CN119837864A - 氯尼达明联合芹菜素治疗结直肠癌的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及氯尼达明联合芹菜素治疗结直肠癌的用途。本发明提供了一种新的治疗结直肠癌的药物组合物。将LND和AP按不同摩尔浓度或不同重量比组成药物组合物，分别在结肠癌肿瘤细胞系MC38培养物和荷瘤小鼠上测试了药物组合物的抗肿瘤活性，结果证明和单药的效果相比，组合药物无论在体外还是体内均显著提升了抗肿瘤细胞的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及氯尼达明联合芹菜素治疗直肠癌的用途。
背景技术
结直肠癌（CRC）是全球第二常见的癌症。传统治疗方法包括手术切除、化疗、放疗和免疫疗法，但存在严重副作用和药物抗性的问题。因此，开发新的治疗策略具有重要意义。
快速增殖的肿瘤细胞通常比正常细胞需要更多的能量。这种增加的能量需求推动了癌细胞的代谢重编程，其中它们表现出对糖酵解的明显偏好，即使在有氧条件下也是如此。这种现象被称为Warburg效应，被认为是癌症的特征。通过依赖糖酵解和改变线粒体功能，癌细胞获得了促进其快速生长和生存的代谢优势。鉴于代谢重编程在癌细胞增殖中的重要作用，靶向这些改变的途径已成为一种有希望的治疗策略。
氯尼达明（Lonidamine，LND）是一种吲唑-3-羧酸衍生物，最初因其抗精子生成特性而被研究作为男性避孕药，在此背景下因其调节肿瘤代谢的能力而受到关注。LND主要通过抑制关键的糖酵解酶，如己糖激酶II，来发挥其抗肿瘤效应，导致癌细胞能量代谢的破坏。此外，LND干扰线粒体功能，导致线粒体膜电位丧失、氧化应激增加，最终导致凋亡。尽管LND作为抗癌剂显示出前景，但其作为单药治疗的使用受到效果有限和剂量依赖性毒性的限制。
芹菜素（Apigenin，AP）是一种黄酮类化合物，广泛存在于各种水果和蔬菜中，如芹菜、百里香、欧洲防风草、洋甘菊、洋葱、橙子和茶。它表现出广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌效果。许多研究已经证明了AP对各种癌症的抗肿瘤效应，如结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌。AP作用的靶点较多，有研究表明AP能有效抑制GLUT1的表达，从而能够抑制糖酵解途径，此外，AP还能通过上调p21和p27这些细胞周期抑制因子，以及下调Cyclin D1和Cyclin E，抑制肿瘤细胞的增殖。AP和多种化疗药物联用能增加化疗药物的疗效和降低化疗的副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗结直肠癌的联合用药组合物。该药物组合物通过协同抑制结肠癌细胞的增殖、迁移，可有效抑制肿瘤生长，相较于两种药物的单独使用，大大增强了对肿瘤细胞的杀伤，更显著地抑制肿瘤细胞的增殖，具有预料不到的技术效果。该药物组合物具有潜在的临床应用价值，为CRC患者提供了一种新的治疗策略。
本发明公开了一种药物组合物在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用；
所述药物组合物的活性成分为氯尼达明（Lonidamine）和芹菜素（apigenin）。
其中所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为2.5~40：1。
优选地，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为1.68~40：1。
优选地，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为5~20：1。
更优选地，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比优选为1.68:1或10:1。
其中所述药物组合物用于抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。
在本发明中，所述药物的剂型可为药剂学上可接受的任意一种剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、混悬剂、糖浆剂、口服液和注射剂中的一种或几种。所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射和舌下给药。
与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：
本发明提供了一种新的治疗结直肠癌的药物组合物，包括氯尼达明和芹菜素；该药物组合物通过以下机制发挥作用： 1. 协同抑制结肠癌细胞的增殖和迁移；2. 诱导细胞周期在G2/M期停滞；3. 促进凋亡，通过对Bcl-2的下调和Bax的上调；4. 破坏糖酵解途径，降低HK2和Glut1的表达，减少葡萄糖消耗和乳酸产量；5. 导致核苷酸耗竭和NAD+代谢紊乱。将LND和AP按不同摩尔浓度或不同重量比组成药物组合物，分别在结肠癌肿瘤细胞系MC38培养物和荷瘤小鼠上测试了药物组合物的抗肿瘤活性，结果证明和单药的效果相比，组合药物无论在体外还是体内均显著提升了抗肿瘤细胞的活性。
附图说明
图1：(A)：MC38 细胞在不同浓度和比例的 LND 和 AP 存在下单独或联合培养48小时，测定细胞增殖；
(B)：联合指数（CI）图。CI 值使用 CompuSyn 软件计算，其中 CI 值<1、= 1 和>1分别表示协同效应、加成效应和拮抗效应；
(C-E)：其中(C)，MC38 细胞与 LND（140 µM）和 AP（14 µM）联合处理后的细胞迁移情况；其中(D, E)：及不同时间点的迁移速率定量分析。所有数据均来自至少三次独立实验。结果以平均值±标准差（SD）表示。数据通过单因素方差分析（one-way ANOVA）处理。****p ≤ 0.0001，**p ≤ 0.01，*p ≤ 0.05，ns，无显著性。
图2：(A) LND联合AP治疗小鼠的体重变化情况。(B) 不同治疗组小鼠的肿瘤体积变化曲线。(C) 肿瘤重量（n = 5）。(D)小鼠肿瘤。(E, F) 使用免疫组织化学（IHC）检测肿瘤组织中Ki67的表达（E），并对表达水平进行量化分析（F）。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计。***p ≤ 0.001，**p ≤ 0.01，*p ≤ 0.05，ns 表示无显著差异。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1，LND、AP两者联合应用可显著抑制MC38肿瘤细胞的增殖和迁移
细胞活性和增殖测定：将细胞（6 × 10^3细胞/mL）种植到96孔板中，每孔100 μL，过夜培养。随后，细胞用含有LND、AP或两者联合的培养基处理48小时。使用CCK-8试剂盒评估细胞活性，按照制造商的说明进行。通过在SpectraMax M5酶标仪（美国加州SunnyvaleMolecular Devices）上测量450 nm处的吸光度来定量细胞增殖。
细胞迁移测定：采用创伤愈合实验评估细胞迁移。将细胞种植到6孔板中，培养至80%-90%的融合度。使用200 μL枪头在细胞单层中引入划痕，然后用无血清培养基冲洗两次以去除碎片。随后，将细胞在含有LND（40~140μM）和AP（4~14μM）的无血清培养基中培养12和24小时，单独和联合。使用倒置显微镜捕获创伤闭合图像，保持一致的放大倍数和位置。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院）分析12和24小时的细胞迁移率。
结果表明，单独使用LND或AP处理导致细胞活性呈剂量依赖性下降；LND：AP混合配比为5~20的情况下，LND和AP联合给药能增加对肿瘤的杀伤，尤其是140 µM LND和14 µM AP显著抑制细胞增殖，效果优于两个单药处理，具有显著的协同效应（CI = 0.637）（如图1中A、B所示）。创伤愈合实验结果表明，LND和AP的联合给药在12和24小时均可见有效地抑制细胞迁移（如图1中C-E所示）。
实施例2，LND、AP两者联合应用可以显著抑制MC38荷瘤小鼠肿瘤的生长
成年雌性C57BL/6小鼠，通过皮下注射MC38细胞（每只小鼠1 × 10^6个细胞）构建结直肠癌小鼠模型。将模型小鼠随机分为四组（每组5只小鼠），每组的平均肿瘤体积为50-100 mm3，分组如下：i）溶剂对照（甲基纤维素/Tween 80，腹腔注射[ip]，每2天一次）；ii）LND（30 mg/kg，ip，每2天一次）；iii）AP（15 mg/kg，ip，每2天一次）；以及iv）LND（30 mg/kg）和AP（15 mg/kg）的联合治疗（ip，每2天一次）。使用卡尺测量肿瘤大小，并使用公式：体积 =长度 ×宽度2× 0.5计算肿瘤体积。治疗终点后，处死小鼠，并收集肿瘤组织称重，肿瘤组织在4%的甲醛中固定后，将组织脱水，石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。按照标准方法进行免疫组化染色，包括以下步骤：石蜡切片水化至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，与一抗（抗Ki67）孵育，与二抗孵育，DAB显色，核复染，脱水和封片。使用光学显微镜（日本奥林巴斯）观察切片。
结果表明，单独用LND或AP治疗的小鼠，以及LND和AP联合治疗的小鼠，体重在初期有一定下降，但能缓慢而逐渐的增加，在治疗终点时体重已和对照组持平，表明单药和联合用药的毒性都较小（图2中A所示）。LND和AP单药治疗组肿瘤生长和肿瘤最后重量和非治疗的对照组相比无显著差异，表明在给定剂量下，单药治疗没有明显疗效，而LND和AP联合治疗组的肿瘤生长和最后重量显著受到抑制（图2中B-D所示）。为了进一步调查LND和AP联合对肿瘤生长的影响，通过免疫组化评估了Ki67表达水平。结果显示Ki67表达在联合治疗组的肿瘤组织中显著降低（图2中E，F所示），表明联合治疗在体内有效抑制了细胞增殖。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种药物组合物在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用；
所述药物组合物的活性成分为氯尼达明（Lonidamine）和芹菜素（apigenin）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为1~40：1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为1.68~40：1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比为5~20：1。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氯尼达明和芹菜素的摩尔比优选为1.68:1或10:1。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物用于抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。
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