CN119818494A - 夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用。所述夫拉平度的类似物包括voruciclib、荭草苷或牡荆素。本发明的实验结果发现FH及其类似物处理黑素细胞及黑素瘤细胞后，上述细胞黑素生成能力显著下降，包括细胞增殖能力抑制，黑素含量降低，黑素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1等的表达水平也显著下调，并且酪氨酸酶的活性降低。进一步在斑马鱼胚胎模型中，我们观察到了FH的强大美白功效以及安全性。本研究结果提示FH及其类似物有望成为色素性皮肤病的候选治疗药物。

Description

夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用。

背景技术

夫拉平度（Fipexide Hydrochloride，FH）是一种经典的多巴胺受体调节剂，最初用于治疗神经系统相关疾病。该药物具有神经保护和代谢调节作用，通过作用于中枢神经系统和多种信号通路改善细胞功能。在皮肤相关研究中，FH可能通过调节信号通路和炎症反应，但尚无FH直接调控黑素细胞功能的相关报道。

色素性皮肤病是由遗传、基因突变、外界刺激、药物、饮食作息等多种因素引起的，可导致皮肤中黑素细胞的分化、增殖、迁移异常，黑素合成、分泌及转运出现紊乱，这类皮肤病在皮肤科中非常常见。虽然大多数色素性皮肤病不会危及生命，但仍有一定比例先天性疾患存在黑素瘤恶变风险，特殊部位的巨大皮损常难以手术切除且有存在损容或功能障碍风险，最终会严重影响外貌美观，日常的工作、学习和生活，甚至出现死亡。给患者带来了巨大的心理、身体以及经济负担。随着人们对自己身心健康及外表容貌的关注度不断提高，越来越多的患者开始重视色素性皮肤病的早期干预以及非手术治疗手段。临床上常见的色素性皮肤病包括各种类型的色素痣（主要是先天性色素痣以及有恶变风险的巨痣）及黑素瘤，各种色素斑（主要是黄褐斑、雀斑、太田痣、炎症后色素沉着等）以及色素脱失/减退斑（主要是白癜风、炎症后色素减退等），但传统的治疗方法如手术、激光以及常规药物治疗效果十分有限，寻找安全有效的治疗策略仍然是临床医师面临的巨大挑战。因此，筛寻新的治疗靶点、研发新的药物及治疗策略将迫在眉睫。

黑素合成（melanogenesis）是一个复杂的生物过程，涉及黑素细胞的分化、增殖、迁移以及黑素的合成、分泌和转运。该过程不仅决定了皮肤、毛发和眼睛的颜色，还与多种皮肤病密切相关，尤其是在黑素异常沉积类疾病中。黑素细胞起源于胚胎时期的神经嵴细胞，它们通过迁移到皮肤、毛囊等处发挥功能。分化过程中，Wnt信号通路、SOX10和MITF等调控因子发挥重要作用，MITF调节酪氨酸酶（TYR）等黑素合成酶的表达。黑素生成过程中的黑素细胞分化、增殖、迁移，黑素合成和转运等环节受到精密的调控。任何环节的紊乱都会导致黑素的异常沉积或分布不均，进而引发多种色素性皮肤病，如白癜风：一种自身免疫性疾病，免疫系统攻击黑素细胞，导致皮肤色素脱失，形成白斑；各种色素斑如雀斑和黄褐斑、黑棘皮病、皮肤老化和光老化等；先天性色素痣：胚胎时期黑素细胞的异常增殖导致皮肤表面形成色素沉积区；虽然大多数是良性，但较大的先天性色素痣可能有恶性转化的风险，如发展为恶性黑素瘤。这些机制的深入研究不仅有助于解释色素性疾病的发生，也为开发新的治疗策略提供了依据。

UBR5（又名EDD1）是E3泛素连接酶家族的重要成员，参与泛素-蛋白酶体途径调控细胞内多种蛋白质的降解。作为E3泛素连接酶，UBR5通过与特定底物结合并将泛素分子连接到这些蛋白质上，标记其进入蛋白酶体进行降解，从而调节细胞内的蛋白质稳态。UBR5的功能广泛，涉及细胞周期控制、DNA损伤应答、基因转录调控、信号传导等多个生物学过程，并与多种疾病密切相关，特别是在癌症、神经退行性疾病及炎症相关病理机制中。目前尚无研究报道阐述UBR5对黑素细胞黑素生成功能的影响及机制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是明确药物EA及其类似物在黑素生成中的调控作用，提供一种新的治疗色素性皮肤病的药物。

本发明结合AI药物虚拟筛选技术与生物功能验证，我们发现FH在抑制UBR5活性方面显示出良好的潜力。基于UBR5在黑素生成中的关键作用，我们推测这种小分子抑制剂及其类似物可能通过调控UBR5的表达或功能，从而抑制黑素的生成，为开发高效、安全的美白产品提供了理论支持。通过深入探究UBR5在色素生成中的作用机制，筛选并验证潜在小分子药物的功能与活性，本研究为基于UBR5靶点的药物开发提供了新思路。这一研究不仅拓展了UBR5在色素性皮肤病治疗中的应用潜力，也为新型化妆品和治疗性药物的研发提供了科学依据。

本发明的技术方案是：

本发明提供了夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用。

优选的，所述夫拉平度的类似物包括voruciclib、荭草苷或牡荆素。

优选的，所述色素性皮肤病包括色素增加性皮肤病和色素减少性皮肤病。

优选的，所述色素性皮肤病包括色素痣、色素斑、色素脱失/减退斑。

优选的，所述色素性皮肤病包括色素痣、先天性色素痣以及有恶变风险的巨痣、黄褐斑、雀斑、太田痣、炎症后色素沉着、白癜风、炎症后色素减退。

进一步所述色素性皮肤病包括各种类型的色素痣（主要是先天性色素痣以及有恶变风

险的巨痣）及黑素瘤，各种色素斑（主要是黄褐斑、雀斑、太田痣、炎症后色素沉着等）以及色素脱失/减退斑（主要是白癜风、炎症后色素减退等）。

本发明还提供了夫拉平度及其类似物在制备调控黑素生成的抑制剂或活化剂中的应用。

本发明还提供了夫拉平度及其类似物在制备酪氨酸酶活性抑制剂或增强剂中的应用。

本发明还提供了夫拉平度及其类似物在制备美白制剂或者美白药物中的应用。

进一步的，所述夫拉平度的类似物包括voruciclib、荭草苷或牡荆素。

进一步的，所述夫拉平度为盐酸夫拉平度。

本发明的实验结果发现FH及其类似物处理黑素细胞及黑素瘤细胞后，上述细胞黑素生成能力显著下降，包括细胞增殖能力抑制，黑素含量降低，黑素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1等的表达水平也显著下调，并且酪氨酸酶的活性降低。进一步在斑马鱼胚胎模型中，我们观察到了FH的强大美白功效以及安全性。本研究结果提示FH及其类似物有望成为色素性皮肤病的候选治疗药物。

以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述：

附图说明

图1是对GTEX数据库中皮肤组织（左）与色素痣组织（右）转录组测序数据进行差异分析图，经log2转换用后采用wilcox.test比较两组之间UBR5的mRNA表达水平。

图2是在B16F10细胞中敲除UBR5后的检测结果图：其中，图2A是离心沉淀的颜色变化图；图2B是检测细胞内黑素含量变化图；图2C是检测酪氨酸酶活性变化图；图2D用Western blot方法检测细胞内重要转录因子MITF及黑素合成关键蛋白TRP1、TRP2及TYR表达的变化图，图2E是图2D的统计图；图2F、2G在斑马鱼中敲除UBR5后，检测其头部黑色素信号强度及其统计图；

图3是Western blot方法检测抑制UBR5表达后的检测结果图；其中图3A是PIG1、MNT1细胞中黑素合成通路重要转录因子MITF及黑素合成关键蛋白TRP1、TRP2及TYR表达图，图3B、图3C是黑素含量及酪氨酸酶活性的变化统计图；

图4是Western blot方法检测过表达UBR5后的检测结果图；其中，图4A是PIG1、MNT1细胞中黑素合成通路重要转录因子MITF及黑素合成关键蛋白TRP1、TRP2及TYR表达图，图4B、图4C是MNT1细胞中黑素含量及酪氨酸酶活性的变化统计图。

图5是用特定浓度的UBR5潜在结合小分子药物干预B16F10细胞，检测细胞中含有的黑素含量变化。

图6A为EA与UBR5蛋白对接的3D图，图6B为用含有不同浓度EA的培养基培养B16F10细胞系24h及48h后，CCK8法检测其增殖活性图。

图7A为用特定浓度EA处理B16F10细胞系，Western blot方法检测MITF、TYR、TYRP1、TYRP1等黑素生成相关基因蛋白表达水平图；图7B、图7C同时对黑素含量及酪氨酸酶活性变化进行检测的结果图。

图8A、图8B为用特定浓度EA的培养液培养斑马鱼胚胎后，在2dpf时观察斑马鱼头部黑素信号强度及其统计结果。图8C、图8D将EA做成2mg/ml的水凝胶涂抹于小鼠尾部固定位置，观察鼠尾颜色25天的变化及其统计结果图。

图9A、图9B为用特定浓度的EA类似物E1、E2、E3处理B16F10细胞系，检测黑素含量（图9A）及酪氨酸酶活性变化图（图9B）。

图10A为FH与UBR5蛋白对接的3D图，图10B为用含有不同浓度FH的培养基培养B16F10细胞系24h及48h后，CCK8法检测其增殖活性图。

图11A为用特定浓度FH处理B16F10细胞系，Western blot方法检测MITF、TYR、TYRP1、TYRP1等黑素生成相关基因蛋白表达水平图；图11B是对黑素含量检测结果图；图11C是对酪氨酸酶活性变化进行检测结果图。

图12为用特定浓度FH的培养液培养斑马鱼胚胎后，在2dpf时观察斑马鱼头部黑素信号强度图（图12A）及其统计结果图（图12B）。

图13为用特定浓度的FH类似物F1、F2、F3处理B16F10细胞系，检测黑素含量（图13A）及酪氨酸酶活性变化图（图13B）；图13C为voruciclib与UBR5的分子对接示意图。

具体实施方式

实施例1

1、基因敲除UBR5的鼠源黑素细胞系构建及Western blot鉴定。

1.1组别设置：

sgNC（对照组）

sgUbr5（UBR5基因敲除组）

1.2实验方法及流程：

（1）lip2000转染试剂，按1 μg质粒（购自丰晖生物）与3 μl转染试剂混合，室温放置15 min；

（2）加入预选铺板的B16F10细胞中，孵育6 h之后用完全培养基换液；

（3）培养48h之后加入嘌呤霉素1 μg/ml筛选一周，至只有少量死细胞时，取细胞进行后续检测。

（4）UBR5敲除用sgRNA序列为：

#1 GGGTCTGCCTGCGTGAATCA CGG（SED ID NO1）

#2 CAGACCCGCGTCATCCGCAC CGG（SED ID NO2）

1.3实验结果：

由图2D所示基因敲降UBR5的小鼠黑素细胞系构建成功，Western blot鉴定结果显示相较于对照组，基因敲除组的UBR5蛋白表达量显著下降。

实施例中sgRNA序列合成方法、siRNA序列合成、shRNA序列合成方法为现有方法，可以参考文献：Bek JW, Shochat C, De Clercq A, De Saffel H, Boel A, Metz J,Rodenburg F, Karasik D, Willaert A, Coucke PJ. Lrp5 Mutant and CrispantZebrafish Faithfully Model Human Osteoporosis, Establishing the Zebrafish asa Platform for CRISPR-Based Functional Screening of Osteoporosis CandidateGenes. J Bone Miner Res. 2021 Sep;36(9):1749-1764. doi: 10.1002/jbmr.4327 .Epub 2021 May 19. PMID: 33957005。

2、基因沉默/过表达UBR5的人源黑素细胞系构建及Western blot鉴定。

2.1组别设置：

siNC or Vector（对照组）

siUBR5 or UBR5 OE（UBR5基因沉默/过表达组）

2.2实验方法及流程：

使用使用lip2000转染试剂，按100pmol siRNA与5 μl转染试剂混合，室温放置20min；

加入预选铺板的PIG1、MNT1细胞中，孵育6 h之后换液；

（3）培养48h之后收取细胞进行下一步实验。

（4）UBR5沉默用siRNA序列（购买于苏州吉玛基因股份有限公司）为：

#1 GCAAGGUUGAAUUGUUUCATT（SED ID NO3）

#2 GGUCAAUAGUAGAGAAGAUTT（SED ID NO4）

UBR5过表达shRNA序列（购买于苏州吉玛基因股份有限公司）为：ACGUGACACGUUCGGAGAA （SED ID NO5）

2.3实验结果：

由图3A、4A所示基因沉默或过表达UBR5的人源黑素细胞系构建成功，Westernblot鉴定结果显示相较于对照组，基因沉默/过表达组的UBR5蛋白表达量显著下降/上升。

3、干预UBR5基因表达后检测黑素细胞的黑素生成相关基因MITF(小眼畸形相关转录因子)、TRP1（酪氨酸酶相关蛋白 1）、TRP2（酪氨酸酶相关蛋白 2）、TYR（酪氨酸酶）等蛋白的表达水平，黑素细胞的黑素含量及酪氨酸酶活性。

3.1实验方法及流程：

Western Blot：用RIPA裂解液（货号：P0013C,碧云天）提取蛋白，并在4 ℃以12000rpm（转/分钟）离心10 min（分钟）。通过BCA蛋白测定法（货号：P0010S,碧云天）测定蛋白质浓度，实验前煮沸5 min。每孔上样20μg蛋白质样品，用10％SDS PAGE（分离胶）分离，转移到PVDF膜。 5％BSA封闭2 h后，将膜在4 ℃下与一抗(TYR、TYRP1、TYRP1、MITF、UBR5)孵育过夜。用PBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与有HRP（辣根过氧化物酶）标记的山羊抗兔IgG（货号：AS014,abclonal）或抗小鼠IgG（货号：AS003,abclonal）二抗孵育60 min，通过ECL化学发光法（货号：P10300,新赛美）检测结合的抗体。

其中BCA：bicinchoninic acid，二喹啉甲酸； PVDF：聚偏二氟乙烯膜，polyvinylidene fluoride；BSA：牛血清白蛋白，bovine serum albumin；ECL：Electrochemiluminescence，电化学发光发。

（2）黑素含量测定：将PIG1、MNT1、B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解，使用酶标仪在470 nm处测量吸光度。

（3）酪氨酸酶活性测定：将PIG1、MNT1、B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，200 μl 1%tritonX100（货号：A600198-0500，生工）裂解细胞，立即放入-80 ℃30 min后取出，置于37℃条件下解冻，1000g离心10 min，取上清与L-DOPA（货号：59-92-7，阿拉丁）置于37 ℃孵育20 min后用酶标仪检测其475 nm处吸光度。

3.2实验结果：

图2DE、3A、4A显示相较于对照组，基因干预组中黑素生成相关基因MITF、TRP1、TRP2、TYR等蛋白的表达水平显著变化。

图2BC、3BC、4BC结果显示相较于对照组，基因干预组中黑色素含量及酪氨酸酶活性出现显著变化。

4、敲除UBR5基因后观察斑马鱼模型中黑素生成能力的变化。

4.1组别设置：

sgNC（对照组）

sgUbr5（UBR5基因敲除组）

4.2实验方法及流程：

（1）UBR5敲除用sgRNA序列设计如下：

#1 GGGTCTGCCTGCGTGAATCA CGG（SED ID NO1），

#2 CAGACCCGCGTCATCCGCAC CGG（SED ID NO2）

将sgRNA靶点共注射。对照组为注射无效靶点。用野生斑马鱼胚胎进行显微注射，在斑马鱼1细胞期进行显微注射，每组注射约200颗胚胎，2 dpf后，每组随机选择15条鱼拍摄斑马鱼头部图片，分析斑马鱼头部的黑色素信号强度，从而评价其黑素生成的差异变化。

4.3实验结果：

由图2FG所示，与对照组相比，敲除UBR5后，斑马鱼头部黑素信号强度显著下降。

5、基于药物库高通量AI虚拟筛选UBR5潜在小分子药物

5.1实验方法及流程：

具体可通过蛋白对接得到，利用软件Maestro模拟靶蛋白和化合物的分子对接，预测其可能的结合位点和相互作用。利用软件Maestro模拟分别对UBR5与Seleck化合物库（L1200、L1300、L1400、L1700、L1700-1、L3500、L3600、L3800、L3900、L5000、L5800、L7800、L7900）中的化合物进行分子对接，找到可能与UBR5相互结合的化合物。

5.2实验结果：

结果显示，大约30余种小分子化合物均与UBR5酶活中心或其周围有较好的结合，说明这些化合物一定程度上阻断或活化UBR5催化位点，从而发挥对UBR5酶活性的抑制或活化作用。详见以下表1：

6、UBR5潜在结合小分子药物干预后检测黑素细胞的黑素含量变化。

6.1组别设置：

Control（对照组）

GSK369796二盐酸盐 50 μM（U1 干预组）

CP-91149 50 μM（U2 干预组）

头孢丙烯一水合物 50 μM（U3 干预组）

头孢克洛 50 μM （U4 干预组）

氨苄青霉素 50 μM（U5 干预组）

头孢氨苄 50 μM（U6 干预组）

AZD5363 50 μM（U7 干预组）

鞣花酸 0.25 μM（EA 干预组）

夫拉平度0.1 μM（FH 干预组）

6.2实验方法及流程：

（1）黑素含量测定：将B16F10黑素细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解，使用酶标仪在470 nm处测量吸光度。

6.3实验结果：

图5结果显示相较于对照组，U1-U7干预组中黑素含量未出现显著变化。EA及FH

组中黑素含量呈现显著差异。综上结果提示EA及FH作为UBR5潜在结合小分子表现出独特的黑素生成抑制活性。

实施例2

1、EA（鞣花酸）对黑素细胞系增殖的影响。

1.1组别设置：

Control（对照组）

EA 0.1 μM（EA组浓度1）

EA 1 μM （EA组浓度2）

EA 10 μM（EA组浓度3）

EA 50 μM（EA组浓度4）

1.2实验方法及流程：

（1）CCK8测定：将细胞按5 x 10³个/孔接种到96孔板中，每孔100 µL培养基，设置空白孔。添加浓度梯度的EA，继续培养24 h和48 h。在培养结束后，每孔加入10 µL的CCK-8溶液（1:10比例与培养基混合）。将96孔板放回培养箱，在37 °C、5% CO₂条件下避光孵育2-3h。孵育结束后，用酶标仪在450 nm波长处读取各孔的吸光度（OD值）。

1.3实验结果：

图6AB显示EA结合于UBR5酶活中心或其周围，且可以显著抑制黑素细胞系的增殖，且具有浓度依赖性及时间依赖性。

2、Western blot鉴定黑素合成相关蛋白MITF、TYRP1、TYRP2、TYR蛋白表达的变化。

2.1组别设置：

Control（对照组）

EA 0.25 μM 24h（EA干预组1）

EA 0.25 μM 48h（EA干预组2）

2.2实验方法及流程：

（1）Western Blot：用RIPA裂解液（碧云天）提取蛋白，并在4 ℃以12000 rpm离心10 min。通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度，实验前煮沸5 min。每孔上样20 μg蛋白质样品，用10％SDS PAGE分离，转移到PVDF膜。 5％BSA封闭2 h后，将膜在4 ℃下与一抗(TYR、TYRP1、TYRP1、MiTF、UBR5)孵育过夜。用PBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与有HRP标记的山羊抗兔IgG或抗小鼠IgG二抗孵育 60 min，通过ECL化学发光法检测结合的抗体。（具体方法同实施例1）

2.3实验结果：

由图7A所示经EA处理B16F10细胞后，Western blot结果显示相较于对照组，干预组黑素合成相关蛋白MITF、TYRP1、TYRP2、TYR蛋白表达有显著下调。

3、EA对黑素细胞系黑素含量及酪氨酸酶活性影响的测定。

3.1组别设置：

Control （对照组）

EA 0.25 μM 24h（EA干预组1）

EA 0.25 μM 48h（EA干预组2）

3.2实验方法及流程：

（1）黑素含量测定：将黑素细胞系(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解，使用酶标仪在470nm处测量吸光度。

（2）酪氨酸酶活性测定：将黑素细胞系(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，200 μL 1%tritonX100裂解细胞，立即放入-80 ℃30 min后取出，置于37℃条件下解冻，1000g离心10 min，取上清与L-DOPA置于37℃孵育20 min后用酶标仪检测其475 nm处吸光度。

3.3实验结果：

图7BC示EA可显著抑制B16F10细胞的黑色素含量及酪氨酸酶活性。

4、EA在斑马鱼及小鼠尾部模型黑素生成调控作用中的体内研究。

4.1组别设置：

Control（对照组）

EA（EA干预组）

Gel-vehicle（空白凝胶组）

Gel-EA（EA凝胶组）

4.2实验方法及流程

（1）斑马鱼黑素检测：随机选取6 hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼胚胎。水溶给予EA（浓度1.95μg/ml）同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。28℃处理2天后，每个实验组随机选取5尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用Image J高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度，以该指标的统计学分析结果评价样品美白功效。统计学处理结果采用mean±SEM表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析。

（2）小鼠尾部黑素检测：随机将小鼠分成三组，除了对照组不做干预，每天在小鼠尾部固定区域涂抹空白凝胶及EA凝胶，连续给药25天后，观察小鼠尾部涂药区域的颜色变化，并用Image J高级图像处理软件分析并采集数据，分析小鼠尾部灰度值。

4.3实验结果：由图8示EA可显著抑制斑马鱼胚胎及小鼠尾部皮肤的黑素生成能力。

5、EA的结构类似物对黑素细胞系的黑素含量及酪氨酸酶活性影响的测定。

5.1组别设置：

Control（对照组）

E1（安石榴苷干预组）

E2（Corilagin干预组）

E3（石榴苷干预组）

5.2实验方法及流程

（1）细胞干预：分别用10 μM的安石榴苷、Corilagin及石榴苷处理B16F10细胞系，24 h后胰酶消化细胞用于下一步实验。

（1）黑素含量测定：将B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1 ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解，使用酶标仪在470 nm处测量吸光度。

（2）酪氨酸酶活性测定：将B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，200 μl 1%tritonX100裂解细胞，立即放入-80 ℃30 min后取出，置于37 ℃条件下解冻，1000g离心10 min，取上清与L-DOPA置于37 ℃孵育20 min后用酶标仪检测其475 nm处吸光度。

5.3实验结果：图9AB示EA的结构类似物可显著抑制B16F10黑素细胞系的黑素含量及酪氨酸酶活性。

实施例3

1、FH（夫拉平度）对黑素细胞系增殖的影响。

1.1组别设置：

Control（对照组）

FH 0.1 μM（FH组浓度1）

FH 1 μM （FH组浓度2）

FH 10 μM（FH组浓度3）

FH 50 μM（FH组浓度4）

1.2实验方法及流程：

（1）CCK8测定：将细胞按5 x 10³个/孔接种到96孔板中，每孔100 µL培养基，设置空白孔。添加浓度梯度的FH，继续培养24 h和48 h。在培养结束后，每孔加入10 µL的CCK-8溶液（1:10比例与培养基混合）。将96孔板放回培养箱，在37 °C、5% CO₂条件下避光孵育2-3h。孵育结束后，用酶标仪在450 nm波长处读取各孔的吸光度（OD值）。

1.3实验结果：

图10AB显示FH结合于UBR5酶活中心或其周围，且可以显著抑制黑素细胞系的增殖，且具有浓度依赖性及时间依赖性。

2、Western blot鉴定黑素合成相关蛋白MITF、TYRP1、TYRP2、TYR蛋白表达的变化。

2.1组别设置：

Control（对照组）

FH 0.1 μM 24h（FH干预组1）

FH 0.1 μM 48h（FH干预组2）

2.2实验方法及流程：

（1）Western Blot：用RIPA裂解液（碧云天）提取蛋白，并在4 ℃以12000 rpm离心10 min。通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度，实验前煮沸5 min。每孔上样20 μg蛋白质样品，用10％SDS PAGE分离，转移到PVDF膜。 5％BSA封闭2 h后，将膜在4 ℃下与一抗(TYR、TYRP1、TYRP1、MiTF、UBR5)孵育过夜。用PBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与有HRP标记的山羊抗兔IgG或抗小鼠IgG二抗孵育 60 min，通过ECL化学发光法检测结合的抗体。（具体方法同实施例1）

2.3实验结果：

由图11A所示经FH处理B16F10细胞后，Western blot结果显示相较于对照组，干预组黑素合成相关蛋白MITF、TYRP1、TYRP2、TYR蛋白表达有显著下调。

3、FH对黑素细胞系黑素含量及酪氨酸酶活性影响的测定。

3.1组别设置：

Control （对照组）

FH 0.1 μM 24h（FH干预组1）

FH 0.1 μM 48h（FH干预组2）

3.2实验方法及流程：

（1）黑素含量测定：将黑素细胞系(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解 ,使用酶标仪在470nm处测量吸光度。

（2）酪氨酸酶活性测定：将黑素细胞系(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，200 μL 1%tritonX100裂解细胞，立即放入-80 ℃30 min后取出，置于37℃条件下解冻，1000g离心10 min，取上清与L-DOPA置于37℃孵育20 min后用酶标仪检测其475 nm处吸光度。

3.3实验结果：

图11BC示FH可显著抑制B16F10细胞的黑色素含量及酪氨酸酶活性。

4、FH在斑马鱼模型黑素生成调控作用中的体内研究。

4.1组别设置：

Control（对照组）

FH（FH干预组）

4.2实验方法及流程

斑马鱼黑素检测：随机选取6 hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼胚胎。水溶给予FH，同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。28 ℃处理2天后，每个实验组随机选取5尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用Image J高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度，以该指标的统计学分析结果评价样品美白功效。统计学处理结果采用mean±SEM表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析。

4.3实验结果：由图12示FH可显著抑制斑马鱼胚胎的黑素生成能力。

5、FH的结构类似物对黑素细胞系的黑素含量及酪氨酸酶活性影响的测定。

5.1组别设置：

Control（对照组）

F1（voruciclib组）

F2（荭草苷组）

F3（牡荆素组）

5.2实验方法及流程

（1）细胞干预：分别用10 μM的voruciclib、荭草苷及牡荆素处理B16F10细胞系，24h后胰酶消化细胞用于下一步实验。

（1）黑素含量测定：将B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，1 ml 1mol/L NaOH 100 ℃水浴加热30 min使细胞溶解 ,使用酶标仪在470 nm处测量吸光度。

（2）酪氨酸酶活性测定：将B16F10细胞(2.5×10⁵个细胞每35 mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，200 μl 1%tritonX100裂解细胞，立即放入-80 ℃30 min后取出，置于37 ℃条件下解冻，1000g离心10 min，取上清与L-DOPA置于37 ℃孵育20 min后用酶标仪检测其475 nm处吸光度。

5.3实验结果：

图13AB示FH的结构类似物中voruciclib可以显著上调小鼠B16F10中色素的含量及酪氨酸酶活性，图13C提示voruciclib与UBR5存在相互作用。

Claims (9)

1.夫拉平度及其类似物在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征是，所述夫拉平度的类似物包括voruciclib、荭草苷或牡荆素。

3.根据权利要求1或2的应用，其特征是，所述色素性皮肤病包括色素增加性皮肤病和色素减少性皮肤病。

4.根据权利要求1或2的应用，其特征是，所述色素性皮肤病包括色素痣、色素斑、色素脱失/减退斑。

5.根据权利要求4的应用，其特征是，所述色素性皮肤病包括色素痣、先天性色素痣以及有恶变风险的巨痣、黄褐斑、雀斑、太田痣、炎症后色素沉着、白癜风、炎症后色素减退。

6.夫拉平度及其类似物在制备调控黑素生成的抑制剂或活化剂中的应用。

7.夫拉平度及其类似物在制备酪氨酸酶活性抑制剂或增强剂中的应用。

8.夫拉平度及其类似物在制备美白制剂或者美白药物中的应用。

9.根据权利要求6-8中任意一项所述应用，其特征是，夫拉平度的类似物包括voruciclib、荭草苷或牡荆素。