CN119899248A - 一种Rhodospirillales新型抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗菌肽技术领域，公开了一种Rhodospirillales新型抗菌肽及其应用，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明获得的抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果。

Description

一种Rhodospirillales新型抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其涉及一种Rhodospirillales新型抗菌肽及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。金黄色葡萄球菌在适当的条件下，能够产生肠毒素，从而引起食物中毒，影响消费者的安全。在现有技术中，虽然采用抗生素可用于抑制致病菌，抗生素通过干扰金黄色葡萄球菌的生长和繁殖，帮助宿主免疫系统清除感染。但是抗生素的使用具有限制，抗生素大量的使用不仅会造成了金黄色葡萄球菌的抗菌素耐药性，而且在食品的生产、储存或者运输过程中是不允许使用抗生素。

因此，各行业越来越多地探索替代传统抗生素的替代方案，其中以抗菌肽(AMP)为代表。AMP是原核生物和真核生物的重要组成部分，这些小肽通常由12-50个氨基酸组成，具有广谱抗菌、抗真菌和抗病毒能力，在药理学治疗和预防应用中具有很高的价值。所以，了解和运用AMP至关重要，因为它们为传统抗生素提供了一种有希望的替代品，为抑制食品中的金黄色葡萄球菌提供解决方案。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种Rhodospirillales新型抗菌肽及其应用，本发明获得的抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果。

本发明提供了一种Rhodospirillales新型抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了抗菌组合物，所述抗菌组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1的抗菌肽。

本发明还提供了编码所述抗菌肽的编码基因。

本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物或重组微生物。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

本发明还提供了所述抗菌组合物在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备添加剂中的应用，所述添加剂为化妆品、饲料或食品添加剂中的任意一种。

本发明还提供了所述抗菌肽在非疾病治疗和/或非疾病诊断的抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

进一步的，所述抗菌肽抑制金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为3.125μM。

本发明实施例具有以下技术效果：

本发明获得了一种新的抗菌肽，该抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果。且本发明获得的抗菌肽的结构特征有利于抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌，从而抑制金黄色葡萄球菌的增长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明实施例提供的抗菌肽的基因组谱图。

图2是本发明实施例提供的抗菌肽的三维结构图。

图3是本发明实施例提供的抗菌肽的抑菌效果图。

图4是本发明实施例提供的抗菌肽的最小抑菌浓度数据图。

图5是本发明实施例提供的抗菌肽应用于鸡肉中。

图6是本发明实施例提供的抗菌肽应用于牛奶中。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

第一方面，本发明一些实施例方式中提供了一种Rhodospirillales新型抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明一些实施例方式中还提供了抗菌组合物，所述抗菌组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1的抗菌肽。

第三方面，本发明一些实施例方式中还提供了编码所述抗菌肽的编码基因。

第四方面，本发明一些实施例方式中还提供了含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物或重组微生物。

第五方面，本发明一些实施例方式中还提供了所述抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

第六方面，本发明一些实施例方式中还提供了所述抗菌组合物在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

第七方面，本发明一些实施例方式中还提供了所述抗菌肽在制备添加剂中的应用，所述添加剂为化妆品、饲料或食品添加剂中的任意一种。

第八方面，本发明一些实施例方式中还提供了所述抗菌肽在非疾病治疗和/或非疾病诊断的抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

一些实施例方式中，所述抗菌肽抑制金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为3.125μM。

下面结合实施例和对比例进行阐述：

实施例1：基于宏基因组分相关技术获得微生物的基因组：

从NCBI公共数据库中下载了ERR10503260，来自于深海极端环境。使用TrimGalore（v. 0.5.0）进行质控，去除适配器序列和低质量读长（质量评分<20分），获得cleanreads。使用MEGAHIT对clean reads进行组装。使用seqtk根据序列长度过滤组装结果的contigs（保留长度为1500 bp）。使用Bowtie2将clean reads映射到相应的contig。使用Samtools将映射结果转换为BAM格式。使用SAMtools对BAM文件进行排序和索引，然后，利用Metabat产生基因组。获得了基因组ERR10503260_metabat2.9。使用CheckM2分析基因组的完整度和污染度，分别为90.63%和2.59%，满足MIMAG对基因组的要求。使用GTDB-Tk进行物种注释，显示结果该基因组为细菌的Rhodospirillales目的GCA-2686765 sp030623425（如图1所示），详细注释信息如下

d__Bacteria;p__Pseudomonadota;c__Alphaproteobacteria;o__Rhodospirillales_A;f__JADFTO01;g__GCA-2686765;s__GCA-2686765 sp030623425。

该基因组形成的抗菌肽(抗菌肽745)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ IDNO:1为：RRLWKILTTLVVLSAALKGLFGGK。

根据获取的抗菌肽的氨基酸序列，合成抗菌肽：

（1）根据多肽序列C端的第一个氨基酸，选取0.5mmol对应的Fmoc保护氨基酸-WangResin, 加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂30min后，抽干，用DMF洗涤三遍，加入体积比为20%的六氢吡啶DMF溶液，反应5min，再次加入20%的六氢吡啶DMF溶液反应10分钟，中间DMF洗涤一次，反应结束抽干，DMF洗涤3遍。

（2）按照多肽从C端到N端的序列，依次按照1.5mmol的氨基酸反应量，交替进行缩合反应和Fmoc脱除反应，根据抗菌肽的氨基酸顺序，将氨基酸全部缩合到树脂上，最后一个氨基酸缩合完之后，加入体积比为20%的六氢吡啶DMF溶液，反应5min，再次加入20%的六氢吡啶DMF溶液反应10分钟，中间DMF洗涤一次，反应结束抽干，DMF洗涤3遍。

（3）在反应器中加入1mmol的FITC和N-甲基吗啡啉，反应5-10分钟，用茚三酮检测其是否反应完全，反应完全之后，用DMF和DMC交替洗涤三次，然后用甲醇洗涤收缩，得到干燥的多肽-树脂。

（4）将多肽-树脂放入圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的裂解液（裂解液采用的试剂配方体积比例为TFA:苯甲硫醚:苯酚:三异丙基硅烷:水=82.5:7.5:5:3:2）缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液，将裂解液缓慢加入无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到粗品肽。

（5）用质谱检测粗品的分子量是否正确，如果正确，用高效液相色谱进行纯化分离，冻干，然后得到纯品多肽。

对实施例1获得抗菌肽进行测试：

（1）使用AlphaFold2预测其三维结构，结果如图2所示。

（2）抗菌肽抑菌谱的测定：将前期储藏的致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特氏菌）从-80℃冰箱中取出通过接种环蘸取少量菌液，在LB固体培养基（市购）上进行三区划线，于37℃恒温箱中培养16-24h。

待平板长出单菌落后使用灭菌后的接种环挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中放置在37℃恒温摇床中活化16-24h。

将活化后的致病菌培养液吸取1mL接至装有100mL的LB液体培养基（市购）中，37℃，200rmp培养16-24h，使用酶标仪测定生物量，使最终生物量OD₆₀₀达到1.0-1.2之间。

取40μL培养好的菌液用涂布棒分别均匀涂布在LB固体培养基上，将灭菌后的32个滤纸片(滤纸片的直径为6mm)以相同间隔分别置于布满致病菌的平板上，将浓度为400μM的抗菌肽溶液(抗菌肽分散在灭菌后的水中)取20μL在滤纸片上进行点样，点样完毕后将LB固体培养基于37℃中培养16-24h。

取培养完毕的LB固体培养基，观察并测量其形成的抑菌圈，该试验每株待测菌株重复三次，每次做三个平行，每个抑菌圈重复测量三次取平均值，最后以所有测得抑菌圈直径的平均值代表抗菌肽对该菌株的最终抑菌圈直径。结果发现，本发明的抗菌肽仅对金黄色葡萄球菌形成抑菌圈，如图3所示。

（3）抗菌肽最小抑菌浓度（MIC）的测定：

配制含抗菌肽的LB培养基溶液，抗菌肽的浓度为400μM。

将上述含抗菌肽的LB培养基溶液取500μL加至500μL的LB培养基中配得浓度为200μM的含抗菌肽的培养基溶液。

同理依次稀释为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM的含抗菌肽的培养基溶液，上述每个浓度的含抗菌肽的培养基溶液分别准备6mL。

同样的，配制含天然抗菌肽乳酸链球菌素（Nisin）的LB培养基溶液，天然抗菌肽乳酸链球菌素的浓度为400μM。依照上述步骤将天然抗菌肽乳酸链球菌素依次稀释为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM的含抗菌肽的培养基溶液。

将前期储藏的致病菌金黄色葡萄球菌从-80℃冰箱中拿出活化培养在LB固体培养基上，37℃培养16-24h。

待平板长出单菌落后使用灭菌后的接种环挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中放置在37℃恒温摇床中活化16-24h，使用酶标仪测定生物量，使最终生物量OD₆₀₀达到1.0-1.2之间，将活化好的菌液稀释100倍装入2mL无菌离心管中备用。

将含有不同浓度抗菌肽的培养基溶液分别取200μL置于无菌96孔培养板中，每种浓度进行三组平行实验，然后分别将已稀释好的10μL的金黄色葡萄球菌的菌液加入含有不同浓度抗菌肽的培养基溶液中，并采用未加入致病菌的含有抗菌肽的培养基溶液作为空白对照组。

按照上述方法，以相同方法做Nisin的对照。

将上述96孔板放置37℃，200rpm的摇床中培养16-24h，使用酶标仪测定生物量并确定其最小抑菌浓度（MIC）。

（4）抗菌肽在鸡肉保藏中的应用：

将生鸡肉切成1cm³左右见方的块（约0.27g），先使用0.5%次氯酸钠浸泡杀菌1min后，PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3次，再使用75%乙醇浸泡杀菌1min，PBS清洗3次后、紫外线均匀照射1.2h，使得生鸡肉无菌。

将前期储藏的金色葡萄球菌从-80℃冰箱中拿出活化培养在LB固体培养基上，37℃培养16-24h。

待平板长出单菌落后使用灭菌后的接种环挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中放置在37℃恒温摇床中活化16-24h，使用酶标仪测定生物量，使最终生物量OD₆₀₀达到1.0-1.2之间。

将上述活化好的菌液稀释至浓度为5×10³CFU/mL，将稀释好的菌液用无菌棉签均匀涂布于鸡肉方块的表面，放置25℃恒温箱中培养2h以感染鸡肉。

将浓度为3.125μM抗菌肽用无菌棉签均匀涂布于鸡肉方块的表面，放置25℃恒温箱中培养32h，并以PBS缓冲溶液用作PBS对照。

将鸡块均质并离心，然后将上清液稀释并铺展在相应的选择性培养基上以计数残留的活菌。

PBS缓冲溶液（pH 7.2）配方：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液100mL与0.2mol/L氢氧化钠溶液70mL，加新沸过的冷水稀释至400mL，调pH至7.2~7.4之间。

（5）抗菌肽在牛奶保藏中的应用：

将市售鲜牛奶各取30mL分装至耐高温的50mL锥型瓶中并用灭过菌的无菌膜密封瓶口。将高压灭菌锅设置115℃，30分钟，对鲜牛奶进行灭菌处理。灭菌后缓慢降温，冷却后立即使用4℃冰箱冷藏保存。

将前期储藏的金色葡萄球菌从-80℃冰箱中拿出活化培养在LB固体培养基上，37℃培养16-24h。

待平板长出单菌落后使用灭菌后的接种环挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中放置在37℃恒温摇床中活化16-24h，使用酶标仪测定生物量，使最终生物量OD₆₀₀达到1.0-1.2之间。

将上述活化好的菌液稀释至浓度为5×10³CFU/mL，将稀释好的菌液添加至上述装有灭菌牛奶的锥形瓶中，放置25℃恒温箱中培养2h以至于感染牛奶。

将浓度为3.125μM抗菌肽添加至上述装有菌液牛奶的锥形瓶中，放置25℃恒温箱中培养32h，并以灭菌后的无菌水用作空白对照。

将上述各牛奶稀释并铺展在相应的选择性培养基上以计数残留的活菌。

结果与分析：

在图2中，可以发现本发明的抗菌肽具有典型的α螺旋结构。抗菌肽745（RRLWKILTTLVVLSAALKGLFGGK）是一种具有潜在抗菌活性的肽段。结果显示该肽具有较高的结构可信度（pLDDT=83.7）和与实验结构较好的匹配度（pTM=0.256）。其静电荷为5，表明该肽在生理条件下带有正电荷，有利于与带负电的细菌膜相互作用。标准化疏水力矩为0.64，两亲性指数为0.95，表明该肽具有一定的疏水性和两亲性，能够与细菌膜的脂质双层相互作用。无序构造倾向为0.25，表明该肽在一定条件下存在较为稳定的二级结构。该肽具有典型的α-螺旋结构，螺旋数为5，形成三股螺旋倾向为0.88，这些结构特征有助于其与细菌膜的结合和插入，从而发挥抗菌作用。

图3中，可以发现本发明获得抗菌肽能实现对金黄色葡萄球菌的抑制，且抑菌圈的直径为7mm。

图4中，可以发现本发明获得的抗菌肽对金色葡萄球菌的mic为3.125μM，且其对金黄色葡萄球菌的抑制的效果显著优于现有技术中的Nisin。可见，本发明的抗菌肽在抑制金黄色葡萄球菌上具有显著的优势。

图5中，可以发现本发明的获得的抗菌肽能应用于抑制鸡肉中的金黄色葡萄球菌，且其在32小时内对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著。

图6中，可以发现本发明的获得的抗菌肽能应用于抑制牛奶中的金黄色葡萄球菌，且其在32小时内对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著。

综上所述，本发明获得的抗菌肽能实现对金黄色葡萄球菌的抑制，且优于现有技术的Nisin。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案。

Claims (9)

1.一种Rhodospirillales新型抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

2.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1的抗菌肽。

3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于编码权利要求1所述的抗菌肽。

4.含有权利要求3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物或重组微生物。

5.权利要求1所述的抗菌肽在非疾病治疗和/或非疾病诊断的抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

6.权利要求1所述的抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

7.权利要求2所述的抗菌组合物在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的应用。

8.权利要求1所述的抗菌肽在制备添加剂中的应用，其特征在于，所述添加剂为化妆品、饲料或食品添加剂中的任意一种。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽抑制金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为3.125μM。