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CN119894536A - Gpc3抗体药物偶联物及其应用 - Google Patents

Gpc3抗体药物偶联物及其应用 Download PDF

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CN119894536A
CN119894536A CN202380065401.2A CN202380065401A CN119894536A CN 119894536 A CN119894536 A CN 119894536A CN 202380065401 A CN202380065401 A CN 202380065401A CN 119894536 A CN119894536 A CN 119894536A
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刘文超
崔菲菲
刘守钾
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李鸿峰
戴振宇
方磊
李虎
胡朝红
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Lepu Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种抗体药物偶联物及其应用，所述抗体药物偶联物具有式I所示的结构，即Ab‑(L‑D)p，其中，Ab为抗GPC3抗体，L为接头，D为细胞毒素。本发明的抗体药物偶联物在体内和体外都具有良好的抑制肿瘤细胞生长活性，并具有较低的细胞毒性。

Description

GPC3抗体药物偶联物及其应用 技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体地，涉及GPC3抗体药物偶联物及其应用。
背景技术
肝癌是世界上第五大流行的癌症，也是癌症相关死亡的第三大常见原因。肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要形式，占所有肝癌的90％。目前公认的治疗方案是以手术切除为核心的多学科综合治疗，近期疗效虽有提高，但远期疗效仍不理想，因此探究治疗肝癌更加有效的新策略是目前国内外研究热点，开发新的肝癌治疗药物仍然迫在眉睫。
GPC3全称Glypican-3，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，并通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面。GPC3的蛋白质核心由两个亚基组成，其中N末端亚基的大小约为40kDa，C末端亚基约为30kDa。在哺乳动物中已经鉴定出六个Glypicans(GPC1-6)。GPC3在调节细胞增殖、分化、粘附和迁移方面起着重要作用。有研究认为GPC3与Wnt蛋白和卷曲蛋白受体(Frizzled)相互作用，形成复合物，并触发下游信号。GPC3的核心蛋白质可以用作Wnt的共受体或接收器。
在人体中，GPC3基因表达的GPC3蛋白在不同的发育时期和不同的组织中表达存在显著差异，如在成人正常组织中含量极少，在胃癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症中低表达或不表达，而在肝细胞癌(HCC)中常处于过度表达(70％～80％)。研究表明，GPC3是肝癌特异性相关抗原，可以在HCC早期协助确认病变的性质，可显著提高诊断的准确性。因此，GPC3被认为在肝癌免疫治疗中潜力巨大。
GPC3靶向的治疗近年来逐渐受到关注。目前，基于GPC3靶点的治疗策略主要集中在抗体药物、细胞治疗以及疫苗等方面。已经开发的治疗性抗GPC3抗体，包括GC33、YP7和HN3等抗体以及双特异性抗体(如在进行临床试验的ERY974和CM350)。这些抗体中的一些抑制了肝癌细胞中的Wnt信号传导。此外，在各个阶段开发了嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法用于治疗肝癌。在具有异种移植或原位肝肿瘤的小鼠中，CAR-T细胞可以通过诱导穿孔蛋白和颗粒酶介导的细胞死亡并减少肿瘤细胞中的WNT信号传导来消除GPC3阳性癌细胞。
发明内容
本申请的发明人通过大量实验和创造性劳动，制备得到了抗GPC3抗体药物偶联物(ADC)，并证实其具有良好的生物学活性，由此完成了本发明。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，所述抗体药物偶联物具有式Ⅰ所示的结构， Ab-(L-D)p 式Ⅰ
其中：
Ab为抗GPC3抗体，所述抗GPC3抗体包括重链和轻链，其中重链可变区CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的序列，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示的序列；
L为接头；
D为细胞毒素；
p为1-8之间的任意数值(如1、1.5、2、2.5、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、 5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，或者如1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5或7.5-8)。
式I中，L-D表示接头与细胞毒素通过共价键相连，形成L-D分子；Ab-(L-D)p表示p个L-D分子通过共价键偶联至Ab。
本发明中，药物抗体比(DAR)是指偶联到抗体的药物分子的个数(例如，式I中的p)。本文所述的抗体药物偶联物中包含的药物分子的个数可以是整数，也可以是小数。无论是整数还是小数，其指的均是每个抗体偶联的药物分子的平均数量。“p为1-8之间的任意数值”，其表示，p可以是选自1-8之间的任意整数(包括端点1和8)，也可以是选自1-8之间的任意小数，例如2.3、3.9、4.0、4.2。同时，本领域技术人员可以理解，即使采用相同的制备方法，不同的批次制备得到的抗体药物偶联物的DAR值也不一定完全相同，例如，可以在上下不超过0.5的范围内浮动。
药物抗体比(DAR)可以通过常规手段来验证，诸如质谱、ELISA测定法、HIC和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化和验证可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。
在一些实施方案中，所述接头选自：6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、马来酰亚氨基丙酰基(MP)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酰基(MCC)、N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA、
在一些实施方案中，所述接头选自：6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA、
其中，MC、MC-vc-PAB和MA-PEG4-VC-PAB-DMEA的结构式如下所示：
在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：SN-38、吉西他滨(Gemcitabine)、Monomethyl auristatin E(MMAE)、Monomethyl auristatin F(MMAF)、美登木素生物碱(例如Maytansine DM1、Maytansine DM4)、卡奇霉素(calicheamicin)、MGBA(如duocarmycin)、阿霉素(doxorubicin)、蓖麻毒素、白喉毒素、倍癌霉素SA(Duocarmycin SA)、I131、白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：Monomethyl auristatin E(MMAE)、倍癌霉素SA(Duocarmycin SA)、Monomethyl auristatin F(MMAF)、
其中，MMAE、MMAF和倍癌霉素SA的结构式如下所示：
在一些实施方案中，L-D选自以下：MC-vc-PAB-MMAE、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA-Duocarmycin SA、MC-MMAF、
其中，MC-vc-PAB-MMAE、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA-Duocarmycin SA和MC-MMAF的结构式如下所示：
上述四个L-D通过共价键偶联至Ab上时，偶联方式和偶联位点均相同，即均是通过L-D末端的丁二酰亚胺与抗体中的巯基偶联形成。例如MC-vc-PAB-MMAE通过共价键偶联至Ab上时，形成的ADC的结构式如下所示：
其中，上述形成的ADC中，抗体Ab通过-S-与L-D末端的丁二酰亚胺的碳原子相连接，该-S-并非另外外接的巯基，而是抗体Ab被还原进而被打开二硫键后的抗体自身所含有的巯基。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区的序 列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区的序列分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示，或者，所述抗GPC3抗体轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区的序列分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：8所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：8所示，所述抗GPC3抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：16所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：8所示，所述抗GPC3抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：18所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链恒定区选自人源性IgG、IgM、IgA、IgD、IgE恒定区或上述恒定区的突变体。
在一些实施方案中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的轻链恒定区为人源性lambda恒定区、kappa恒定区、或上述恒定区的突变体。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链恒定区的序列包含如SEQ ID NO：19所示的序列，或者包含与SEQ ID NO：19所示序列的同源性大于70％，优选大于75％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的重链恒定区的序列如SEQ ID NO：19所示。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的轻链恒定区的序列包含如SEQ ID NO：20所示的序列，或者包含与SEQ ID NO：20所示序列的同源性大于70％，优选大于75％、80％、85％、90％、95％、99％的序列。
在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体的轻链恒定区的序列如SEQ ID NO：20所示。
在一些实施方案中，p为2-8之间的任意数值。
在一些实施方案中，p为2-6之间的任意数值。
在一些实施方案中，p为2-5之间的任意数值(例如2.3、3.9、4.0、4.2)。
在本发明的第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于治疗肿瘤的化疗药物、免疫治疗药物和免疫抑制剂中的至少一种。
在一些实施方案中，所述化疗药物例如为阿霉素(Adriamycin)、环磷酰胺、紫杉烷类【如紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)】、卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)、他莫昔芬、芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)、5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂、顺铂、卡铂、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、泼尼松、长春新碱(Oncovin)、多柔比星、强的松等，或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫治疗药物例如为PD-1单抗(例如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗)、PD-L1单抗(例如Atezolizumab)、TIGIT单抗、4-1BB单抗、VEGFR2单抗(例如Ramucirumab、阿帕替尼)、HER2单抗(例如曲妥珠单抗、Trastuzumab biosimilar、Trastuzumab-dkst)等，或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫抑制剂选自：(1)糖皮质激素类，如可的松和强的 松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺。在一些具体的实施方案中，所述免疫抑制剂例如为甲基强的松龙、强的松、硫唑嘌呤、普乐可复、赛尼哌、舒莱、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸酯、咪唑立宾、环磷酰胺、芬戈莫德等。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种药用辅料。
在本发明的第三方面，本发明提供了前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与GPC3相关的疾病；优选地，所述与GPC3相关的疾病为与GPC3阳性相关的疾病。
在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病，包括但不限于肝癌，肺癌，胃癌，头颈癌，食管癌，默克尔细胞癌，或脂肪肉瘤。在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病为肝癌。
在本发明的第四方面，本发明提供了前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物，其用于预防和/或治疗与GPC3相关的疾病；优选地，所述与GPC3相关的疾病为与GPC3阳性相关的疾病。
在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病，包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、头颈癌、食管癌、默克尔细胞癌或脂肪肉瘤。在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病为肝癌。
在本发明的第五方面，本发明提供了治疗和/或预防与GPC3相关的疾病的方法，其包括：给予有需要的受试者治疗和/或预防有效量的前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物；优选地，所述与GPC3相关的疾病为与GPC3阳性相关的疾病。
在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病，包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、头颈癌、食管癌、默克尔细胞癌或脂肪肉瘤。在一些实施方案中，所述与GPC3阳性相关的疾病为肝癌。
有益效果
1、本发明的新抗体Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8是开发的抗GPC3单克隆抗体，其与各种强效细胞毒的小分子药物如MMAE(甲基澳瑞他汀E)、MMAF、Duo等通过接头可以偶联成GPC3-ADC。GPC3-ADC通过与肿瘤细胞表面GPC3受体的结合、内吞、释放小分子毒素，可以有效抑制肿瘤细胞增殖并导致肿瘤细胞死亡。
2、与已知抗体如Y035和GC33比较，本发明的新抗体Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8具有更强的细胞的结合亲和力及更好的内化效果。此外，偶联细胞毒素后的抗体与表达GPC3的HepG2细胞的亲和力没有改变。
3、本发明新开发的抗体Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8可与多种不同的linker-payload偶联，且在肝癌细胞中表现出较强的细胞杀伤作用，显著强于相同linker-payload的GC33-ADC。
4、本发明新开发的GPC3-ADC在人肝癌PDX肿瘤模型中表现出了显著的抑制肿瘤细胞生长的药效作用。
附图说明
图1表示各GPC3抗体对GPC3-CHO-K1细胞的亲和力；
图2表示各GPC3抗体对HepG2细胞的亲和力；
图3表示各GPC3抗体对Huh-7细胞的亲和力；
图4表示各GPC3抗体在HepG2细胞上的内化；
图5表示Hu 52H5D3B8-7-L1-D1疏水作用色谱图；
图6表示Hu 52H5D3B8-7-L3-D3疏水作用色谱图；
图7表示Hu 52H5D3B8-7-L4-D4疏水作用色谱图；
图8表示Hu 52H5D3B8-8-ZLA疏水作用色谱图；
图9表示GPC3抗体及ADC对HepG2细胞的亲和力；
图10表示Hu 52H5D3B8-8-L1-D1和GC33-L1-D1在Huh7细胞株中的细胞杀伤作用；
图11表示Hu 52H5D3B8-8-L1-D1和GC33-L1-D1在HepG2细胞株中的细胞杀伤作用；
图12表示Hu 52H5D3B8-8-L3-D3和GC33-L3-D3在Huh7细胞株中的细胞杀伤作用；
图13表示Hu 52H5D3B8-7-L4-D4和GC33-L4-D4在Huh7细胞株中的细胞杀伤作用；
图14表示Hu 52H5D3B8-8-ZLA和GC33-ZLA在Huh7细胞株中的细胞杀伤作用；
图15表示Hu 52H5D3B8-8-ZLA和GC33-ZLA在HepG2细胞株中的细胞杀伤作用；
图16表示GPC3-ADC对人肝癌裸小鼠PDX模型LIV#219肿瘤生长抑制活性；
图17表示GPC3-ADC对人肝癌裸小鼠PDX模型LIV#219的动物体重的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，除非另有说明，否则任何数值范围应理解为包括范围内的任何值或任何子范围。
在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体的轻链可分为κ和λ两类。重链可分为μ、δ、γ、α或ε五种，依据重链的不同可将抗体分为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五类。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统的组分C1q的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
在本发明中，用于确定序列同源性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的氨基酸序列同源性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。
在本发明中，所述与氨基酸序列具有至少70％的序列同源性的氨基酸序列包括与所述氨基酸序列基本同一的多肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多肽序列相比含有至少70％序列同源性、优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性的那些序列。
在本发明中，所述氨基酸序列的突变体指的是与所述氨基酸序列的同源性大于70％，例如大于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列，例如具有3个、2个或1个取代、缺失或添加氨基酸的序列。优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”(或“添加型”)变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。
在某些实施方案中，在偶联反应中少于理论最大值的药物模块偶联至抗体。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指，(i)本发明所提供的偶联物中存在的酸性官能团与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，并且包括但不限于，碱金属盐，如钠盐、钾盐、锂盐等；碱土金属盐，如钙盐、镁盐等；其他金属盐，如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；无机碱盐，如铵盐；有机碱盐，如叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐。以及，(ii)本发明所提供的偶联物中存在的碱性官能团与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，并且包括但不限于，氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对苯磺酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；氨基酸盐，如甘氨酸盐、三甲基甘氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等。
药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准程序获得，例如，通过将足量的碱性物质和提供药学上可以接受的阴离子的合适的酸反应，或者，通过将足量的酸性物质和提供药学上可以接受的阳离子的合适的碱反应。
在本发明中，溶剂合物表示这些形式的本发明的抗体药物偶联物：所述抗体药物偶联物通过与溶剂分子配位而形成的固态或液态形式的复合物。水合物是溶剂合物的一种具体 形式，其具有配位的水分子。在本发明中，水合物是优选的溶剂合物。
制备各种含有一定量的活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述，制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。
本发明中，所述药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。根据其来源可分为天然物、半合成物和全合成物。根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
本发明中，所述药物组合物可根据给药途径制成各种适宜的剂型。例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、散剂、酊剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、气雾剂、粉雾剂、喷雾剂等。其中，所述的药物组合物或适宜的剂型可以含有0.01mg至1000mg的本发明的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物。
本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
在本发明中，“受试者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
在本发明中，“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。
在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源 自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
实施例1人源化GPC3抗体的制备、序列及表征
一、人源化GPC3抗体的制备
为了获得靶向人GPC3的小鼠单克隆抗体，利用人GPC3蛋白免疫BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠并利用ELISA法(人GPC3蛋白)和FACS法(人GPC3过表达的CHO-K1细胞)进行血清中抗体效价的检测。经过多轮免疫后，选取效价较高的小鼠进行抗人GPC3杂交瘤细胞株建立，并通过ELISA法和FACS法进行阳性克隆的鉴定。随后进行亚克隆筛选鉴定，并获得单克隆52H5D3B8。通过抗体人源化设计，最终获得了新人源化抗体Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8。
二、人源化GPC3抗体的序列及表征
1、抗体序列
Hu 52H5D3B8-7：
VH：
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：
2)、CDR3(SEQ ID NO：3)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：4)、FR2(SEQ ID NO：5)、FR3(SEQ ID NO：6)、FR4(SEQ ID NO：7)。
VL：
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：9)、CDR2(SEQ ID NO：
10)、CDR3(SEQ ID NO：11)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：12)、FR2(SEQ ID NO：
13)、FR3(SEQ ID NO：14)、FR4(SEQ ID NO：15)。
Hu 52H5D3B8-8：
VH：
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：
2)、CDR3(SEQ ID NO：3)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：4)、FR2(SEQ ID NO：5)、FR3(SEQ ID NO：6)、FR4(SEQ ID NO：7)。
VL：
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：9)、CDR2(SEQ ID NO：10)、CDR3(SEQ ID NO：11)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：12)、FR2(SEQ ID NO：
13)、FR3(SEQ ID NO：17)、FR4(SEQ ID NO：15)。
Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8的重链恒定区均为：
Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8的轻链恒定区均为：
对照抗体：
(1)GC33抗体(Chugai Pharmaceutical)
GC33抗体的制备在US7919086B2中有描述。
GC33抗体的重链和轻链的CDR信息如下：
GC33抗体的重链和轻链的FR信息如下：
(2)Y035抗体(CARSGEN Therapeutics)
Y035抗体的制备在CN106397593B中有描述。人源化Y035抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列信息如下:
人源化Y035重链可变区(SEQ ID NO：42):
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：35)、CDR2(SEQ ID NO：36)、CDR3(SEQ ID NO：37)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：38)、FR2(SEQ ID NO：39)、FR3(SEQ ID NO：40)、FR4(SEQ ID NO：41)。
人源化Y035轻链可变区(SEQ ID NO：50):
其中下划线部分从左向右依次为CDR1(SEQ ID NO：43)、CDR2(SEQ ID NO：44)、CDR3(SEQ ID NO：45)；
未下划线部分从左向右依次为FR1(SEQ ID NO：46)、FR2(SEQ ID NO：47)、FR3(SEQ ID NO：48)、FR4(SEQ ID NO：49)。
GC33抗体和Y035抗体的重链恒定区均为：
GC33抗体和Y035抗体的轻链恒定区均为：
2、人源化GPC3抗体的细胞结合
发明人通过FACS评估了Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8与人GPC3过表达的CHO-K1细胞、HepG2细胞和HuH-7细胞的结合活性，并与已知抗GPC3抗体GC33和Y035进行比较。为了评估Hu 52H5D3B8-7与Hu 52H5D3B8-8这两个抗体的CDR区和Hu 52H5D3B8-7抗体的FR区，发明人制备了两个重组抗体。“Hu 52H5D3B8-7/8CDRs with Y035FRs”是指该抗体由Hu 52H5D3B8-7或Hu 52H5D3B8-8抗体的CDR区与Y035抗体的FR区重组。“Y035CDRs with Hu 52H5D3B8-7FRs”抗体是指该抗体由Y035抗体的CDR区与Hu 52H5D3B8-7抗体的FR区重组。
首先将GPC3-CHO-K1细胞、HepG2细胞和Huh-7细胞与Fc阻断剂在4℃孵育15分钟。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞，将5倍连续稀释的Hu 52H5D3B8-7、Hu 52H5D3B8-8、Hu 52H5D3B8-7/8CDRs with Y035FRs、Y035CDRs with Hu 52H5D3B8-7FRs或Y035mAb(起始浓度100nM)加入每个孔中，在4℃孵育60分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞并在室温下用2％PFA固定15分钟。用FACS缓冲液清洗后，将Alexa647AffiniPure山羊抗人IgG添加到每个孔中，并在室温下孵育30分钟。样品用FACS缓冲液洗涤两次。用流式细胞仪MACSQuant Analyzer 16对细胞样 品进行荧光信号分析，用MFI(GeoMean fluorescence intensity)表示。实验结果如图1-图3所示，Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8与GPC3-CHO-K1细胞、HepG2细胞和Huh-7细胞的结合亲和力相当，高于其他抗体。此外，无论是抗体“Hu 52H5D3B8-7/8 CDRs with Y035FRs”还是抗体“Y035CDRs with Hu 52H5D3B8-7FR”都表现出比Y035更高的细胞亲和力，这意味着Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8抗体的CDR区或Hu 52H5D3B8-7抗体的FR区都优于Y035抗体。各测试抗体在GPC3-CHO-K1细胞、HepG2细胞和Huh-7细胞上的EC50值如下表1所示。
表1：各GPC3抗体对GPC3-CHO-K1细胞、HepG2细胞和Huh-7细胞的亲和力(EC50)
3、人源化GPC3抗体的细胞内化
评估Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8在HepG2细胞上的内化，并与已知的GPC3抗体Y035(CARSGEN Therapeutics)进行内化比较。除此以外，为了评估Hu52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8抗体的CDR和FR，发明人在体外内化实验中还评估了抗体“Hu 52H5D3B8-7/8CDRs with Y035FRs”和抗体“Y035CDRs with Hu 52H5D3B8-7FRs”。
pHAb硫醇染料是pH传感器染料，在pH>7时具有非常低的荧光，当将其内化到内体或溶酶体时(pH分别为6.3或4.7)，荧光会显着增加。简而言之，将pHAb硫醇染料标记的α-hIgG二抗(10μg/mL)与抗体(20μg/mL)孵育30分钟。孵育后，将混合抗体连续稀释2倍，并将稀释的混合物加入每个孔中用2×104HepG2细胞预先种植的96孔测定板中。经48小时培养后，在多模式读取器上捕获荧光信号(2105)。实验结果如图4所示，Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8均显示出比其他抗体更高的内化效果。此外，抗体“Hu 52H5D3B8-7/8CDRs with Y035FRs”显示出比Y035更高的内化效果(更高的Top值与相当的EC50)，这意味着Hu 52H5D3B8-7和Hu 52H5D3B8-8的CDRs优于Y035。各测试抗体的EC50和Top值如下表2所示。
表2：各GPC3抗体在HepG2细胞上的内吞(EC50、Top)
实施例2 GPC3-ADC的制备
1、抗体药物偶联物Anti-GPC3-L1-D1的制备
a：取10毫克的GPC3抗体(Hu 52H5D3B8-7、Hu 52H5D3B8-8或GC33)，用0.7M Tris-0.5M EDTA溶液调节抗体pH至7.5；并称重，检测蛋白浓度，计算蛋白总量。向抗体中加入2.8倍摩尔数的TCEP，置于3D摇床上，温度22℃下，反应105min，连续混匀。
b：向还原后的抗体中加入1.6倍于自由巯基摩尔数的L1-D1即MC-vc-PAB-MMAE(上海美雅珂生物技术有限责任公司委托湖北华世通生物医药科技有限公司生产，溶于DMSO)，混匀后置于3D摇床，温度22℃下反应20min，连续混匀。向反应体系中加入3倍于所投入之L1-D1(即MC-vc-PAB-MMAE)摩尔数的N-乙酰半胱氨酸于反应液中，混匀，置于3D摇床，温度22℃下反应5min，连续混匀。使用15mL的30KD超滤装置置换到偶联物储存液(10mM组氨酸(Histidine),3％蔗糖(Sucrose),0.03％Tween-80,pH5.6)中，共5次置换，然后用0.22μm滤膜过滤，即得到抗体药物偶联物产物Anti-GPC3-L1-D1(Hu 52H5D3B8-7-L1-D1、Hu 52H5D3B8-8-L1-D1和GC33-L1-D1的统称)，并于4℃保存。
2、抗体药物偶联物Anti-GPC3-L3-D3的制备
a：取2毫克的GPC3抗体(Hu 52H5D3B8-7、Hu 52H5D3B8-8或GC33)，用0.7M Tris-0.5M EDTA溶液调节抗体pH至7.5；并称重，检测蛋白浓度，计算蛋白总量。向抗体中加入1.3倍摩尔数的TCEP，置于3D摇床上，温度22℃下，反应105min，连续混匀。
b：向还原后的抗体中加入2倍于自由巯基摩尔数的L3-D3即MA-PEG4-VC-PAB-DMEA-Duocarmycin SA(购买自联宁(苏州)生物制药有限公司，溶于DMSO)，混匀后置于3D摇床，温度22℃下反应20min，连续混匀。向反应体系中加入3倍于所投入之L3-D3(即MA-PEG4-VC-PAB-DMEA-Duocarmycin SA)摩尔数的N-乙酰半胱氨酸于反应液中，混匀，置于3D摇床，温度22℃下反应5min，连续混匀。使用0.5mL的30KD超滤装置置换到偶联物储存液(10mM组氨酸(Histidine),3％蔗糖(Sucrose),0.03％Tween-80,pH5.6)中，共5次置换，然后用0.22μm滤膜过滤，即得到抗体药物偶联物产物Anti-GPC3-L3-D3(Hu 52H5D3B8-7-L3-D3、Hu 52H5D3B8-8-L3-D3和GC33-L3-D3的统称)，并于4℃保存。
3、抗体药物偶联物Anti-GPC3-L4-D4的制备
a：取10毫克的GPC3抗体(Hu 52H5D3B8-7、Hu 52H5D3B8-8或GC33)，用0.7M Tris-0.5M EDTA溶液调节抗体pH至7.5；并称重，检测蛋白浓度，计算蛋白总量。向抗体中加入2.7倍摩尔数的TCEP，置于3D摇床上，温度22℃下，反应105min，连续混匀。
b：向还原后的抗体中加入2.0倍于自由巯基摩尔数的L4-D4即MC-MMAF(购买自博瑞医药生物(苏州)股份有限公司，溶于DMSO)，混匀后置于3D摇床，温度22℃下反应20min，连续混匀。向反应体系中加入3倍于所投入之L4-D4(即MC-MMAF)摩尔数的N-乙酰半胱氨酸于反应液中，混匀，置于3D摇床，温度22℃下反应5min，连续混匀。使用15mL的30KD超滤管置换到偶联物储存液(10mM组氨酸(Histidine),3％蔗糖(Sucrose),0.03％Tween-80,pH5.6)中，共5次置换，然后用0.22μm滤膜过滤，即得到抗体药物偶联物产物Anti-GPC3-L4-D4(Hu 52H5D3B8-7-L4-D4、Hu 52H5D3B8-8-L4-D4和GC33-L4-D4的统称)，并于4℃保存。
4、抗体药物偶联物Anti-GPC3-ZLA的制备
a：取10毫克的GPC3抗体(Hu 52H5D3B8-7、Hu 52H5D3B8-8或GC33)，将抗体换液至40mM PB+2mM EDTA(pH7.0)中。用40mM PB+2mM EDTA(pH6.99)溶液稀释抗体浓度至5mg/mL，称重，并检测蛋白浓度，计算蛋白总量。向抗体中加入 2.25倍摩尔数的TCEP，混匀样品，置于恒温箱中，温度22℃下反应3h，连续混匀，混匀仪速度200rpm。
b：将还原后的抗体溶液置于冰上冷却，向冷却后的抗体中加入7倍于抗体摩尔数的ZLA(溶于DMA，DMA总含量为反应体系的10％；ZLA即CN107001415B公开的实施例2.1所示的化合物，结构式如下所示)，快速混匀，混匀后置于恒温箱中，温度4℃下反应2h，连续混匀，混匀仪速度200rpm。向反应体系中加入6倍于所投入之抗体摩尔数的N-乙酰半胱氨酸于反应液中，混匀，置于恒温箱中，温度22℃下反应15min，连续混匀，混匀仪速度200rpm。使用15mL的50KD超滤管置换到偶联物储存液(20mM组氨酸(Histidine)/组氨酸盐酸(Histidine-HCl),pH5.41)中，然后用0.22μm滤膜除菌过滤，检测蛋白浓度。即得到抗体药物偶联物产物Anti-GPC3-ZLA(Hu 52H5D3B8-7-ZLA、Hu 52H5D3B8-8-ZLA和GC33-ZLA的统称)，并于4℃保存。
上述GPC3-ADC的载药量(DAR)是用疏水作用色谱法(HIC-HPLC)检测而得的，典型图谱见图5-8。根据图谱峰面积计算得到Hu 52H5D3B8-7-L1-D1、Hu 52H5D3B8-7-L3-D3、Hu 52H5D3B8-7-L4-D4、Hu 52H5D3B8-8-ZLA的平均载药数DAR分别为4.2、2.3、4.0和3.9。
实施例3GPC3-ADC药理药效学研究
1、GPC3-ADC的细胞结合
通过FACS实验确认ADC的结合基本不受Cys偶联的影响，同时比较Hu 52H5D3B8-8ADC与GC33ADC的细胞结合。
经胰酶-EDTA消化后，收集培养的HepG2细胞。离心后，将细胞重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS)，调整细胞密度，并将细胞分至96孔U底细胞培养板中，使每孔内含200,000～500,000个细胞。加入用FACS缓冲液4倍梯度稀释的抗体或ADC并混匀，使各样品最终起始终浓度为10μg/mL。将96孔板置于4℃孵育60min。用FACS缓冲液对孔内细胞进行充分清洗，除去未结合的抗体和ADC。加入用FACS缓冲液1:1,000稀释的Goat anti-Human IgG(H+L)Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen)，于4℃避光孵育30min。用FACS缓冲液对孔内细胞进行清洗，除去未结合的二抗。用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)对细胞样品进行荧光信号分析。实验结果如图9所示，抗体Hu 52H5D3B8-8和GC33偶联细胞毒素前后对HepG2细胞的亲和力没有改变，并且Hu 52H5D3B8-8抗体及Hu 52H5D3B8-8ADC对HepG2细胞的亲和力强于GC33抗体和GC33ADC。各测试物对HepG2细胞的亲和力如表3所示。
表3：各GPC3抗体及ADC对HepG2细胞的结合(EC50)
2、GPC3-ADC中抗体的内化
确认ADC的内化不弱于单抗的内化，同时对Hu 52H5D3B8-7ADC、Hu 52H5D3B8-8ADC与GC33ADC的内化进行比较。
将96孔U底细胞培养板用溶于PBS的5％脱脂奶粉封闭60min。经非胰酶消化液(Sigma-Aldrich)处理后，收集培养的Huh7肝癌细胞。离心后，将细胞重悬于预冷的DMEM培养基中，调整细胞密度，并将细胞分至封闭的96孔U底细胞培养板中，使每孔内含500,000～800,000个细胞。加入用含5％FBS的DMEM培养基稀释的抗体和ADC并混匀，使样品终浓度为10μg/mL。将96孔板置于冰上孵育60min。用预冷的FACS缓冲液(PBS+2％FBS)对孔内细胞进行充分清洗，除去未结合的抗体和ADC。将孔内细胞均分至两块封闭的96孔U底板中，离心后，用DMEM培养基重悬细胞。一块96孔板置于冰上，另一块则置于37℃的细胞培养箱中。2h后，将37℃的培养板转移至冰上，再放置5～10min。加入稀释的Goat anti-Human IgG(H+L)Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen)，于冰上避光孵育30min。用预冷的FACS缓冲液对孔内细胞进行清洗，除去未结合的二抗。用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)对细胞样品进行荧光信号分析，用MFI(GeoMean fluorescence intensity)表示。除37℃孵育外，整个实验过程均保持在冰上或4℃。
细胞表面分子减少百分比的计算方法如下： 细胞表面分子减少％＝(MFI冰上-MFI37℃)/MFI冰上*100％。
实验结果如表4所示，抗体Hu 52H5D3B8-8和GC33偶联细胞毒素前后在Huh7细胞上的内化能力没有改变，并且Hu 52H5D3B8-8抗体及Hu 52H5D3B8-8ADC的内化能力强于GC33抗体和GC33ADC。各测试物在Huh7细胞上的内吞结果如表4所示。
表4：各GPC3抗体及ADC在Huh7细胞上的内吞
实施例4体外药效学研究
对偶联多种linker-payload(即L-D)的Hu 52H5D3B8-7或Hu 52H5D3B8-8 ADC与GC33 ADC的细胞毒性进行比较。
经胰酶-EDTA消化后，收集培养的肝癌细胞。离心后，将细胞重悬于新的培养基 中，并对细胞进行计数。将细胞接种于96孔底透黑色细胞培养板(Costar)中，并于细胞培养箱内培养过夜。第二天，用培养基对抗体和ADC进行4倍梯度稀释，小心转移稀释液至黑色培养板中，使各样品最终起始终浓度为10μg/mL。细胞培养箱内培养96h，然后加入1/10孔内体积的PrestoBlue试剂(Invitrogen)，细胞培养箱内孵育1h。用SpectraMax M5读板仪对荧光信号进行读取，将仪器的激发和发射波长分别设为560nm和590nm。所得荧光信号数据用SoftMax Pro 6.5软件进行分析。
1、实验试剂及来源：
受试药物
细胞株
2、实验结果：
各GPC3-ADC细胞毒性的EC50的平均值见表5。图10-15为不同GPC3-ADC对Huh7/HepG2细胞杀伤的代表性图。
表5：不同GPC3-ADC在所筛选的细胞株中细胞毒性的EC50值
注：“-”表示未检测
从表5和图10-15的结果可以看出，本发明的不同GPC3-ADC在GPC3中、高度表 达的细胞株中均表现出显著的细胞杀伤活性，并强于GC33-ADC。
实施例5体内药效学研究
GPC3-ADC的抗肿瘤活性在LIV#219肝癌PDX模型中进行了测试。该模型有较高的GPC3RNA表达水平，并经FACS分析证实GPC3阳性表达。
人肝癌裸小鼠PDX模型的建立过程为：将体积大小约为15-30mm3的肿瘤组织移植于BALB/c裸小鼠背部皮下。当肿瘤体积达到250-360mm3时，用随机区组法分组，每组6只小鼠，保证各组间肿瘤体积均一并兼顾体重，共4组，包括溶媒组、3mg/kg GC33-L1-D1给药组、3mg/kg Hu 52H5D3B8-7-L1-D1给药组和3mg/kg Hu 52H5D3B8-8-L1-D1给药组。
数据分析：实验期间，每周测定两次肿瘤体积。肿瘤体积(Tumor Volume，TV)的计算公式为：TV＝l×w2/2。其中l、w分别代表肿瘤测量长和宽。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，RTV＝Vf/V0。其中V0为分组给药时(即Day0)测量所得肿瘤体积，Vf为最后一天测量的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(给药组RTV/Vehicle组RTV)×100％。肿瘤生长抑制率TGI％＝(Vehicle组平均肿瘤体积-给药组平均肿瘤体积)/Vehicle组平均肿瘤体积×100％。当T/C(％)≤40％，且P<0.05时认为供试品对肿瘤生长有显著抑制作用。
实验结果如图16-17所示。GC33-L1-D1按3mg/kg剂量给药后，Day 26的相对肿瘤增殖率T/C(％)为54.90％，肿瘤生长抑制率TGI％为45.10％；Hu 52H5D3B8-7-L1-D1(3mg/kg)组T/C(％)为33.58％，TGI％为66.42％；Hu 52H5D3B8-8-L1-D1(3mg/kg)组T/C(％)为39.93％，TGI％为60.07％。
实验结果表明，Hu 52H5D3B8-7-L1-D1(3mg/kg)和Hu 52H5D3B8-8-L1-D1(3mg/kg)均具有显著抑制肿瘤生长的活性，且优于GC33-L1-D1(3mg/kg)。荷瘤小鼠对Hu52H5D3B8-7-L1-D1和Hu 52H5D3B8-8-L1-D1均有很好的耐受性。

Claims (11)

  1. 抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，所述抗体药物偶联物具有式Ⅰ所示的结构， Ab-(L-D)p 式Ⅰ
    其中：
    Ab为抗GPC3抗体，所述抗GPC3抗体包括重链和轻链，其中重链可变区CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的序列，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示的序列；
    L为接头；
    D为细胞毒素；
    p为1-8之间的任意数值。
  2. 权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述接头选自：
    6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、马来酰亚氨基丙酰基(MP)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酰基(MCC)、N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA、
    优选地，所述接头选自：
    6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA、
  3. 权利要求1-2任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述细胞毒素选自：
    SN-38、吉西他滨(Gemcitabine)、Monomethyl auristatin E(MMAE)、Monomethyl auristatin F(MMAF)、美登木素生物碱(例如Maytansine DM1、Maytansine DM4)、卡奇霉素(calicheamicin)、MGBA(如duocarmycin)、阿霉素(doxorubicin)、蓖麻毒素、白喉毒素、倍癌霉素SA(Duocarmycin SA)、I131、白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒；
    优选地，所述细胞毒素选自：
    Monomethyl auristatin E(MMAE)、倍癌霉素SA(Duocarmycin SA)、Monomethyl auristatin F(MMAF)、
  4. 权利要求1-3任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，L-D选自以下：
    MC-vc-PAB-MMAE、MA-PEG4-VC-PAB-DMEA-Duocarmycin SA、MC-MMAF、
  5. 权利要求1-4任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗GPC3抗体具有以下特征1)～2)中的一种或多种：
    1)所述抗GPC3抗体的重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区分别包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示的序列；
    2)所述抗GPC3抗体轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区分别包含如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的序列，或者所述抗GPC3抗体轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4区分别包含如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15所示的序列。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗GPC3抗体具有以下特征1)～2)中的一种或多种：
    1)所述抗GPC3抗体的重链可变区的序列包含如SEQ ID NO：8所示的序列；
    2)所述抗GPC3抗体的轻链可变区的序列包含如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的序列。
  7. 权利要求1-6任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗GPC3抗体具有以下特征1)～2)中的一种或多种：
    1)所述抗GPC3抗体的重链恒定区选自人源性IgG、IgM、IgA、IgD、IgE恒定区或上述恒定区的突变体；
    优选地，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；
    2)所述抗GPC3抗体的轻链恒定区为人源性lambda恒定区、kappa恒定区、或上述恒定区的突变体。
  8. 权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗GPC3抗体具有以下特征1)～2)中的一种或多种：
    1)所述抗GPC3抗体的重链恒定区的序列包含如SEQ ID NO：19所示的序列，或者包含与SEQ ID NO：19所示序列的同源性大于70％，优选大于75％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
    优选地，所述抗GPC3抗体的重链恒定区的序列如SEQ ID NO：19所示；
    2)所述抗GPC3抗体的轻链恒定区的序列包含如SEQ ID NO：20所示的序列，或者包含与SEQ ID NO：20所示序列的同源性大于70％，优选大于75％、80％、85％、90％、95％、99％的序列；
    优选地，所述抗GPC3抗体的轻链恒定区的序列如SEQ ID NO：20所示。
  9. 权利要求1-8任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，p为2-8之间的任意数值；
    优选地，p为2-6之间的任意数值；
    更优选地，p为2-5之间的任意数值(例如2.3、3.9、4.0、4.2)。
  10. 药物组合物，其包含权利要求1-9任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物；
    任选地，还包含用于治疗肿瘤的化疗药物、免疫治疗药物和免疫抑制剂中的至少一种；
    或者任选地，还包含至少一种药用辅料。
  11. 权利要求1-9任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与GPC3阳性相关的疾病；
    优选地，所述与GPC3阳性相关的疾病包括肝癌、肺癌、胃癌、头颈癌、食管癌、默克尔细胞癌或脂肪肉瘤。
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