌细胞MDA-MB-468的结合强弱。MCF 10A细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0525)培养于DMEM/F12+5％马血清+20ng/mL EGF+0.5μg/mL氢化可的松+10μg/mL胰岛素+1％非必需氨基酸+100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素培养基中，MDA-MB-468细胞培养方法同实施例4，流式检测方法同实施例4。结果显示三种人源化抗体与MDA-MB-468细胞强结合，但与人正常乳腺上皮细胞MCF 10A不结合(图9)。

实施例6、组织芯片检测CD24抗体与不同肿瘤组织结合活性

本实施例以IMB4H7抗体为例，对含20种不同器官、每种器官包括20例癌组织的组织芯片(上海暇步康生物科技有限公司)进行免疫组化分析。包括胃癌、黑色素瘤(皮肤、直肠、小肠)、前列腺癌、脑部肿瘤(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、卵巢癌、乳腺癌、睾丸癌、结肠癌、膀胱癌、子宫癌、甲状腺癌、肺癌、头颈部/口腔肿瘤、淋巴瘤、软组织瘤、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、食管癌。具体步骤如下：将组织芯片放在59℃恒温箱中烘烤60分钟，二甲苯脱蜡，无水乙醇梯度水化，3％ H₂O₂浸泡10分钟灭活，EDTA(PH8.0)修复液修复抗原两次，每次高火10-12分钟，滴加5％BSA封闭液，室温35分钟。滴加IMB4H7抗体工作液，4℃过夜，用PBS洗4次，滴加HRP标记抗小鼠二抗，37℃下35分钟，用PBS洗涤4次。DAB显色剂显色，显色完，滴加苏木素染液，浸染2分钟，冲洗10分钟，观察颜色。芯片在1缸无水乙醇中涮一下，2缸无水乙醇、3缸二甲苯中各放3分钟脱水。加1滴封片塑胶，盖片。以上试剂均为常用商业化试剂。扫片后(PANNORAMIC MIDI扫描仪，3DHISTECH Ltd)运用halo软件进行定量分析。图10总结了IMB4H7抗体与不同肿瘤组织结合的组织化学评分(H-score)结果，显示大多数肿瘤组织都表现出强结合。

实施例7、CD24抗体在荷瘤鼠体内的分布

本实施例首先运用DyLight 680NHS酯(Thermo scientific，货号46419)标记IMB4H7h2抗体。取0.37mL IMB4H72(2.73mg/mL)，加入3.17μL DyLight 680NHS酯(10mg/mL)室温孵育1小时，样品中加入PBS至总体积为1mL，过PD MidiTrap G-25柱(GE Healthcare)收集洗脱液，除去过量未反应的荧光素，超滤管(Amion Ultra-4)浓缩样品，BCA定量，得到DyLight 680-IMB4H7h2。将CHO-hCD24及CHO-K1细胞按5×10⁶/只分别接种至BALB/c裸小鼠(雌，18-22g,北京药康生物科技有限公司)左右两侧腋窝皮下，待肿瘤生长至200-300mm³时，尾静脉注射DyLight 680-IMB4H7h2抗体，0.5小时及6小时后进行活体显像，成像仪器IVIS-200Imaging System(Xenogen，美国)，激发光/发射光波长：675/760nm。结果显示抗体在注射0.5小时后即开始在CHO-hCD24一侧富集，6小时后有显著富集；而CHO-K1一侧在注射6小时后只有少量富集(图11)。以上结果表明IMB4H7h2抗体能显著富集于CD24高表达的肿瘤一侧。

实施例8、IMB4H7抗体的动物试验性治疗方案

运用高表达人CD24的中国仓鼠卵巢癌细胞CHO-hCD24异种移植瘤模型评价IMB4H7抗体的体内疗效。CHO-hCD24细胞按5×10⁶/只接种BALB/c裸小鼠腋窝皮下(雌，18-22g,北京药康生物科技有限公司)。待瘤块长至平均约50mm³时，按瘤块大小分成对照组和IMB4H7组，尾静脉给药，给药剂量10mg/kg，0.2mL/只，1次/3天，共给药4次，对照组注射生理盐水。实验期间每2-3天测量一次肿瘤长径a和与之垂直的短径b，并记录动物体重。以公式V＝1/2ab²计算瘤体积，同时计算抑制率((对照组瘤体积－试验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％)。实验结果表明，IMB4H7抗体体内有显著疗效，能显著抑制CHO-hCD24皮下瘤的生长，实验第13天，抑瘤率达82.3％(图12)。与对照组相比，体重无明显下降(图13)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.抗CD24抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1的第31-35位、SEQ ID NO:1的第50-66位和SEQ ID NO:1的第99-102位的三个互补决定区；所述轻链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID NO:3的第24-39位、SEQ ID NO:3的第51-61位和SEQ IDNO:3的第94-102位的三个互补决定区。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括选自下述A1)-A4)中任一项的重链可变区和轻链可变区：

A1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，或将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:1相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，或将SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:3相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，或将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:5相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，或将SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:7相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，或将SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:9相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，或将SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:11相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；

A4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，或将SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:13相比具有80％以上同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，或将SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的置换、缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:15相比具有80％以上同一性的氨基酸序列。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组宿主细胞。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的DNA分子；

C2)编码序列是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的DNA分子；

C3)编码序列是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的DNA分子；

C4)编码序列是SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的DNA分子。

5.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求3或4所述的生物材料在下述任一项中的应用：

D1)在制备用于预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用；

D3)在制备用于抑制CD24阳性肿瘤细胞增殖的产品中的应用；

D4)在制备用于抑制CD24阳性肿瘤生长的产品中的应用；

D7)在制备用于结合CD24蛋白的产品中的用途。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CD24靶点相关疾病包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌、结肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、胆管癌、肾癌、甲状腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、脑部肿瘤、头颈部肿瘤、口腔肿瘤、淋巴瘤、软组织瘤和白血病。

7.抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其特征在于，所述抗体部分包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。

8.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的抗体偶联物，以及一种或多种药学上可接受的载体。

9.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。

10.抗CD24抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在宿主细胞中表达权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，并回收或分离所述抗体或其抗原结合片段。