CN119822322B - 一种点阵式生物芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种点阵式生物芯片的制备方法。本发明提出通过纳米压印在芯片衬底上形成纳米孔点阵，通过水凝胶在点阵表面均匀形成功能化修饰层，再利用偏转的离子束对衬底进行刻蚀处理；刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；通过有夹角的刻蚀可保留纳米孔的底部和部分侧壁的功能化修饰层，而其它部分的功能化修饰层则被离子束刻蚀干净；IBE的离子源为氩气，化学性质稳定，对材料的化学成分无明显影响，避免了化学残留对功能化材料性能的损害；IBE不产生化学反应副产物，降低了表面残留颗粒和污染风险；IBE离子束能量可调，相对温和的刻蚀避免基底损伤，对表层材料的晶格、表面状态影响小。

Description

一种点阵式生物芯片的制备方法

技术领域

本发明涉及芯片制备技术领域，尤其涉及一种点阵式生物芯片的制备方法。

背景技术

点阵式生物芯片，是一种通过微型化点阵形式对大量生物样品进行高通量分析的微设备。每个点代表一个“检测位点”或“阵列点”，这些点能够特异性地结合目标分子如DNA、RNA或蛋白质。点阵式生物芯片广泛应用于基因分析、疾病检测、蛋白质相互作用研究、药物筛选和环境监测等领域。

点阵式生物芯片的一般结构包括：基底、点阵结构、表面化学修饰层、探针分子；选择性修饰是点阵式生物芯片制作中的重要步骤。其目的是让功能化材料修饰特定区域。选择性修饰技术能够将探针分子固定于修饰区域，未修饰的区域不会固定探针分子，有助于降低背景噪声，改善信噪比，减少非特异性吸附等，确保点阵芯片的独立性和准确性。通过旋涂、喷涂等方式将表面功能化材料均匀涂在基底上，再通过技术手段形成选择性表面，即在点阵底部和侧壁保留功能化材料，而在上表面需要剔除材料，这样探针分子最终在点阵内固定，点阵外的区域通过超声等其他方式去掉。形成选择性修饰表面的技术方法主要有两种，一种是点胶工艺，即准备好表面处理过的基底，利用点样设备设置好点样液滴的体积和间距后，将装载在点样设备的试剂通过点胶针周期性的点在基底上，形成选择性修饰的微阵列。另一种是首先基底表面通过微纳加工工艺形成有高低区别的孔洞点阵图案，进行均匀表面化修饰，再用CMP(化学机械抛光)将图案的突出部分磨去，仅保留孔洞内的表面修饰。CMP结合了化学和物理两种方法来处理表面。具体来说，在磨粒和抛光液的作用下，基低与抛光垫做相对运动，借助纳米磨粒的机械研磨作用与研磨液的化学腐蚀作用，将功能化材料从基底表面突出的部分研磨去除，从而达到去除表面且保留点阵内部材料的目的，最终实现选择性修饰。

点胶工艺存在以下缺陷：点胶工艺虽然可以快速形成具有选择性修饰的点阵结构，但也有显著的缺点。一方面受点样精度限制，难以实现高密度的点阵，无法进行高通量检测，另一方面点样的液滴容易受到基底表面性质，环境温湿度等因素导致点阵均匀性差，影响检测效率和结果。

化学机械抛光(CMP)工艺存在以下缺陷：1、阵列表面颗粒污染，CMP是通过微纳米级的粒子通过物理研磨作用与抛光液的化学腐蚀作用有机结合，对材料表面进行平坦化或去除的过程。但磨粒或抛光液中残留颗粒会附着在点阵表面，特别是对于深孔和槽的结构，会掉里面难以完全清除，影响后续工艺。2、影响功能化材料的活性，由于抛光液中组分复杂，由氧化剂、络合剂、表面活性剂等配置而成，不具有生物相容性，容易导致功能化材料中的功能化基团(包括但不限于羧基、环氧基等)化学性质改变，影响特异性反应。

基于目前的采用点胶工艺、化学机械抛光(CMP)工艺在芯片表面形成选择性修饰表面存在的缺陷，有必要对此进行改进。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种点阵式生物芯片的制备方法，以解决或至少部分解决现有技术中存在的缺陷。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种点阵式生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；

在所述衬底表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层；

将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理，得到点阵式生物芯片；

其中，刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；0°<θ<90°。

优选的，将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理的步骤中，刻蚀工艺参数为：离子源为氩气，氩气流量为5～10sccm，屏栅电压为550～560eV，离子束束流为110～120mA，载片台转速为10～20rpm，刻蚀时间为10～20s。

优选的，在所述衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔，具体包括以下步骤：

提供母版，所述母版表面具有阵列排布的纳米孔；

在母版表面涂覆第一压印胶，将柔性基材压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，在柔性基材上得到与母版相反的图案，形成子版；

在所述衬底表面涂覆增粘剂，加热烘烤后再涂覆第二压印胶，加热烘烤；

将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔。

优选的，所述功能化修饰层所用的材料包括但不限于含有功能化基团的丙烯酰胺基水凝胶；所述功能化基团包括但不限于羧基、环氧基、多糖材料、生物素、羟基化PEG、胺基化PEG中的任一种。

优选的，所述功能化修饰层所用的材料为含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶，所述功能化修饰层的制备方法包括以下步骤：

将含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素混合，得到功能化修饰材料；

将功能化修饰材料旋涂在衬底表面以及纳米孔内，于80～100℃下烘烤10～15min，形成功能化修饰层。

优选的，所述含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素的体积质量比为(1～3)mL:(5～10)mg；

所述含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶的配置方法为：将聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐加入至去离子水中，搅拌，即得含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶；聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐与水的质量体积比为(0.5～2)g:(100～150)mL。

优选的，在所述衬底表面涂覆增粘剂，于115～120℃下加热烘烤3～4min后再涂覆第二压印胶，于115～120℃下加热烘烤2～3min。

优选的，所述衬底包括蓝宝石衬底、硅衬底、石英玻璃衬底、聚酰亚胺衬底、聚对苯二甲酸乙二酯衬底、聚萘二甲酸乙二醇酯衬底中的任一种。

优选的，所述纳米孔的直径为200～300nm、高度为100～150nm；

和/或，所述衬底的厚度为500～1000μm；

和/或，功能化修饰层的厚度为30～50nm。

优选的，3°≤θ≤12°。

本发明的点阵式生物芯片的制备方法，相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明的点阵式生物芯片的制备方法，通过纳米压印在芯片衬底上形成纳米孔点阵，通过水凝胶在点阵表面均匀形成功能化修饰层，再利用偏转的离子束对衬底进行刻蚀处理；刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；0°<θ<90°；通过有通过有夹角的刻蚀可保留纳米孔的底部和部分侧壁的功能化修饰层，而其它部分的功能化修饰层则被离子束刻蚀干净；IBE刻蚀中，离子束在沿着电场方向作用运动，具有很好的方向性，易于实现高度各向异性刻蚀，为实现选择性修饰奠定基础；相比点胶工艺、化学机械抛光(CMP)刻蚀，IBE刻蚀中，无污染残留，低损伤刻蚀，IBE的离子源为氩气，化学性质稳定，为纯物理刻蚀过程，对材料的化学成分无明显影响，避免了化学残留对功能化修饰层材料性能的损害；且IBE不产生化学反应副产物，降低了表面残留颗粒和污染风险；另一方面IBE离子束能量可调，相对温和的刻蚀避免基底损伤，对表层材料的晶格、表面状态影响较小；本发明的点阵式生物芯片的制备方法，不影响保留下来区域的功能化修饰层材料性质，能够保持正常化学活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台进行刻蚀时的示意图；

图2为本发明将形成有功能化修饰层的衬底进行刻蚀时的放大图；

图3为本发明在衬底表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层的示意图；

图4为本发明制备的点阵式生物芯片的结构示意图；

图5为本发明的子版的结构示意图；

图6为本发明在第二压印胶上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔的结构示意图；

图7为按照实施例1中的方法制备得到点阵式生物芯片在荧光显微镜下呈现周期性的荧光点阵信号图；

图8为按照对比例1中的方法制备得到生物芯片在荧光显微镜下呈现整面的荧光信号图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

本发明提供了一种点阵式生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1、在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；

S2、在衬底表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层；

S3、将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理，得到点阵式生物芯片；

其中，刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；0°<θ<90°。

本发明的点阵式生物芯片的制备方法，在衬底10上制备得到阵列排布的纳米孔11；在衬底10表面以及纳米孔11内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层12；将形成有功能化修饰层12的衬底置于离子刻蚀机的载片台1上，进行刻蚀处理；本发明采用离子束刻蚀(Ion Beam Etching，IBE)对功能化修饰层12进行选择性刻蚀，离子束刻蚀(Ion BeamEtching，IBE)是一种利用离子束直接轰击材料表面实现去除的刻蚀工艺；它在一些特定应用中具备显著优势，尤其适用于对材料方向性刻蚀和低损伤刻蚀。离子束刻蚀具有以下优点：高各向异性刻蚀，IBE刻蚀中，离子束在沿着电场方向作用运动，具有很好的方向性，易于实现高度各向异性刻蚀，为实现选择性修饰奠定基础；IBE刻蚀中，无污染残留，低损伤刻蚀，IBE的离子源为氩气，化学性质稳定，为纯物理刻蚀过程，对材料的化学成分无明显影响，避免了化学残留对功能化修饰层材料性能的损害。且IBE不产生化学反应副产物，降低了表面残留颗粒和污染风险。另一方面IBE离子束能量可调，相对温和的刻蚀避免基底损伤，对表层材料的晶格、表面状态影响较小。本发明的点阵式生物芯片的制备方法，利用偏转的离子束对衬底进行刻蚀处理，不影响保留下来区域的功能化修饰层材料性质，能够保持正常活性。

具体的，参考图1所示，将形成有功能化修饰层12的衬底10置于离子刻蚀机的载片台1上，进行刻蚀处理；由于IBE的载片台1的角度可进行0-180°的调节，那么离子束的入射方向与载片台1表面之间的形成0-90°的夹角。在刻蚀时控制离子束入射方向与载片台1表面之间的夹角为θ，即衬底表面与离子束之间的夹角为θ，0°<θ<90°，通过控制夹角θ的大小，对衬底10表面以及纳米孔11内的功能化修饰层12进行选择性刻蚀；进一步的，参考图2所示，对于单个纳米孔11而言，纳米孔11的直径为l，根据三角形关系则有d＝l×tanθ，d为纳米孔11侧壁刻蚀深度，通过有夹角的刻蚀可保留纳米孔11的底部和部分侧壁的功能化修饰层12，而其它部分的功能化修饰层12则被离子束刻蚀干净，参考图4所示，其为经过刻蚀之后制备的点阵式生物芯片的结构示意图。

在一些实施例中，将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理的步骤中，刻蚀工艺参数为：离子源为氩气(Ar)，氩气流量为5～10sccm，屏栅电压为550～560eV，离子束束流为110～120mA，载片台转速为10～20rpm，刻蚀时间为10～20s。

上述实施例中，载片台可以沿着中心轴进行旋转，中心轴与载片台表面相垂直，载片台的转速为10～20rpm，载片台的旋转大大提高了刻蚀的均匀性，最终达到刻蚀目的。

在一些实施例中，θ取值可根据实际情况调整，例如θ取值可为1°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、89°，进一步的，3°≤θ≤12°。

在一些实施例中，在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔，具体包括以下步骤：

S11、提供母版，母版表面具有阵列排布的纳米孔；

S12、在母版表面涂覆第一压印胶，将柔性基材压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，在柔性基材上得到与母版相反的图案，形成子版；

S13、在衬底表面涂覆增粘剂，加热烘烤后再涂覆第二压印胶，加热烘烤；

S14、将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔。

具体的，本发明采用青岛天仁微纳科技有限公司的高精度量产型紫外纳米压印光刻设备，在第二压印胶上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔；其中，子版的制备方法具体为：

S111、提供母版，母版表面具有阵列排布的纳米孔；对母版进行清洗工艺：采用SPM溶液，即质量浓度为98％的浓硫酸和质量分数为30％过氧化氢按体积比7:3混合，得到SPM溶液；将母版置于在SPM溶液中浸泡15min，之后用去离子水冲洗吹干，备用；

S112、在S111中清洗完成后的母版上涂覆第一压印胶，具体采用旋涂法旋涂第一压印胶；第一压印胶旋涂过程：在母版上滴加第一压印胶，以4000r/min的速度旋涂60秒；

利用纳米压印设备，将柔性基材如PET膜压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，PET膜上复制出与母版相反的图案，即得到子版；具体的，采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300～350mj/cm²。

如图5所示，其为子版2的结构示意图，包括柔性基材21，第一压印胶固化后形成阵列排布的凸台22，可以理解，凸台22与母版上的纳米孔相适配，也与第二压印胶13上的纳米孔11相适配。

具体的，母版表面具有阵列排布的纳米孔，母版材料为硅片，其可采用光刻工艺在母版上形成阵列排布的纳米孔。

子版制作完成后，即可开始对目标衬底压印，具体包括以下步骤：

S13、先对衬底进行增粘处理，在衬底表面滴加增粘剂，并以3000r/min的速度旋涂30s，接着用115～120℃的温度在热板上烘烤3～4min；烘烤完等待衬底冷却后接着旋涂第二压印胶，将第二压印胶滴加在增粘剂上以2000r/min的速度旋涂60s，并在热板上以115～120℃烘烤2～3min；

S14、利用纳米压印设备，将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版图案相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；具体的，采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300～350mj/cm²。

上述方法通过纳米压印在衬底上实现纳米孔点阵后，实际中还可以采用紫外光刻、喷墨打印等方法在衬底上制备得到阵列排布的纳米孔。采用纳米压印的方法在衬底上实现纳米孔点阵，成本更低，有利于工业化批量生产。

在一些实施例中，功能化修饰层所用的材料包括但不限于含有功能化基团的丙烯酰胺基水凝胶；功能化基团包括但不限于羧基、环氧基、多糖材料、生物素、羟基化PEG(聚乙二醇)、胺基化PEG中的任一种。

在一些实施例中，多糖材料如如琼脂糖、右旋糖酐等。

在一些实施例中，水凝胶还可以采用其它种类的水凝胶，具体根据实际情况进行选择。

在一些实施例中，第一压印胶、第二压印胶为市售常规的紫外压印胶，例如可为Imprint的IPNR-PC1000，IPNR-PC2000等，还可以采用德国Micro Resist纳米压印胶mr-NIL6000系列、mr-UVCur06、mr-UVCur21等。

在一些实施例中，增粘剂为市售常规的增粘剂，比如可采用DisChem-CHEMISTRYFOR ADVANCED LITHOGRAPHY的微纳光刻增粘剂SurPass，型号SurPass 3000，SurPass4000。

在一些实施例中，功能化修饰层所用的材料为含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶，功能化修饰层的制备方法包括以下步骤：

S21、将含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素(分子式：C₂₁H₁₁NO₅S)混合，得到功能化修饰材料；

S22、将功能化修饰材料旋涂在衬底表面以及纳米孔内，于80～100℃下烘烤10～15min，形成功能化修饰层。

在一些实施例中，含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素的体积质量比为(1～3)mL:(5～10)mg。

在一些实施例中，含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶的配置方法为：将聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐加入至去离子水中，搅拌，即得含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶；聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐与水的质量体积比为(0.5～2)g:(100～150)mL。

在一些实施例中，在衬底表面涂覆增粘剂，于115～120℃下加热烘烤3～4min后再涂覆第二压印胶，于115～120℃下加热烘烤2～3min。

在一些实施例中，衬底10包括蓝宝石衬底、硅衬底、石英玻璃衬底等硬质衬底；还包括聚酰亚胺(PI)衬底、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)衬底、聚萘二甲酸乙二醇酯衬底等柔性衬底。

在一些实施例中，纳米孔11的直径为200～300nm、高度(即深度)为100～150nm，任意相邻两个纳米孔之间的距离为500～600nm。

在一些实施例中，衬底10的厚度为500～1000μm。

在一些实施例中，功能化修饰层12的厚度为30～50nm。

进一步的，参考图3～6所示，在衬底10表面涂覆增粘剂，加热烘烤后再涂覆第二压印胶，加热烘烤；将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶13上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔11，如图6所示；然后在衬底10表面、第二压印胶13表面以及纳米孔11内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层12，如图3所示，最后将形成有功能化修饰层12的衬底10置于离子刻蚀机的载片台上，对功能化修饰层进行选择性刻蚀，并最终得到图4所示的生物点阵芯片。

以下进一步以具体实施例说明本申请的点阵式生物芯片的制备方法。本部分结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。如未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例中，第一压印胶为mr-UVCur06，第二压印胶为mr-UVCur21，增粘剂为SurPass 4000；聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐即聚(丙烯酰胺-co-丙烯酸)偏钠盐，购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS编号:62649-23-4，分子式:C₉H₁₂NNaO₅。

实施例1

本申请实施例提供了一种点阵式生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1、在厚度为675μm的硅片衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔，具体制备方法为：

S11、提供母版，母版表面具有阵列排布的纳米孔；对母版进行清洗工艺：采用SPM溶液，即将质量浓度为98％的浓硫酸和质量分数为30％过氧化氢按体积比7:3混合，得到SPM溶液；将母版置于在SPM溶液中浸泡15min，之后用去离子水冲洗吹干，备用；

S12、在S11中清洗完成后的母版上涂覆第一压印胶，具体采用旋涂法旋涂第一压印胶；第一压印胶旋涂过程：在母版上滴加第一压印胶，以4000r/min速度旋涂60秒；利用纳米压印设备，将柔性基材PET膜压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，PET膜上复制出与母版相反的图案，即得到子版；采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300mj/cm²；

S13、在衬底表面滴加增粘剂，并以3000r/min的速度旋涂30s，接着于115℃下烘烤3min；烘烤完等待衬底冷却后接着旋涂第二压印胶，将第二压印胶滴加在增粘剂上以2000r/min的速度旋涂60s，并于115℃下烘烤2min；

S14、利用纳米压印设备，将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版图案相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300mj/cm²；纳米孔直径为200nm、高度(即深度)为100nm，任意相邻两个纳米孔之间的距离为500nm；

S2、在衬底表面、第二压印胶表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层；

功能化修饰层所用的材料为含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶，功能化修饰层的制备方法包括以下步骤：

S21、将1mL含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与5mg异硫氰酸荧光素混合，得到功能化修饰材料；含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶的配置方法为：将1g聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐加入至100mL去离子水中，搅拌，即得含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶；

S22、将功能化修饰材料滴加在衬底表面、第二压印胶表面以及纳米孔内，并以3000r/min的速度旋涂60s，于80℃下烘烤10min，形成功能化修饰层；功能化修饰层的厚度为30nm；

S3、将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理，得到点阵式生物芯片；

其中，刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；θ为8°；刻蚀工艺参数为：离子源为氩气(Ar)，氩气流量为5sccm，屏栅电压为550eV，离子束束流为110mA，载片台转速为10rpm，刻蚀时间为20s。

对比例1

本对比例提供了一种生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1、在厚度为675μm的硅片衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔，具体制备方法为：

S11、提供母版，母版表面具有阵列排布的纳米孔；对母版进行清洗工艺：采用SPM溶液，即将质量浓度为98％的浓硫酸和质量分数为30％过氧化氢按体积比7:3混合，得到SPM溶液；将母版置于在SPM溶液中浸泡15min，之后用去离子水冲洗吹干，备用；

S12、在S11中清洗完成后的母版上涂覆第一压印胶，具体采用旋涂法旋涂第一压印胶；第一压印胶旋涂过程：在母版上滴加第一压印胶，以4000r/min速度旋涂60秒；利用纳米压印设备，将柔性基材PET膜压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，PET膜上复制出与母版相反的图案，即得到子版；采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300mj/cm²；

S13、在衬底表面滴加增粘剂，并以3000r/min的速度旋涂30s，接着于115℃下烘烤3min；烘烤完等待衬底冷却后接着旋涂第二压印胶，将第二压印胶滴加在增粘剂上以2000r/min的速度旋涂60s，并于115℃下烘烤2min；

S14、利用纳米压印设备，将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版图案相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；采用波长为365纳米的紫外光进行固化，紫外光强度为300mj/cm²；纳米孔直径为200nm、高度(即深度)为100nm，任意相邻两个纳米孔之间的距离为500nm；

S2、在衬底表面、第二压印胶表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层，得到生物芯片；

功能化修饰层所用的材料为含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶，功能化修饰层的制备方法包括以下步骤：

S21、将1mL含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与5mg异硫氰酸荧光素混合，得到功能化修饰材料；含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶的配置方法为：将1g聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐加入至100mL去离子水中，搅拌，即得含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶；

S22、将功能化修饰材料滴加在衬底表面、第二压印胶表面以及纳米孔内，并以3000r/min的速度旋涂60s，于80℃下烘烤10min，形成功能化修饰层；功能化修饰层的厚度为30nm。

性能测试

按照实施例1中的方法制备得到点阵式生物芯片，在荧光显微镜下使用488纳米激发波长的光，可在荧光显微镜下呈现周期性的荧光点阵信号，结果如图7所示。

按照对比例1中的方法制备得到生物芯片，在荧光显微镜下使用488纳米激发波长的光，可在荧光显微镜下呈现整面的荧光信号，结果如图8所示。

由图7～8对比可知，IBE选择性刻蚀前，功能化修饰材料涂覆整个纳米孔阵列表面，即整面探测到荧光信号；而采用IBE对功能化修饰层进行选择性刻蚀后，纳米孔内呈现荧光信号，即纳米孔内部有功能化材料，纳米孔外的区域功能化材料被去除，即选择性修饰，进而实现了周期性的荧光点阵信号。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔；

在所述衬底表面以及纳米孔内涂覆功能化修饰材料，以形成功能化修饰层；

将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理，得到点阵式生物芯片；

其中，刻蚀时离子束入射方向与载片台表面之间的夹角为θ，以对功能化修饰层进行选择性刻蚀；0°<θ<90°。

2.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，将形成有功能化修饰层的衬底置于离子刻蚀机的载片台上，进行刻蚀处理的步骤中，刻蚀工艺参数为：离子源为氩气，氩气流量为5～10sccm，屏栅电压为550～560eV，离子束束流为110～120mA，载片台转速为10～20rpm，刻蚀时间为10～20s。

3.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，在所述衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔，具体包括以下步骤：

提供母版，所述母版表面具有阵列排布的纳米孔；

在母版表面涂覆第一压印胶，将柔性基材压印在第一压印胶上，紫外固化，脱模，在柔性基材上得到与母版相反的图案，形成子版；

在所述衬底表面涂覆增粘剂，加热烘烤后再涂覆第二压印胶，加热烘烤；

将子版压印在第二压印胶上，紫外固化，脱模，在第二压印胶上得到与母版相同的阵列排布的纳米孔，即在衬底表面制备得到阵列排布的纳米孔。

4.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，所述功能化修饰层所用的材料包括但不限于含有功能化基团的丙烯酰胺基水凝胶；所述功能化基团包括但不限于羧基、环氧基、多糖材料、生物素、羟基化PEG、胺基化PEG中的任一种。

5.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，所述功能化修饰层所用的材料为含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶，所述功能化修饰层的制备方法包括以下步骤：

将含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素混合，得到功能化修饰材料；

将功能化修饰材料旋涂在衬底表面以及纳米孔内，于80～100℃下烘烤10～15min，形成功能化修饰层。

6.如权利要求5所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，所述含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶与异硫氰酸荧光素的体积质量比为(1～3)mL:(5～10)mg；

所述含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶的配置方法为：将聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐加入至去离子水中，搅拌，即得含有羧基基团的丙烯酰胺基水凝胶；聚(丙烯酰胺-丙烯酸)部分钠盐与水的质量体积比为(0.5～2)g:(100～150)mL。

7.如权利要求3所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，在所述衬底表面涂覆增粘剂，于115～120℃下加热烘烤3～4min后再涂覆第二压印胶，于115～120℃下加热烘烤2～3min。

8.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，所述衬底包括蓝宝石衬底、硅衬底、石英玻璃衬底、聚酰亚胺衬底、聚对苯二甲酸乙二酯衬底、聚萘二甲酸乙二醇酯衬底中的任一种。

9.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，所述纳米孔的直径为200～300nm、高度为100～150nm；

和/或，所述衬底的厚度为500～1000μm；

和/或，功能化修饰层的厚度为30～50nm。

10.如权利要求1所述的点阵式生物芯片的制备方法，其特征在于，3°≤θ≤12°。