CN119874879B - 瓜氨酸化saa多肽及在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了瓜氨酸化SAA多肽及在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用，瓜氨酸化SAA多肽氨基酸序列：DKYFHA‑Cit‑GNYDAAK‑Cit‑GPGGA，通过该多肽，本发明鉴定了SAA的瓜氨酸化自身抗原B细胞表位及相应的自身抗体，即抗瓜氨酸化SAA多肽抗体（anti‑CAP）。anti‑CAP在RA患者中的表达水平显著高于其他疾病对照组和健康组，在早期RA、ESR/CRP正常RA、抗CCP抗体/RF阴性RA都具有较好的阳性率，为RA的诊断提供新的策略。

Description

瓜氨酸化SAA多肽及在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用

技术领域

本发明涉及类风湿关节炎诊断技术领域，具体涉及瓜氨酸化SAA多肽及在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的慢性系统性自身免疫疾病，以免疫细胞过度活化、进行性滑膜炎症以及关节软骨/骨侵蚀性病变为主要特征。全世界范围内RA的患病率约为1%（SMOLEN J S, ALETAHA D, MCINNES I B. Rheumatoidarthritis [J]. Lancet, 2016, 388(10055): 2023-38），我国患病率约为0.24%~0.4%（LIR, SΜN J, REN L M, et al. Epidemiology of eight common rheumatic diseases inChina: a large-scale cross-sectional survey in Beijing [J]. Rheumatology(Oxford), 2012, 51(4): 721-9）。RA主要表现为全身多处小关节局部滑膜的炎症反应，病情可逐渐进展并最终导致关节畸形，严重影响患者的生活质量。早期诊断和有效的治疗是防止RA患者长期损害和致残的关键。

除了基于患者临床表现与影像学改变外，RA的诊断很大程度上依赖于血清标志物的检测。抗环瓜氨酸多肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体和类风湿因子(rheumatoid factor，RF)是目前诊断 RA 的经典血清学标志物，已被纳入由美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EMLAR)在2010年制定的用于RA诊断的分类标准。其中，抗CCP抗体具有较高的特异性，但敏感性有限（分别为95%和67%），仍有约30%患者血清中抗CCP抗体为阴性（NISHIMΜRA K, SΜGIYAMA D, KOGATA Y, et al. Meta-analysis:diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody andrheumatoid factor for rheumatoid arthritis [J]. Ann Intern Med, 2007, 146(11): 797-808）。因此，识别RA的潜在诊断生物标志物的需求尚未得到满足，尤其是抗CCP抗体阴性的RA患者仍缺乏特异性的生物标志物，限制了临床上对此类患者的早期诊断与治疗。

本课题组前期研究通过非标记蛋白组学技术对类风湿关节炎进行了血清抗原组学研究。基于差异表达蛋白的分子特征，采用随机森林模型算法对类风湿关节炎、抗环瓜氨酸肽抗体（ACPA）阳性类风湿关节炎和 ACPA 阴性类风湿关节炎进行分类。在这些蛋白质中，血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A，SAA）可能是CCP阴性类风湿关节炎诊断的特异性自身抗原之一。

SAA是一种急性期反应蛋白，属于载脂蛋白家族。在正常生理状态下，其在血浆中的含量较低。在炎症刺激，如细菌、病毒感染等情况下，肝脏细胞会大量合成和分泌SAA。SAA作为炎症标志物，在感染性疾病中，其水平可在感染后数小时内迅速升高，比C-反应蛋白（CRP）等传统炎症指标更为灵敏，可用于早期感染的诊断、病情监测和疗效评估；在心血管疾病中，其水平升高与心血管疾病的发生风险相关；还可辅助自身免疫性疾病如类风湿关节炎等的病情监测和活动度评估。研究表明，SAA在RA患者的血清、关节液及滑膜组织中表达水平升高，且SAA浓度与RA疾病活动度密切相关。SAA水平是判断RA病情活跃程度和临床治疗反应的有效指标，对RA的诊断及预后有一定临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的检测抗原瓜氨酸化SAA多肽，可通过该检测抗原，检测RA患者体内对应的表位抗体即抗瓜氨酸化SAA多肽抗体（anti-CAP）浓度，进而可用于诊断RA。

本发明技术方案详述如下：

第一方面，本发明提供了一种瓜氨酸化SAA多肽，氨基酸序列如下所示：

DKYFHA-Cit-GNYDAAK-Cit-GPGGA（SEQ ID NO:1）。

可选或优选的，上述瓜氨酸化SAA多肽，氨基酸序列N端还通过半胱氨酸残基偶联有载体蛋白BSA，增加免疫原性，偶联后的氨基酸序列如下：

BSA-C-DKYFHA-Cit-GNYDAAK-Cit-GPGGA（SEQ ID NO:2）。

第二方面，本发明提供了上述瓜氨酸化SAA多肽在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用，所述产品用于检测患者生物样本中抗瓜氨酸化SAA多肽抗体含量。

相对于正常健康人、干燥综合征患者、系统性红斑狼疮患者、骨关节炎患者和银屑病关节炎患者，类风湿关节炎患者的生物样本中抗瓜氨酸化SAA多肽抗体含量显著上升。

所述类风湿关节炎患者包括病程在12个月以内的早期类风湿关节炎患者、ESR和/或CRP正常的类风湿关节炎患者、血清抗CCP抗体阴性和/或血清RF阴性的类风湿关节炎患者。

所述生物样本为血清。

所述诊断产品为ELISA检测试剂盒。

第三方面，本发明提供了一种类风湿关节炎诊断试剂盒，包括：上述瓜氨酸化SAA多肽、酶标板、ELISA包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色底物和终止液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本研究提供了一种瓜氨酸化SAA多肽，并通过该多肽鉴定了SAA的瓜氨酸化自身抗原B细胞表位，揭示了相应的自身抗体，即抗瓜氨酸化SAA多肽抗体（anti-CAP，anti-citrullinated SAA peptide antibody）对RA的诊断价值。anti-CAP在RA患者中的表达水平显著高于其他疾病对照组和健康组，在早期RA、ESR/CRP正常RA、抗CCP抗体/RF阴性RA都具有较好的阳性率，为RA的诊断提供新的策略。

附图说明

图1为实施例2小样本研究中，用瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测不同组别人群血清中anti-CAP表达水平的统计结果。RA：类风湿关节炎；SS：干燥综合征；OA：骨关节炎；SLE：系统性红斑狼疮； HC：健康对照；anti-CAP：抗瓜氨酸化SAA多肽抗体。

图2为实施例2大样本研究中，用瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测不同组别人群血清中anti-CAP表达水平的统计结果（A）和大样本ROC曲线及曲线下面积（AUC）分析结果（B）。RA：类风湿关节炎；SS：干燥综合征；OA：骨关节炎；SLE：系统性红斑狼疮；PsA：银屑病关节炎；HC：健康对照；anti-CAP：抗瓜氨酸化SAA多肽抗体。

图3为实施例3用瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测不同病程的早期RA患者血清中anti-CAP表达水平的统计结果，ERA：早期类风湿关节炎；HC：健康对照；anti-CAP：抗瓜氨酸化SAA多肽抗体；n：anti-CAP抗体阳性患者的数量；N：RA患者总数。

图4为ESR/CRP不同表征的RA患者生物样本中anti-CAP表达水平的统计结果，HC：健康对照；anti-CAP：抗瓜氨酸化SAA多肽抗体；n：anti-CAP抗体阳性患者的数量；N：RA患者总数。

图5为抗CCP抗体/RF阴性RA患者生物样本中anti-CAP表达水平的统计结果，anti-CCP- RA：抗CCP抗体阴性RA患者；RF- RA：RF阴性RA患者；anti-CCP- and RF- RA：抗CCP抗体和RF双阴性的血清阴性RA患者；anti-CAP：抗瓜氨酸化SAA多肽抗体；n：anti-CAP抗体阳性患者的数量；N：RA患者总数。

上述各图中，统计结果均采用Kruskal-Wallis H检验分析多组之间的差异，采用Dunnet t检验进行多重比较。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合实施例及附图，对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例中所用仪器、试剂，如无特殊说明均来源于商业渠道。

实施例1 瓜氨酸化SAA多肽合成及在ELISA检测技术中的应用

以SAA的51-70位点合成SAA多肽，并进行瓜氨酸化，N端偶联载体蛋白BSA以增加免疫原性；合成时在N端添加一个半胱氨酸残基以利于偶联。

偶联了BSA的瓜氨酸化SAA多肽的氨基酸序列为：

BSA-C-DKYFHA-Cit-GNYDAAK-Cit-GPGGA。

ELISA诊断试剂盒，包括：瓜氨酸化SAA多肽、酶标板（微孔板）、ELISA包被液、洗涤液、封闭液（3% BSA+PBST）、样品稀释液、酶标二抗、显色底物（TMB底物溶液）和终止液（硫酸）。试剂盒中各成分均为体积百分含量，酶标二抗溶剂为甘油，其余试剂溶剂为水。

ELISA检测技术：

（1）用ELISA包被液稀释的偶联有BSA的瓜氨酸化SAA多肽至10 μg/ml，加至微孔板中，每孔100μl，封板膜封板，放于4℃冰箱过夜；

（2）吸出微孔板内组分，用300L洗涤液冲洗，冲洗3次；

（3）吸取200 μl的3% BSA+PBST加到每个微孔中，在室温下温育2小时；

（4）标准品、稀释后的病人样本加入到微孔中，每孔100μl，在室温下温育1小时；

（5）吸出微孔板内组分，用300L洗涤液冲洗，冲洗3次；

（6）吸取 100μL酶结合物（即酶标二抗）加到每个微孔中，在室温下温育30分钟；

（7）吸出微孔板内组分，用300L洗涤液冲洗，冲洗3次；

（8）吸取 100μL TMB 底物溶液加到每个微孔中，在室温下温育10分钟；

（9）在每个微孔中加入100μL终止液，在室温下温育5分钟；

（10）使用酶标仪读取 450 nm 处的光密度值并计算结果。如果采用双波长测定，参考波长为570nm。产生的颜色在至少30分钟内保持稳定，在此时间内读取光密度值。

实施例2 Anti-CAP在RA中的诊断价值

小样本研究：我们以偶联BSA的瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，通过ELISA检测技术检测了对应的抗体表位即anti-CAP在RA（83例）、疾病对照干燥综合征（24例）、骨关节炎（24例）、系统性红斑狼疮（24例）及健康对照（21例）血清样本中的表达水平。检测结果如图1所示，结果表明，与HC和疾病对照组相比，RA血清中anti-CAP水平明显升高。

上述小样本研究结果已经表明不同人群血清中均存在与瓜氨酸化SAA多肽相对应的表位抗体anti-CAP，并且RA患者血清中该表位抗体表达水平特异性升高，这提示血清中anti-CAP可能作为一个潜在的RA诊断标志物。

为了进一步研究anti-CAP在RA中的临床诊断价值，我们在一个大样本队列研究中进行了验证。该检测队列共包含了RA 123例、干燥综合征 48例、骨关节炎 48例、系统性红斑狼疮48例、银屑病关节炎32例和健康对照68例。检测结果如图2所示，其中A为不同人群中anti-CAP的表达水平统计结果，显示相较于其他疾病对照和健康对照，RA患者中anti-CAP水平明显升高，B为检测队列ROC曲线及曲线下面积（AUC）。ROC 曲线展示模型在不同阈值下的分类性能。曲线越靠近左上角，说明模型的性能越好，即真阳性率越高，同时假阳性率越低。AUC 是指 ROC 曲线与坐标轴围成的面积，取值范围在 0 到 1 之间。AUC 值越大，代表模型的性能越好。

为了进一步评估anti-CAP在RA诊断中的效能，我们将健康对照组anti-CAP AU值的均值加2倍标准差设定为cut-off值（AU值 = 76.24），计算了anti-CAP在队列中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果如表1所示。

表1 anti-CAP抗体在队列中的敏感性和特异性

结果显示，血清中anti-CAP在RA患者中的诊断敏感性为59.10%，特异性为94.10%，阳性预测值为83.69%，阴性预测值为81.81%。

实施例3 Anti-CAP在早期RA中的诊断价值

通过ELISA的方法，利用实施例1的瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测早期RA（ERA）患者血清中anti-CAP水平。其中，病程≤12个月RA患者85例，病程≤6个月RA患者43例，同时设置健康对照68例。检测结果参见图3，显示anti-CAP在早期RA患者血清中就有升高，且随着病程延长，anti-CAP抗体的阳性率呈逐渐升高的趋势。

在病程≥12个月，病程≤12个月和病程≤6个月的阳性率分别为57.89%、52.94%和51.16%。

实施例4 anti-CAP在ESR/CRP正常RA中的补充诊断价值

在ACR/EULAR 2010分类标准中，红细胞沉降率（ESR）和c反应蛋白（CRP）被常规用于RA疾病活动性的诊断和评估。我们进一步将RA患者血清中anti-CAP水平与ACR/EULAR2010分类标准中列出的两个指标ESR和CRP进行比较。通过ELISA的方法，用实施例1的瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测ESR/CRP正常RA患者中anti-CAP水平。ESR和CRP均升高RA患者52例，CRP升高、ESR正常或ESR升高、CRP正常的患者36例， ESR和CRP均正常的RA患者36例。

ESR和CRP升高的RA患者中的anti-CAP抗体阳性率为53.85%，CRP升高、ESR正常或ESR升高、CRP正常的RA患者中的anti-CAP抗体阳性率为55.56%，即使在ESR和CRP正常的RA患者中的anti-CAP抗体阳性率也可达55.56%，参见下图4和表2。

表2 不同类型RA患者血清中anti-CAP阳性率

我们评估了ESR/CRP升高和ESR/CRP正常的RA患者的anti-cap水平和阳性率。如图4所示，ESR/CRP升高的RA患者anti-cap阳性率较高。即使在ESR正常或CRP正常的RA患者中，其阳性率无明显差异，显著高于健康人。进一步表明其作为RA潜在的生物标志物和补充疾病活动性指标，具有一定的RA补充诊断价值。

实施例5 Anti-CAP在自身抗体正常RA中的补充诊断价值

目前RA的诊断标志物主要有抗CCP抗体和RF，但仍有部分患者的抗CCP抗体和RF呈阴性，因此我们进一步分析了anti-CAP抗体在抗CCP抗体/RF阴性RA患者中的补充诊断价值。

通过ELISA的方法，用实施例1的瓜氨酸化SAA多肽作为检测抗原，检测抗CCP抗体阴性RA患者（34例）、RF阴性RA患者（32例）、抗CCP抗体和RF双阴性的血清阴性RA患者（20例）中的anti-CAP水平。

结果参见图5，结果显示，抗CCP抗体阴性RA患者和RF阴性RA患者中的anti-CAP的阳性率分别为44.12%和43.75%。更重要的是，在抗CCP抗体和RF双阴性的血清阴性RA患者中，anti-CAP的阳性率可达35.00%。

实验表明，本发明提供的瓜氨酸化SAA多肽，能够有效检测出患者生物样本中与其对应的表位抗体抗瓜氨酸化SAA多肽抗体，且该抗体在RA患者中的表达水平显著高于其他疾病对照组和健康组，在早期RA、ESR/CRP正常RA、抗CCP抗体/RF阴性RA都具有优越的诊断价值。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.瓜氨酸化SAA多肽，其特征在于，氨基酸序列如下所示：

DKYFHA-Cit-GNYDAAK-Cit-GPGGA。

2.根据权利要求1所述的瓜氨酸化SAA多肽，其特征在于，氨基酸序列N端还通过半胱氨酸残基偶联有载体蛋白BSA，偶联后的氨基酸序列如下：

BSA-C-DKYFHA-Cit-GNYDAAK-Cit-GPGGA。

3.权利要求1或2所述瓜氨酸化SAA多肽在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用，其特征在于，所述产品用于检测患者生物样本中抗瓜氨酸化SAA多肽抗体含量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，相对于正常健康人、干燥综合征患者、系统性红斑狼疮患者、骨关节炎患者和银屑病关节炎患者，类风湿关节炎患者的生物样本中抗瓜氨酸化SAA多肽抗体含量显著上升。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述类风湿关节炎患者包括病程在12个月以内的早期类风湿关节炎患者、ESR和/或CRP正常的类风湿关节炎患者、血清抗CCP抗体阴性和/或血清RF阴性的类风湿关节炎患者。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物样本为血清。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断产品为ELISA检测试剂盒。

8.一种类风湿关节炎诊断试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述瓜氨酸化SAA多肽、酶标板、ELISA包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗、显色底物和终止液。