CN119816594A

CN119816594A - 缀合油酸的寡核苷酸及其用途

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Publication number: CN119816594A
Application number: CN202380056273.5A
Authority: CN
Inventors: 鲁本·阿泰罗·阿勒普兹; 内蕾娅·莫雷诺·塞尔韦拉; 艾琳·冈萨雷斯·马丁内斯; 埃斯特法尼亚·塞罗·埃雷罗斯; 埃里克·G·马库森; 玛丽亚·比阿特丽斯·拉穆西·特罗伊西
Original assignee: Aitex Biotechnology Co ltd; Universitat de Valencia
Current assignee: Aitex Biotechnology Co ltd; Universitat de Valencia
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2023-05-23
Publication date: 2025-04-11
Also published as: WO2023227622A1; JP7663873B2; US12116575B2; AU2023277730A1; EP4486891A1; TW202411424A; JP2023172954A; EP4282964A1; EP4282966A1; IL317141A; CA3255781A1; US20230407305A1; JP2025522282A

Abstract

本发明提供了寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子，它们是微小RNA的拮抗剂、优选是人类微小RNA hsa‑miR‑23b‑3p和hsa‑miR‑218‑5p的拮抗剂，它们包含硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合物，并且它们与至少一个油酸分子缀合。抑制这些微小RNA可以提高相应蛋白质MBNL1和/或MBNL2的内源性水平。本发明还提供了包含所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的组合物以及其用于治疗和预防有此需要的对象的糖尿病的用途。

Description

缀合油酸的寡核苷酸及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域。更具体地，本发明涉及缀合油酸的内源性微小RNA(特别是hsa-miR-218-5p和hsa-miR-23b-3p)的寡核苷酸拮抗剂、及其用途。

背景技术

1型强直性肌营养不良(DM1)是一种罕见的遗传性疾病，目前尚无有效的治疗方法。DM1与严重疾病负担有关，导致患者的许多不同系统和组织受损。肌肉无力和疲劳是两种最常见的疾病表现，报道分别有93％和90％的患者出现这两种症状，其次是肌肉僵硬(73％)。其他表型包括心脏功能障碍、白内障、胰岛素抵抗和认知障碍。DM1疾病是基于在DM1蛋白激酶(DMPK)基因中发生CTG重复扩增，这些扩增会转录成致病性mRNA。目前已明确，CUG扩增与肌盲样蛋白家族(MBNL1、2和3)以高亲和力结合，从而抑制其正常功能，但其他改变可能导致MBNL1和MBNL2耗竭。在骨骼肌和大脑中，分别优先表达MBNL1和MBNL2，而MBNL3主要在胚胎发育和成人组织再生期间表达。

MBNL1和MBNL2蛋白控制几种转录物的选择性剪接和多聚腺苷酸化，具体方式是导致从胎儿模式转变为成人模式，并且MBNL1和MBNL2蛋白在剪接调节中对被发现在DM1中上调且错误定位的CUGBP Elav样家族成员1(CELF)蛋白起拮抗作用。此外，已证明MBNL1和MBNL2基因之间存在遗传冗余，由于仅删除一个基因会导致另一个基因上调并占据其在靶RNA中的结合位点(参见Lee 2013.Compound loss of muscleblind-like function inmyotonic dystrophy.EMBO Mol Med 5:1887-900)。已表明MBNL1蛋白功能的耗竭是疾病进程中的一个关键因素。事实上，MBNL1功能丧失可导致超过80％的错误剪接事件和接近70％的表达缺陷。在DM1小鼠和源自患者的成纤维细胞中，上调MBNL基因和/或MBNL蛋白具有良好的耐受性，可缓解多种症状例如肌强直以及错误剪接事件，并减少病灶形成，为开发旨在增加这些基因表达的治疗性途径开辟了道路。MBNL1和MBNL2耗竭还会影响其他几种基因表达过程，例如损害膜相关mRNA的运输或miRNA生物合成。

微小RNA(本文中也称为“miRNA”或“miR”)是一类小型非编码RNA，在调节基因表达、特别是基因沉默中起重要作用。在人类细胞中，通过荧光素酶报告基因测定，显示hsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p的表达可直接调节MBNL1和MBNL2转录物(Cerro-Herreros等人，2018Nat.Commun.9,2482)。在哺乳动物模型中hsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p的沉默增加肌盲样蛋白表达并且减轻强直性肌营养不良表型。另一方面，抗miR是一类寡核苷酸，可阻止其他分子(例如微小RNA)与RNA分子尤其是信使RNA(mRNA)上的靶位点结合。使用常规抗miR作为治疗分子在其作为候选药物的开发中存在局限性，包括由于在细胞环境中降解而导致的短寿命、从细胞外培养基中细胞的摄取较差、以及以化合物达到中位毒性与中位疗效的浓度比(TC50/EC50)表示的治疗窗口有限，所述比率越高效果越好。因此，需要进一步开发旨在提高抗miR的稳定性、效力、组织特异性摄取和治疗窗口等药理参数的方法，以充分发挥抗miR在抑制其靶标hsa-miR-218-5p和hsa-miR-23b-3p方面的潜力。

一方面，白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质之一，负责脂肪酸、药物、离子和其他代谢物的运输。寡核苷酸与脂肪酸的缀合可以增加寡核苷酸与白蛋白的结合亲和力，增强其穿过内皮屏障的能力，改善其在肌肉中的功能性摄取，从而提高寡核苷酸在体内的效力。然而，结构各异的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸种类繁多，反过来又会影响蛋白质结合或脂肪酸缀合物的活性，因此尚不清楚哪种脂肪酸最适合增强寡核苷酸的效力。

另一方面，寡核苷酸中可以加入其他化学修饰以增加其药理参数。在这些修饰中，硫代磷酸酯(PS)键作为第一代反义寡核苷酸持续显示出良好的效果，尽管它们存在一些重要的局限性，仍然阻碍着完全修饰(全PS)治疗性寡核苷酸的开发。这些局限性包括一些研究中报道的PS-寡核苷酸对小鼠、大鼠、猴子和人类具有毒性。在小鼠和大鼠中，这些副作用包括血小板减少、肝转氨酶升高、各种器官中网状内皮细胞增生和肾小管变化(UMSarmiento等人.In vivo toxicological effects of rel A antisensephosphorothioates in CD-1mice.Antisense Res Dev.1994Summer；4(2):99-107.doi:10.1089/ard.1994.4.99.PMID:7950306；S Agrawal等人.Mixed-backboneoligonucleotides as second generation antisense oligonucleotides:In vitro andin vivo studies.Proceedings of the National Academy of Sciences Mar 1997,94(6)2620-2625；DOI:10.1073/pnas.94.6.2620)。在猴子中观察到的副作用是补体激活(Agrawal,Sudhir等人.“Novel enzymatic and immunological responses tooligonucleotides.”Toxicology letters 82(1995):431-434)和激活部分凝血活酶时间(aPTT)延长。由于在施用葡聚糖硫酸酯后观察到类似的副作用，因此推断这些副作用是由PS-寡核苷酸的多阴离子性质引起的，并且不是核苷酸序列特异性的。因此，需要开发毒性降低但稳定性提高的寡核苷酸。

本发明通过提供改善的油酸缀合的抗miR克服了这些局限性。

附图说明

图1.对DM1细胞的毒性和疗效评估。用(A)MD23b-2、(B)5’-23b-油酸、(C)非缀合-23b或(D)218-D/LNA2以5种不同浓度(对于MD23b-2、5’-23b-油酸和非缀合-23b：10nM、50nM、200nM、1μM和5μM；对于218-D/LNA2：0.08nM、0.4nM、2nM、10nM和50nM)进行脂质转染后，对DM1肌管的毒性(细胞生长抑制百分比，黑色)和疗效(与模拟转染细胞相比，MBNL1表达增加百分比，灰色)的表示。虚线表示TC50和EC50水平。一式三份地测试每个浓度。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。Graphpad方程“钟形剂量反应”已用于拟合剂量反应曲线。

图2.注射指定处理后5天对HSA^LR小鼠进行功能疗效测定。单次注射(AI)3mg/Kg的不同抗miR后5天，分析(A)力/体重和(B)肌强直等级。通过非配对学生t检验分析A中的数据，并且与用PBS(PBS)处理的HSA^LR小鼠进行比较。p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。数据点表示单个小鼠值。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。

图3.肌肉组织中的miRNA水平。通过qRT-PCR在腓肠肌(gt)和股四头肌(qd)中量化了相对于U1和U6snRNA内源性对照的(A)miR-23b-3p和(B)miR-218-5p表达水平。HSA^LR小鼠在尾静脉接受静脉内注射PBS或不同抗miR，浓度均相同(3mg/Kg)。注射后5天处死小鼠，解剖肌肉并进行处理以提取RNA。使用学生t检验基于PBS处理的HSA^LR值进行所有统计学比较。p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。数据点表示单个小鼠值。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。

图4.经处理的HSA^LR小鼠的骨骼肌中Mbnl1和Mbnl2的表达。通过qRT-PCR定量腓肠肌(gt)和股四头肌(qd)上相对于Gapdh内源性对照的(A)Mbnl1转录水平和(B)Mbnl2转录水平；(C)使用定量点印迹法测定相对于内源性微管蛋白对照的Mbnl1蛋白水平。HSA^LR小鼠在尾静脉接受静脉内注射PBS或不同抗miR，浓度均相同(3mg/Kg)。注射后5天解剖腓肠肌和股四头肌，并且处理组织以分析RNA和蛋白质。使用学生t检验基于PBS处理的HSA^LR值进行所有统计学比较。p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。数据点表示单个小鼠值。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。

图5.抗miR改善了Mbnl依赖性转录物错误剪接。HSA^LR小鼠在尾静脉接受静脉内注射PBS或不同抗miR，浓度均相同(3mg/Kg)。注射后5天解剖腓肠肌和股四头肌，并且处理组织以提取RNA。(A)RT-PCR半定量分析腓肠肌(gt)和股四头肌(qd)中(A)Atp2a1外显子22、(B)Nfix外显子7、(C)Mbnl1外显子5和(D)Clcn1外显子7a的剪接。还包括健康对照小鼠(FVB)的外显子包含水平以供比较。使用学生t检验基于PBS处理的HSA^LR值进行所有统计学比较。p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。数据点表示单个小鼠值。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。

图6.图5中总结的用于定量腓肠肌和股四头肌中Atp2a1、Clcn1、Nfix和Mbnl1转录物的代表性琼脂糖凝胶。所示针对miR-23b-3p(A，B)和miR-218-5p(C，D)的寡核苷酸的处理效果。还示出野生型小鼠(FVB)和PBS处理的HSA^LR小鼠的剪接模式以供比较。

图7.蜘蛛图示出所示处理对HSA^LR小鼠中几种DM1相关分子或功能表型的效果。所表示的值为恢复指数(RI)，它们衡量了接受处理的HSA^LR小鼠的不同值与FVB对照参数的接近程度，FVB对照参数表示为1(实心黑线)。小图(A)总结了针对miR-23b-3p的抗miR的RI，而(B)关注针对miR-218-5p的抗miR的RI。关于更多表示细节，参见材料和方法部分中的“雷达图”。

图8.用于连接MD23b-2V2寡核苷酸和油酸的不同接头的化学结构。除了寡核苷酸成分外，整个所得分子的绘图使用ChemDraw软件生成。

图9.经使用图8中绘制的不同接头在3'端缀合油酸的寡核苷酸MD23b-2V2在指定浓度下处理，对DM1细胞中的MBNL1蛋白进行量化。

通过定量点印迹分析(QDB)量化蛋白质水平，并且基于内源性GAPDH归一化。仅用转染试剂处理的DM1细胞(DM1)产生的蛋白质水平被赋值为1，其余数据也参照此进行归一化。所示统计学比较都是使用学生t检验基于用转染试剂处理的DM1细胞进行。p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。误差线＝平均值的标准误差(SEM)。

图10.A)MD23b-2V2 3'Ol寡核苷酸的化学结构。完整分子的绘图由ChemDraw软件生成。B)MD23b-2-PS/PO 3'Ol寡核苷酸的化学结构。完整分子的绘图由ChemDraw软件生成。C)218MOE油酸3’寡核苷酸的化学结构。完整分子的绘图由ChemDraw软件生成。

图11.通过ELISA测定大脑、腓肠肌、股四头肌、肾脏和肝脏中的MD23b-2V2 3'Ol和MD23b-2V2(ng/g)。使用学生t检验对特定组织的MD23b-2V2 3'Ol和MD23b-2V2进行统计学比较。统计学显著性设置为p<0.05(**p<0.01,***p<0.001)。误差线＝SEM。

图12：MBNL1相对水平。第一阶段和第二阶段。通过蛋白质印迹法定量NHP大脑的蛋白提取物中的MBNL1水平。比较第一阶段(最后一次给药后两周)和第二阶段(最后一次给药后三周)的NHP大脑中的MBNL1蛋白水平。在蛋白质印迹法中，GAPDH水平用作内部标准，数据基于PBS处理的NHP(组2)中的MBNL1蛋白水平(其水平被赋值为1)归一化。数据为平均值±SEM。

发明内容

在一个方面，本发明涉及寡核苷酸分子、或两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，其中所述寡核苷酸分子的长度为10个至30个核苷酸，其中所述寡核苷酸分子包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。优选地，其中所述分子是微小RNA的拮抗剂，更优选地其中微小RNA是人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，其包含至少两个通过磷酸二酯键连接的核苷酸，其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子还包含由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)或SEQ ID NO:52-110中存在的区域的序列具有至少80％的同一性的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子还包含由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)中存在的区域的序列完全相同的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子包含至少一种化学修饰，其中化学修饰选自以下组：

i)2’-O-甲基(2’OMe)，

ii)2'-O-甲氧基乙基(2′MOE)，和/或

iii)连接2'氧和4'碳的额外桥(LNA)。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子还包含由与SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50或51(hsa-miR-23b的拮抗剂)或SEQ ID NO：7、8、9、14、25、26、27或28(hsa-miR-218-5p的拮抗剂)中存在的区域的序列具有至少80％的同一性的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

在一个实施方式中，根据第一方面的寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸序列由SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50或51(hsa-miR-23b的拮抗剂)或SEQ ID NO：7、8、9、14、25、26、27或28(hsa-miR-218-5p的拮抗剂)组成。

在另一方面，本发明涉及组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种第一方面或其任意实施方式所定义的寡核苷酸分子或者两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，本发明涉及第二方面或其任意实施方式中定义的组合物，其用于治疗的用途。

在另一方面，本发明涉及第二方面或其任意实施方式中定义的组合物，其用于靶向有此需要的对象的肌肉细胞的用途。

在另一方面，本发明涉及第二方面或其任意实施方式中定义的组合物，其用于预防或治疗肌肉疾病或者预防或治疗RNA病的用途。

优选地，所述疾病为强直性肌营养不良症，更优选地所述强直性肌营养不良症为1型强直性肌营养不良。

具体实施方式

一般定义

必须注意的是，除非上下文另有明确说明，否则本文中使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代。此外，除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为涉及所述系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验就确定本文所述发明的具体实施方式的许多等效物。本发明旨在涵盖此类等效物。

当涉及给定的量或数目时，术语“约”表示数值可以在其指定值的±20％范围内变化。优选地，“约”表示其值的±10％左右，更优选地“约”表示其值的±10％、±8％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％左右，或者甚至“约”表示其值的±1％左右，按此优先顺序。

如本文使用的，多个列举元素之间的连接词“和/或”应理解为涵盖单个选项和组合选项。例如，当两个元素由“和/或”连接时，第一个选项是指在没有第二个元素下第一个元素的适用性，第二个选项是指在没有第一个元素下第二个元素的适用性，第三个选项是指第一个元素和第二个元素在一起的适用性。这些选项中的任何一个都应理解为属于所述含义的范围，因此满足本文所用术语“和/或”的要求。多个选项的同时适用性也应理解为属于所述含义的范围，因此满足术语“和/或”的要求。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变体(例如“包括”和“含有”)应理解为暗示包含指定的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以替换为术语“含有”或“包括”，有时在本文中使用时可以替换为术语“具有”。在本发明的方面或实施方式的上下文中使用时，上述任何术语(包含、含有、包括、具有)都可以替换为术语“由……组成”，尽管不太优选。

本文使用的“由……组成”排除了权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。本文使用的“基本上由……组成”不排除不会对权利要求的基本特征和新颖特征产生重大影响的材料或步骤。

如本文使用的，涉及鼠基因的名称以斜体形式输入，大写字母后面均为小写字母。鼠蛋白质名称遵循与鼠基因符号相同的规则，但不以斜体形式显示。当提及人类基因或蛋白质时，始终使用大写字母，基因则以斜体形式显示。然而，技术人员将能够从说明书的技术背景中推断出生物分子(蛋白质、基因、转录物)和物种的确切性质。

本文提及的“寡核苷酸”是指任何短片段的DNA、RNA或DNA/RNA，包括天然和合成的核苷酸。如在本发明中使用的，术语“寡核苷酸分子”既包括寡核苷酸本身，也包括“寡核苷酸类似物”。“寡核苷酸类似物”是从寡核苷酸衍生的分子，在形成所述寡核苷酸的核苷酸单元中的至少一个中引入一些化学修饰，无论是在磷酸基团、戊糖还是一种含氮碱基中；还包括在5'端和/或3'端添加非核苷酸基团的修饰，以及磷酸二酰胺吗啉基寡聚体、肽核酸(PNA；一种DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被与核碱基连接的伪肽聚合物取代)等。进一步而言，为了本发明的目的以及如本文使用的，术语“寡核苷酸分子”和“寡核苷酸类似物”或“寡核苷酸类似物分子”还包括微小RNA海绵或微小RNA海绵，因为可以认为其主要成分是寡核苷酸的串联重复单元，其特征在于这些寡核苷酸中的每一个本身是或包含感兴趣的微小RNA的结合位点。为了清楚起见，提到的是，本文所公开的并以“SEQ ID NO”编号的寡核苷酸序列包括带有化学修饰和/或脂肪酸缀合(如果有的话)的核碱基序列。例如，SEQ ID NO：3是指带有LNA、硫代磷酸酯键和5-甲基-2'-O-甲基胞苷修饰等的核碱基序列“ATCCCTGGCAATGTGA”。因此，在本文中将所述序列表示为SEQ ID NO：3：AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCms-AbAmTbGbTmsGbsAb(NHC6)(油酸)。

本文中提及的“拮抗剂寡核苷酸”是指能够阻断或抑制分子(在本文中为微小RNA)的天然功能的寡核苷酸。因此，本发明的拮抗剂寡核苷酸是抑制与其结合的抗miR的激活、稳定性或功能的抑制剂分子。在本发明的上下文中，“拮抗剂”与“抑制剂”同义，因此可以互换使用。例如，“hsa-miR-23b-3p的拮抗剂寡核苷酸”是指抑制hsa-miR-23b-3p功能的寡核苷酸分子。

多核苷酸和多肽的“序列同一性百分比”是通过在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列来确定的，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸或多肽序列在比较窗口内的部分可以包含添加或缺失(即，空位)以实现两个序列的最佳对齐。所述百分比如下计算：确定两个序列中出现相同核碱基或氨基酸残基的位置数目以得出匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口内的位置总数，然后将结果乘以100以得出序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳对齐可以通过已知算法的计算机化实现方式(美国国家生物技术信息中心资源中的BLAST、欧洲生物信息学研究所资源中的CLUSTAL、威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GCG)，575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过检查来进行。需要注意的是，本文中使用的“同一性百分比”是在局部比对的上下文下确定的，即它基于核碱基序列之间局部相似区域的比对，这与旨在在序列的整个跨度上比对两个序列的全局比对相反。因此，在本发明的上下文中，同一性百分比优选地仅基于局部比对比较算法来计算。

通常，尤其是在抗miR的情况下，将化学修饰掺入相应的核苷酸单元中，这主要影响核糖部分和/或磷酸，这些修饰难以在通常的核苷酸序列表示中描述，在通常的核苷酸序列表示中，存在于给定位置的核苷酸通过属于其一部分的含氮碱基的缩写来识别。因此，在本发明中，比较了微小RNA拮抗剂的分子，其是指这些单元中存在的核苷酸或核苷酸类似物单元的含氮碱基或核碱基序列之间的同一性百分比，因为这表明两个分子或序列片段是否是从相同的原始基本核苷酸序列设计得到的，与每种情况下可能包含在核苷酸中的不同化学修饰无关。

如说明书中使用的，应理解的是，当其中一条核苷酸或核苷酸类似物序列(以5'-3'方向读出)是呈现含氮碱基与另一条核苷酸或核苷酸类似物序列(以3'-5'方向读出)的含氮碱基配对的核苷酸或核苷酸类似物序列时，这两条核苷酸分子链是100％互补。也就是说，序列5'-UAGC-3'与序列3'-AUCG-5'或3'-ATCG-5'互补，后者以5'-3'方向读出分别是序列5'-GCUA-3'和5'-GCTA-3'。在一个实施方式中，优选的是，拮抗剂分子在其序列中包含与要拮抗的微小RNA的种子区域的互补序列完全相同的片段，至少是在含氮碱基互补方面。

如本文中使用的，“抗miR(antimiR)”是指与作为抗miR的靶标的微小RNA(优选成熟微小RNA)互补的寡核苷酸、优选寡核糖核苷酸，它们以高亲和力结合并抑制微小RNA。因此，抗miR是指通常相对于仅由核苷酸单元组成的相应寡聚体经化学修饰的寡核苷酸，并且它们与靶微小RNA的互补并因而是靶微小RNA的抑制剂。在本发明的具体情况下，本文描述的抗miR优选至少部分地与人微小RNAhsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p互补。

如本文使用的，“微小RNA海绵”通常被设计为使其抑制具有互补的七聚体或八聚体片段(种子区域)的微小RNA，这样单个海绵结构就可以用于阻断具有相同基序的整个微小RNA家族，尽管它们也可以包含针对特定微小RNA的整个靶标序列或仅包含没有种子区域的miRNA特异性区域以使其具有特异性。

表述“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人类时不会产生任何不良、过敏或其他反应的分子实体和组合物。如本文中使用的，“药学上可接受的媒介”包括溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂、脂肪酸例如油酸以及用于配制药物(例如适合施用于人类的药物产品)的类似的可接受的药剂。

“预防(preventing/to prevent/prevention)包括但不限于减少、降低或改善症状、病症、病况或疾病的风险，以及保护动物免受症状、病症、病况或疾病的侵害。预防可以预防性地施加或施用。

“治疗”包括但不限于抑制、减缓、停止、减少、改善或逆转现有症状、临床体征、病症、病况或疾病的进展或严重程度。治疗可以治疗性地施加或施用。

本文中提及的“TC50”或“半最大抑制浓度”是指施用至测试生物体或测试细胞系的抑制剂在给定时间段内对50％的暴露生物体或细胞系的群体产生毒性作用时的浓度。

本文中提及的“EC50”或“半最大有效浓度”是指拮抗剂或抑制剂在给定时间段内获得介于基线和最大值之间的一半反应时所需的的浓度。也就是说，EC50是获得治疗所致效果的50％时所需的浓度。

在本文中提及的“Emax”是指由所施加或所给药的药剂(在本文中为拮抗剂分子)可实现的最大响应。Emax被测量为与模拟(转染有载体或未转染)相比，用特定抗miR-23b-3p或抗miR-218-5p转染后获得的靶蛋白(例如MBNL1蛋白)的最大倍数变化。

“T指数(Tindex)”或“治疗指数/比率”是药物相对安全性的定量量度。在本发明中，T指数定义为治疗剂引起50％毒性的量(TC50)与引起50％治疗效果的量(EC50)之间的比率乘以可实现的最大响应：

T指数＝(TC50/EC50)*Emax

如本文使用的，术语“3'端”是指在末端的糖环上第三个碳具有羟基的核苷酸链末端。如本文使用的，术语“5'端”是指在末端的糖环上第五个碳具有磷酸基团的核苷酸链末端。

详细描述

如上所述，需要开发改善的包含化学修饰的寡核苷酸，其毒性更小但治疗效果增强。因此，本发明涵盖两个主要目的。一方面，本发明的目的是评估与寡核苷酸缀合的最佳脂肪酸，并且设计具有为分子提供有益作用但对于体内给药毒性不大的最大允许量的PS键的寡核苷酸。另一方面，本发明还提供特定的微小RNA抑制剂，特别是寡核苷酸分子或其类似物，旨在纠正MBNL(肌盲样)蛋白的功能不足，其部分源自患有强直性肌营养不良症(DM)、优选1型强直性肌营养不良(DM1)的患者中hsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p的过度表达。

首先，发明人体外测试了先前发表的miR-23b和miR-218拮抗剂寡核苷酸(Cerro-Herreros等人，2018Nat.Commun.9,2482)与不同疏水性部分(包括脂质和脂肪酸)缀合在毒性、疗效(MBNL1蛋白水平)和治疗指数(T指数)方面的效果(表1)。本研究中使用的miR拮抗剂序列全部包含2'OME修饰的核苷酸以及硫代磷酸酯(PS)键和磷酸二酯(PO)键的混合物。令人惊讶的是，发现对于miR-23b和miR-218拮抗剂寡核苷酸，与油酸缀合都产生了非常重要的T指数改善。

接下来，发明人测试了油酸作为载体的能力。图11和实施例9所示的实验表明，油酸是将寡核苷酸递送至例如肌肉和中枢神经系统(CNS)等组织的极好的载体或媒介。此外，图12和13以及实施例10表明，油酸对寡核苷酸分子的媒介化不仅发生在具有DM1表型的动物模型中，也发生在健康动物(在本文中为猴子)中。这些结果为油酸与寡核苷酸分子缀合时作为载体的治疗性用途开辟了道路，特别是在影响肌肉和/或CNS(它们是油酸增强寡核苷酸递送的两个主要组织)的疾病的情况下。

DM1是一种影响肌肉组织和中枢神经系统的神经肌肉疾病。因此，发明人在长度介于15个至22个核苷酸之间的抗miR池(包括携带不同化学修饰例如LNA、2'OME和2'MOE的核苷酸)中筛选在DM1细胞中具有最好T指数的抗miR序列。本研究中，针对人hsa-miR-23b-3p的最佳表现拮抗剂是MD23b-2；对于人hsa-miR-218-5p拮抗剂，最佳T指数的寡核苷酸是218-D/LNA2(参见表2和表3，图1)。将这两种分子的每一种的修饰版本与油酸结合，并且在DM1鼠模型(HSA^LR小鼠)和DM1细胞(仅针对MD23-b2的修饰版本)中测试所得分子。这些测试结果揭示，油酸缀合至包含PS/PO混合物的寡核苷酸提高了所述寡核苷酸的治疗性效果(参见表4、表5和表6)。总体而言，本研究得到的结果使申请人得出结论：与寡核苷酸分子缀合以提高DM1细胞和小鼠疾病模型中MBNL1水平的最佳脂肪酸是油酸，并且当分子中存在PS键/PO键混合物时，这种缀合提高了寡核苷酸的治疗指数。

鉴于这些结果，在第一方面，本发明涉及寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子、或两种或更多种所述分子的混合物，其中寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子在所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。优选地，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物是微小RNA的拮抗剂。优选地，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物是选自人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p的微小RNA的拮抗剂。

微小RNAhsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p是MBNL基因表达以及其他基因转录物的抑制因子，因此它们的抑制能力会因其拮抗剂的存在而减弱。在本发明的上下文中，抑制剂、沉默剂或阻断剂是能够降低所述hsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p的内源性活性的化合物，因此这三个术语被归入“拮抗剂”的范畴。虽然严格来说，术语“沉默”可以解释为这种活性的绝对消除，然而抑制活性的这种消除或非绝对降低之间的差异可以取决于所用化合物的浓度，只要化合物引起微小RNA的抑制活性降低，所述化合物就足以被视为抑制剂、沉默剂、阻断剂或简言之其拮抗剂。此外，考虑到通过靶向成熟微小RNA、前体微小RNA(pre-微小RNA或前体miRNA)或初级微小RNA(pri-微小RNA或初级miRNA)来抑制微小RNA功能的可能性，如果化合物靶向成熟微小RNA，或者如果所述化合物靶向前体微小RNA或初级微小RNA转录物，只要它能够降低所述微小RNA的内源性活性，那么它就可被视为本发明的微小RNA抑制剂、沉默剂、阻断剂或拮抗剂。因此，如本文使用的，这四个术语(抑制剂、沉默剂、阻断剂或拮抗剂)在说明书中作为同义词使用。

关于本发明拮抗剂的核苷酸序列，重要的是应该注意，它们应该与必须结合的内源性分子具有足够的互补性。所述内源性分子优选为微小RNA分子，更优选为hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p分子。人hsa-miR-218-5p和hsa-miR-23b-3p在核苷酸序列上有差异，在设计拮抗剂序列及其微小RNA结合位点时必须考虑到这一点。“微小RNA结合位点”是拮抗剂中包含的与其靶微小RNA的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列。优选地，本文定义的拮抗剂的微小RNA结合位点与hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p的至少一部分互补或部分互补。结合位点的序列可以是完全匹配的，这意味着它与微小RNA具有完全互补性。可替换地，所述序列可以是部分互补的，这意味着当微小RNA与拮抗剂的结合位点碱基配对时，可能发生一个或多个错配。重要的是，如果拮抗剂与靶微小RNA(优选hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p)部分互补，则其结合位点优选与靶微小RNA(优选hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p)的种子区域具有完全或近乎完全的互补性(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或优选100％互补)。微小RNA的“种子区域”通常包含从微小RNA的5’端的第2个核苷酸到第7个核苷酸，或由从微小RNA的5’端的第2个核苷酸到第7个核苷酸组成。

因此，在设计本发明的抗miR时，可以考虑靶微小RNA的成熟版本的序列及其种子区域。下面示出了它们成熟版本的序列以及它们在miRbase数据库(www.mirbase.org)中的访问码(Mimat)，其中的每一个的种子区域以粗体表示：

Hsa(智人)-miR-218-5p(MIMAT0000275):5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’(SEQ IDNO：10)；种子区域:UGUGCU(SEQ ID NO：12)；

hsa-miR-23b-3p(MIMAT0000418):5’-AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC-3’(SEQ ID NO：11)；种子区域:UCACAU(SEQ ID NO：13)。

在一个实施方式中，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子是被称为抗miR和微小RNA海绵的类型的抑制剂、阻断剂或拮抗剂。优选地，根据第一方面或其任意实施方式，寡核苷酸和/或其类似物是抗miR，更优选地是hsa-miR-218-5p或hsa-miR-23b-3p的抗miR。

在一个实施方式中，寡核苷酸和/或其类似物的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸。在一个实施方式中，寡核苷酸和/或其类似物的长度为10个至50个核苷酸，更优选为10个至30个或15个至25个核苷酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物是抗miR，其序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQID NO：10(hsa-miR-218-5p)或SEQ ID NO：11(hsa-miR-23b-3p)中存在的区域的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段。更优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的序列与SEQ ID NO：10(hsa-miR-218-5p)或SEQ IDNO：11(hsa-miR-23b-3p)的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％、或100％的同一性。

在一个实施方式中，拮抗剂是抗miR，其序列包含由一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成的片段，其中所述核苷酸或核苷酸类似物单元的含氮碱基的序列与SEQ ID NO：13所示的hsa-miR-23b-3p的种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。优选地，所述抗miR包含由与SEQID NO：13所示的种子区域100％互补的一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成的片段。在一个实施方式中，拮抗剂是抗miR，其序列包括第一片段和第二片段，其中第一片段由一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成，其中所述第一片段的含氮碱基的序列与如SEQ ID NO：13所示的hsa-miR-23b-3p的种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且其中第二片段与第一片段相邻(即，其位于第一片段的上游和/或下游)，并且第二片段由与SEQ ID NO：11中存在的区域的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成。本文中提及的“相邻”是指紧邻第一片段，即第一片段与第二片段之间没有任何核苷酸。在一些替代性实施方式中，第二片段位于距离第一片段上游和/或下游6、7、8、9、10或11个核苷酸处。更优选地，第二片段位于距离第一片段上游和/或下游1、2、3、4或5个核苷酸处。

在一个实施方式中，拮抗剂是抗miR，其序列包含由一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成的片段，其中所述核苷酸或核苷酸类似物单元的含氮碱基的序列与SEQ ID NO：12所示的hsa-miR-218-5p的种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。优选地，所述抗miR包含由与SEQID NO：12所示的种子区域100％互补的一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成的片段。在一个实施方式中，拮抗剂是抗miR，其序列包括第一片段和第二片段，其中第一片段由一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成，其中所述第一片段的含氮碱基的序列与如SEQ ID NO：12所示的hsa-miR-218-5p的种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且其中第二片段与第一片段相邻(即，其位于第一片段的上游和/或下游)，并且第二片段由与SEQ ID NO：10中存在的区域的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成。本文中提及的“相邻”是指紧跟第一片段，即第一片段与第二片段之间没有任何核苷酸。在一些替代性实施方式中，第二片段位于距离第一片段上游和/或下游6、7、8、9、10或11个核苷酸处。更优选地，第二片段位于距离第一片段上游和/或下游1、2、3、4或5个核苷酸处。

可用于本发明目的并且包含在本发明范围内的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的概念还包括作用于初级微小RNA或前体微小RNA的那些微小RNA抑制剂、阻断剂或拮抗剂，它们通常改变微小RNA的生物合成并对微小RNA活性产生负面影响，主要是由于可利用的活性微小RNA减少。在动物细胞中，未成熟的初级miRNA由细胞核中的微处理器复合物加工成前体miRNA，然后所述前体miRNA被运送到细胞质中经进一步加工成为成熟miRNA。因此必须理解，靶向hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p的初级微小RNA和/或前体微小RNA并改变它们的生物合成，从而降低所述微小RNA的水平，也应该能够使其活性降低。因此，为了本发明的目的，hsa-miR-23b-3p拮抗剂或hsa-miR-218-5p拮抗剂必须理解为不仅包括能够作用于成熟形式的分子，还包括能够作用于初级微小RNA或前体微小RNA并降低hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p成熟形式水平的那些分子。为了设计它们，必须将以下考虑在内：

-hsa-miR-23b-3p的初级微小RNA(pri-微小RNA)是基因AOPEP(ENSG00000148120；chr9:97488983-97849441)的转录物。

-hsa-miR-23b-3p的微小RNA前体(pre-微小RNA)对应于基因组位置hg19 chr9:97847490-97847586[+]并且对应于序列：CUCAGGUGCUCUGGCUGCUUGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUUGUGACUUAAGAU UAAAAUCACAUUGCCAGGGAUUACCACGCAACCACGACCUUGGC(SEQ ID NO：19)。由于所述序列比hsa-miR-23b-3p更长，因此使得设计特异性针对pre-微小RNA的拮抗剂成为可能。

-hsa-miR-218-5p具有两个编码其的基因组位置以及两个pre-微小RNA前体，Pre-hsa-mir-218-1(chr4:20529898-20530007)：GUGAUAAUGUAGCGAGAUUUUCUGUUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGUUGC GAGGUAUGAGUAAAACAUGGUUCCGUCAAGCACCAUGGAACGUCACGCAGCUUUCUACA(SEQID NO：20)，和Pre-mir-218-2(chr5:1681951SI-168195260)：GACCAGUCGCUGCGGGGCUUUCCUUUGUGC UUGAUCUAACCAUGUGGUGGAACGAUGGAAACGGAACAUGGUUCUGUCAAGCACCGCGGAAAGC ACCGUGCUCUCCUGCA(SEQ ID NO：21)。这两种前体均可用于拮抗剂的设计。

-Pre-hsa-mir-218-1源自位于基因SLIT2转录物内部的分子内发夹结构(ENSG00000145147：chr4:20254883-20621284)，而hsa-miR-218-5p-2源自基因SLIT3(ENSG00000184347，chr5:168088745-168728133，针对hsa-miR-218-5p-2)，它们可以分别视为其初级miRNA。没有其他成熟微小RNA是同一簇的一部分。因而，在hsa-miR-218-5p的情况下，可以将前体miRNA或初级miRNA设想为拮抗剂的靶标以降低成熟miRNA并且增加MBNL蛋白水平。

如下文的实施例中所示，特别是表1和表4所示，本申请的发明人开发并优化了多种针对hsa-miR-23b-3p和hsa-miR-218-5p的抗miR，随着添加油酸其T指数大幅提高。其中，特别提及包含SEQ ID NO：1(人hsa-miR-218-5p的拮抗剂)和SEQ ID NO：2(人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂)的抗miR的特定序列，因为它们在DM1细胞中具有最佳的特性和效率，如实施例部分所示。

此外，本文还考虑了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的功能等效物，其中特定核碱基的特定变化不会显著破坏分子的稳定性，因此其治疗效果将得以维持。所述功能等效序列示于SEQ ID NO：52-79(SEQ ID NO：2的抗miR-23b-3p的功能等效物)和SEQ ID NO：80-110(SEQ ID NO：1的抗miR-218-5p的功能等效物)。本文中提及的“功能等效物”是指其核碱基序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核碱基序列不同但执行相同功能并提供与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2相同的效用或技术效果的其他寡核苷酸。

因此，在一个实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：1(TTAGATCAAGCACAA)或SEQ ID NO：80-110中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：80-110中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％、或100％的同一性。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：2(ATCCCTGGCAATGTGA)或SEQ ID NO：52-79中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：52-79中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％、或100％的同一性。

值得注意的是，在根据本发明的寡核苷酸分子和/或其类似物中，寡核苷酸分子和/或类似物的全长内的每个尿嘧啶和胸腺嘧啶碱基、优选地种子区域中的每个尿嘧啶和胸腺嘧啶碱基可以分别被胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基任选地替换。这适用于本文公开的所有寡核苷酸中包含的所有“T”核碱基，但SEQ ID NO：52-110除外，在其中的某些位置，优选的是“U”而不是“T”。因此，在所述的这些位置，包括U，而不是T。

同样，寡核苷酸分子和/或类似物的全长内的每个鸟苷碱基、优选种子区域内的每个鸟苷碱基，可以分别被次黄嘌呤碱基任选地替换。这适用于本文公开的所有寡核苷酸。

在一个实施方式中，作为人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p的拮抗剂的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物能够提高MBNL蛋白、优选MBNL1和/或MBNL2蛋白的内源性水平。优选地，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)或SEQ ID NO：52-110中存在的区域的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，并且能够提高MBNL蛋白、优选MBNL1和/或MBNL2蛋白的内源性水平。优选地，与未处理的细胞或未处理的组织相比，MBNL蛋白内源性水平的增加是统计学上显著增加，其中优选地使用学生t检验进行统计学比较，参见例如图4。最优选地，MBNL蛋白内源性水平增加、优选统计学上显著增加是，相对于未处理的肌肉组织细胞，其在经处理的肌肉组织细胞(更优选地是股四头肌和腓肠肌)中至少1.2倍、1.3倍、1.4倍或1.5倍的变化。优选地，经处理的细胞或组织中MBNL蛋白内源性水平增加是，与未处理的细胞或组织相比，其增加至少15％、20％、30％、40％、50％或更多。本文中提及的“未处理的细胞或组织”是指这样的一种或多种细胞或组织，包括全部动物例如小鼠，它们是健康的或呈现DM1表型，并且还未使用第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物处理。优选地，未处理的细胞是肌肉细胞，并且未处理的组织是肌肉组织。

本发明的抗miR，包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中定义的抗miR，可以被进一步优化以提高其体内稳定性和疗效。为此，已描述了其化学结构的几种修饰(有关综述，参见Mckenzie等人，Recent progress in non-native nucleic acidmodifications.Chem.Soc.Rev.,2021,50,5126-5164)。这些修饰可以在戊糖中(在寡核苷酸为寡核糖核苷酸的优选实施方式中，修饰将在核糖中进行)、核苷酸间连键中、或核碱基中或其组合中进行。当本发明的寡核苷酸或寡核糖核苷酸经受化学修饰时，它们在本发明的上下文中分别被称为寡核苷酸类似物或寡核糖核苷酸类似物。在一个实施方式中，抗miR是寡核苷酸类似物，其在整个分子上包含至少六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或十六个化学修饰。在一个实施方式中，抗miR是其所有核苷酸均经过化学修饰的寡核糖核苷酸类似物。

核苷酸间连键的修饰：在产生本发明的寡核苷酸类似物的可能修饰中，考虑包括产生硫代磷酸酯键的修饰，这些修饰影响作为多核苷酸链“骨架”一部分的磷酸基团，导致引入硫原子来取代不作为核苷酸之间桥梁的磷酸基团的氧原子；这些修饰使核苷酸之间的键除了具有其他所需的药理学特性外，还能够抵抗核酸酶的降解，因此它们通常插入在寡核苷酸5’端或3’端的最后3个至5个核苷酸之间以抑制核酸外切酶的降解，从而增加其稳定性。

在优选的实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或超过十五个通过硫代磷酸酯键化学连接。优选地，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物的长度为10个至30个核苷酸，并且其包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸，其中所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。在甚至更优选的实施方式中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子包含PS键和磷酸二酯(PO)键的混合物，其中所述分子中的至少两个核苷酸通过硫代磷酸酯键化学连接，并且所述分子中的至少两个核苷酸通过磷酸二酯键连接。在进一步优选的实施方式中，通过硫代磷酸酯(PS)键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。在一个实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物的长度在13个至17个核苷酸之间，并且包含至少7、8、9或10个通过硫代磷酸酯(PS)键化学连接的核苷酸。在一个实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物中的PS:PO比率为1.2:1、1.5:1、1.7:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.7:1、3:1。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中的PS:PO比率在1.2:1和2.7:1之间，更优选地为1.5:1或2.5:1。本文中提及的“PS:PO比率”是指每个PO键对应的PS键数。例如，当寡核苷酸分子由15个核苷酸组成并且具有10个PS键和4个PO键(参见例如SEQ ID NO：7)时，则称所述分子具有2.5:1的PS:PO比率。在一个实施方式中，核苷酸之间的键中超过50％、55％，优选60％、70％或75％是PS键。

在一个实施方式中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子中包含的所有核苷酸通过硫代磷酸酯键化学连接。如上所述，优选地，寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子是微小RNA的拮抗剂(即抗miR)。

戊糖、优选核糖中的修饰：最广泛使用的糖修饰是位于2'位置的OH基团中的修饰。其中，在本发明的上下文中最重要的是2'氟化修饰(2'F：在核糖的2'位置引入氟原子)、2'-O-甲氧基乙基(MOE)修饰或2'O-甲基(OMe)修饰。因此，在一个实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子、优选抗miR经过化学修饰以包含具有以下一种修饰的至少一个戊糖：2'氟化(2'F：在核糖的2'位置引入氟原子)、2'-O-甲氧基乙基(MOE)和/或2'O-甲基(OMe)。在一个实施方式中，寡核苷酸分子中的所有核苷酸都是2'OME修饰的核苷酸。

可以在本发明的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子(优选抗miR)中进行的另一种修饰是形成双环2’-4’修饰。存在多种核糖衍生物，通过利用2’氧和4’位置之间的桥形成双环结构来将碳水化合物环锁定为3’-内构象。在一个实施方式中，在2’氧和4’碳之间形成桥来将核糖锁定为3’内构象，从而产生一种称为锁核酸(或LNA)的修饰。引入LNA修饰大大提高了抗miR-靶miRNA杂交体的稳定性，使其热力学稳定性显著提高，并且更加耐降解，当所述修饰位于分子末端时尤其如此。在一个实施方式中，从3’区开始的第一个核苷酸包含LNA修饰。在另一个实施方式中，从5'区开始的前两个寡核苷酸中的每一个都包含LNA修饰。双环核苷酸的更多修饰包括桥接核酸、乙基桥接(ENA)核酸、约束乙基(cEt)核酸、双环(双环DNA)和三环(三环DNA)结构以及构象限制性核苷酸(CRN)，它们对靶序列具有不同的亲和力。

较多修饰包括所谓的PMO(其中核糖已被吗啉基取代的核酸)。“吗啉基”是指通过磷酸二酰胺基团键合连接到亚甲基吗啉环骨架上的碱基。另一种骨架修饰是所谓的PNA(“肽核酸”：其中核糖-磷酸基团被氨基酸部分取代的肽核酸，因此核苷酸类似物的骨架是通过肽键键合的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元的结构)。

在一个实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子、优选抗miR经过化学修饰以包含形成抗miR的核苷酸中的至少一个戊糖，所述抗miR包括吗啉基核酸(PMO)或肽核酸(PNA)。

核碱基的修饰：由于使用频率较高，产生本发明的寡核苷酸(优选寡核糖核苷酸类似物，优选抗miR)的化学修饰还包括含氮碱基胞嘧啶(C)的5甲基化，这种修饰降低了免疫系统对寡核苷酸类似物的检测。因此，在一个实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子(优选抗miR)中包含的核苷酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个或超过五个包含甲基化胞嘧啶。在优选的实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子(优选抗miR)中的所有胞嘧啶都是甲基化的。

另一种可能的修饰是2,6二氨基嘌呤，其能够与胸苷或尿苷形成具有额外H键的碱基对(3个H键，而不是天然A:T碱基对中的2个H键)。因此，在一个实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个或超过五个包含2,6二氨基嘌呤。

从“寡核苷酸分子”和“寡核苷酸类似物”的定义可推断出，寡核苷酸类似物的定义还包括其中的某些单元存在修饰而其他单元不存在修饰的杂交分子，以及核酸和肽的类似物之间的杂交分子，或者甚至是其中某些核苷酸单元是核苷酸(或其类似物)而其他核苷酸单元是脱氧核苷酸(其中糖是脱氧核糖的核苷酸)的杂交分子，以及后者的类似物，即RNA-DNA杂交分子及其类似物。其他化学修饰也是可能的并是已知的，它们也包括在产生寡核苷酸类似物的可能修饰中。

对于寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子中可能包含的化学修饰，所述术语尤其适用于对于分子生物学领域技术人员来说在基础研究方面以及特别是在寻找这些分子的治疗性应用方面已知的一种或多种常见修饰的情况。有关此类修饰的信息可在一般常识中找到。

用其他非核苷酸分子对寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子进行修饰

如上所述，本发明的第一方面提供了寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子，其优选为抗miR，更优选为人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p的拮抗剂、或两种或更多种所述分子的混合物，其中所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子在所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。因此，本发明包括的所有寡核苷酸均在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。

在一些实施方式中，其他非核苷酸分子(例如有机化合物)也可以与寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的3’端和/或5’端缀合。所述缀合可以是直接缀合或通过间隔分子缀合。本文中提及的“间隔分子”是指连接寡核苷酸或寡核苷酸类似物和非核苷酸分子(优选油酸)的任何分子。间隔分子可偶联在寡核苷酸或寡核苷酸类似物的3'端或5'端处。优选地，间隔分子与所述寡核苷酸共价结合。优选地，一个或多个间隔分子的一端通过间隔分子上的末端碳与寡核苷酸3’端磷酸酯中的氧基团之间的键结合，另一端通过接头上的末端氮基团与油酸的羧基之间形成酰胺键的键结合，例如图8所示。

在优选的实施方式中，间隔分子选自由3-氨基丙基(NHC3)、5-氨基戊基(NHC5)、6-氨基己基(NHC6)、苏氨醇或其衍生物组成的组。在其他实施方式中，一个或多个间隔分子可以包括硫醇修饰剂C6SS(C6SSC6)。在进一步的实施方式中，间隔分子可以包括直接与寡核苷酸结合的硫醇修饰剂C6SS(C6SSC6)，随后是3-氨基丙基(NHC3)、6-氨基己基(NHC6)、苏氨醇或其衍生物(参见图8)。

在一些实施方式中，寡核苷酸可以作为前药提供，并且可以包含间隔分子，所述间隔分子包含自毁基团或由自毁基团组成。本文中“自毁(self-immolative)”基团是指将自发且不可逆地从与其缀合的分子(在本文中为寡核苷酸)上分离的分子。在一个实施方式中，自毁基团是二硫键，其将在细胞内被天然存在的硫醇(例如谷胱甘肽)还原，导致寡核苷酸的释放。

间隔分子可以是脂肪族线性或支化的烃链、环己基苯基和其他芳香族间隔分子，以及基于一个或多个乙二醇、甘油、氨基酸、肽或碳水化合物单元的极性间隔分子。在某些情况下，油烯基衍生物可以通过酰胺键与氨基共价连接，或通过胺键直接与核碱基连接，也可以与磷酸键连接而作为油烯基磷酸酯。

优选地，油酸与寡核苷酸的3'端缀合。更优选地，油酸通过间隔分子(优选NHC6、苏氨醇或NHC3，如图8所示)进行缀合。注意的是，添加间隔分子作为寡核苷酸和油酸之间的连接物不是强制性的，参见例如SEQ ID NO：51，在其中油酸通过直接缀合与寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的5'端缀合。

优选地，本发明公开的所有寡核苷酸分子在其3'端和/或5'端均与至少一个油酸分子缀合，其中所述寡核苷酸分子还包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸。优选地，所述寡核苷酸分子还包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸，并且所述分子中的至少两个核苷酸通过磷酸二酯键连接。更优选地，通过硫代磷酸酯(PS)键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯(PO)键化学连接的核苷酸数目。

可以使用本领域已知的不同方法来制备本发明的寡核苷酸。具体而言，寡核苷酸可以通过固相法或液相法合成。可以使用固相寡核苷酸合成方案来制备用间隔分子功能化的寡核苷酸以及油烯基-寡核苷酸缀合物。在这种方法中，固体载体例如孔径可控的玻璃(CPG)用寡核苷酸序列3'端的第一个核苷酸功能化，并且寡核苷酸通常以3'到5'方向合成。在5'位置引入间隔分子是通过使用间隔分子的亚磷酰胺衍生物进行的，亚磷酰胺衍生物将通过磷酸键将间隔分子引入寡核苷酸的5'位置。在3'位置引入间隔分子需要制备用连接分子功能化的固体载体，该连接分子是用于将核苷酸结合到载体上的分子。连接分子的例子是不稳定的化合物，例如邻苯二甲酰亚胺接头或琥珀酰接头。值得注意的是，虽然间隔分子与寡核苷酸分子缀合并保持缀合状态，但是接头是一种暂时性缀合，目的是在使用固相法合成寡核苷酸时固定寡核苷酸。在液相制备方法中，可以使用保护基团(例如苯甲酰基或乙酰基)来代替固相法中定义的接头类型。

在本发明的上下文中公开的所有寡核苷酸中，以下实施方式(包括修饰和修饰的组合)被认为是优选的：

在一个实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的长度为10个至30个核苷酸，并且其是抗miR型寡核苷酸类似物，其中所述分子中的至少两个核苷酸通过硫代磷酸酯键化学连接，并且所述分子中的至少两个核苷酸通过磷酸二酯键连接，优选地其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目，并且其中：

a.核苷酸或核苷酸类似物的单体单元的含氮碱基的序列与其必须结合的内源性分子(优选为微小RNA分子，更优选为SEQ ID NO：11的hsa-miR-23b-3p或SEQ ID NO：10的hsa-miR-218-5p)至少85％、90％、93％、95％、98％或100％互补，并且

b.其在5'端和/或3'端与至少一个油酸分子缀合，优选通过间隔分子缀合。

a.所述寡核苷酸的序列包括第一片段和第二片段，其中第一片段由一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成，所述第一片段与SEQ ID NO：13所示的hsa-miR-23b-3p种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且其中第二片段与第一片段相邻(即，其位于第一片段的上游和/或下游)，并且第二片段由与SEQ ID NO：11中存在的区域的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％、或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的氮碱基构成，并且

a.所述寡核苷酸序列包括第一片段和第二片段，其中第一片段由与SEQ ID NO：12中所示的hsa-miR-218-5p种子区域的互补序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的一连串至少5个至8个核苷酸或核苷酸类似物单元构成，所述第一片段，并且其中第二片段与第一片段相邻(即，位于第一片段的上游和/或下游)，并且第二片段由与SEQ ID NO：10中存在的区域的互补序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％、或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成，并且

在一个实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的长度为10个至30个核苷酸，其中：

a.所述分子中的至少两个核苷酸通过硫代磷酸酯键化学连接，并且所述分子中的至少两个核苷酸通过磷酸二酯键连接，优选地其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目，

b.其序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：52-110中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，并且

c.其在5'端和/或3'端与至少一个油酸分子缀合，优选通过间隔分子缀合。

a.至少一个单体单元是核苷酸类似物，其在戊糖部分、优选在核糖、核苷酸间连键、含氮碱基或所有这些部分中存在一个或多个化学修饰，

b.核苷酸或核苷酸类似物的单体单元的含氮碱基的序列与寡核苷酸SEQ ID NO：1或寡核苷酸SEQ ID NO：2或其功能等效物SEQ ID NO：52-110的核苷酸的单体单元的含氮碱基的序列具有至少85％、90％、93％、95％、98％或100％的同一性，并且

在优选的实施方式中，根据第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或超过十五个包含至少一种修饰，所述修饰选自由以下组成的组：锁核酸、2'-甲氧基、2'-O-甲氧基乙基-、2'氟、BNA、PMO、PNA、CRN、2,6二氨基嘌呤、甲基化胞嘧啶和/或它们的任意组合。

在优选的实施方式中，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子的长度为10个至30个核苷酸，并且其是人hsa-miR-23b-3p或hsa-miR-218-5p的拮抗剂，其包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸和至少两个通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸，其中优选地通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目，并且其中所述寡核苷酸与至少一个油酸分子缀合，其中所述一个油酸分子缀合在所述寡核苷酸和/或其类似物的3’端和/或5’端。优选地，所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合并且包含的PS键比PO键更多，所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)或SEQ ID NO：52-110的其功能等效物中任一种中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

在优选的实施方式中，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸中的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或超过八个经过化学修饰，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：i)2'-O-甲基(2'OMe)、ii)2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)和/或iii)连接2'氧和4'碳的额外桥(LNA)和/或它们的任意组合。在进一步的实施方式中，寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸经过化学修饰以包括连接至少位于寡核苷酸3'端和5'端的核苷酸的2'氧和4'碳的额外桥(LNA)。更优选地，将LNA修饰至少引入至位于寡核苷酸3’端和5’端的最末起第4个、第3个、优选第2个或最后一个核苷酸中。此外，优选地，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子中包含的核苷酸中的至少一个是2,6二氨基嘌呤和/或至少是甲基化胞嘧啶。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22(MD23b-2V2 3′Ol)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22(MD23b-2V2 3′Ol)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23(MD23b-2PS/PO 3′OI)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23(MD23b-2PS/PO 3′OI)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：51(MD23b-2PS/PO 5’OI)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其5’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：51(MD23b-2PS/PO 5’OI)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其5’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：51组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50(含有C6SSC6的MD23b-2V2 3’OI)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ IDNO：49或SEQ ID NO：50(含有C6SSC6的MD23b-2V2 3’OI)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其5’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50(含有C6SSC6的MD23b-2V2 3’OI)组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：25(hsa-miR-218-5p MOE油酸3′)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：25(hsa-miR-218-5p MOE油酸3′)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：25组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26(hsa-miR-218-5p MOE DD油酸3′)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：26(hsa-miR-218-5p MOE DD油酸3′)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27(hsa-miR-218-5p OME/MOE油酸3′)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物包含至少与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27(hsa-miR-218-5p OME/MOE油酸3′)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27组成。

在进一步的实施方式中，寡核苷酸分子和/或其类似物是人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，并且其包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：由与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：28(hsa-miR-218-5p OME/MOE油酸3′2)中存在的区域的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸或核苷酸类似物单元的一连串至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氮碱基构成的片段，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。优选地，寡核苷酸分子和/或其类似物中包含的核苷酸或核苷酸类似物单元的氮碱基的全长序列与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：28(hsa-miR-218-5p OME/MOE油酸3′2)中的寡核苷酸的含氮碱基的全长序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物至少包含与其3’端缀合的油酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：28组成。

优选地，第一方面的寡核苷酸分子和/或其类似物包含以下或由以下组成：SEQ IDNO：3、4、5、22、23、24、49、50或51(hsa-miR-23b的拮抗剂)或SEQ ID NO：7、8、9、14、25、26、27或28(hsa-miR-218-5p的拮抗剂)，或与SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50、51、7、8、9、14、25、26、27或28具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。

优选地，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物与SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50、51、7、8、9、14、25、26、27或28中的任一种、优选与SEQ ID NO：3、4、7、22、23或25具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或100％的同一性，并且与未处理的细胞或组织相比，其能够提高、优选统计学上提高MBNL蛋白(优选MBNL1和/或MBNL2蛋白)的内源性水平。最优选地，第一方面的寡核苷酸分子和/或其类似物由SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50、51、7、8、9、14、25、26、27或28组成。需要注意的是，在本发明的上下文中，当寡核苷酸分子和/或其类似物被描述成具体由特定的SEQ ID NO组成时，应理解为所述寡核苷酸分子和/或其类似物还由所述SEQ ID NO中所示的化学修饰、间隔分子和油酸缀合组成。例如，当寡核苷酸分子和/或其类似物由SEQ ID NO：3、4或7组成时，应解释为所述寡核苷酸分子和/或其类似物由SEQ ID NO：3、4或7所定义的核苷酸序列以及所述SEQ ID NO：3、4或7所定义的化学修饰、间隔分子和油酸缀合组成。每个SEQ ID NO中包含的化学修饰的详细描述包含在“序列表”部分中。

此外，本发明还包括以前体药物形式的化合物，例如寡核苷酸分子和/或其类似物，即，其形式或性质不完全具有活性，但在施用后会在体内经转化或代谢以产生本文所述的具有完全药理活性的寡核苷酸分子和/或其类似物。

还应考虑要抑制的微小RNA的细胞表达。根据miRGatorv3.0(miRGator v3.0:amicroRNA portal for deep sequencing,expression profiling andmRNAtargeting.Sooyoung Cho等人,Nucleic Acids Research,第41卷,第D1期,2013年1月1日,第D252-D257页，https://doi.org/10.1093/nar/gks1168)，hsa-miR-218-5p在脂肪组织、大脑、中枢神经系统、肾脏、心脏、肝脏和胆道系统、肺、咽、鼻咽、鼻、胎盘、脾、干细胞、睾丸、子宫和关节中表达。另一方面，hsa-miR-23b-3p在以下组织中表达：中枢神经系统、胃肠道、脂肪组织、乳腺、膀胱、心脏、角质形成细胞、肾脏、肝脏和胆道系统、肺、淋巴细胞、鼻、咽、胎盘、前列腺、皮肤、脾脏、干细胞、睾丸、甲状腺和子宫。因此，本发明考虑的一个可能的实施方式是寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子优选为抗miR，更优选为hsa-miR-218-5p或hsa-miR-23b-3p的拮抗剂，或两种或更多种所述分子的混合物，并且靶miRNA至少在选自以下组中的一个或多个器官中表达：大脑、小脑、海马体或中枢神经系统的其他器官、骨骼肌、心脏、脂肪组织、肾脏、肝脏和胆道系统、肺、咽、鼻咽、鼻、胎盘、脾、睾丸、子宫、胃肠道、乳腺、膀胱、前列腺、皮肤、角质形成细胞和淋巴细胞；或者靶miRNA在这些器官中任一种的原代培养物或源自这些器官中任一种的已建立细胞系的一个或多个细胞(包括诱导性多能干细胞细胞，简称为IPSC，或源自这些器官之一的干细胞)中表达。要拮抗的特定微小RNA的选择，特别是人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3pp之间的具体选择，也将决定可以发挥拮抗作用的组织范围。

在第二方面，本发明涉及一种组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种如第一方面或其任意实施方式所定义的寡核苷酸，或两种或更多种所述寡核苷酸的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选地，组合物包含如第一方面或其任意实施方式所定义的抗miR，更优选地包含人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂。在一个实施方式中，组合物包含这些抗微小RNA中的一种或它们的混合物，以及任何其他针对人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3p的抗微小RNA或它们的混合物，或者一般而言，组合物包含为这些微小RNA或下调人类基因MBNL1和/或MBNL2表达的其他微小RNA中的一种的抑制剂的任何寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子，包括还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。

在一个可能的实施方式中，药物组合物包含有效剂量的如第一方面或其任意实施方式所定义的抑制剂或拮抗剂，优选抗miR，更优选人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3pp的拮抗剂或它们的混合物。优选地，组合物中存在的人hsa-miR-218-5p的抑制剂/拮抗剂为本发明实施例中使用的以SEQ ID NO：1或其功能等效物SEQ ID NO：80-110表示的抗miR型抑制剂；组合物中存在的人hsa-miR-23b-3p的抑制剂/拮抗剂为以SEQ ID NO：2或其功能等效物SEQ ID NO：52-79表示的抗miR型抑制剂，其中所述抑制剂在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。更优选地，组合物中包含的抑制剂/拮抗剂的存在浓度允许施用治疗有效剂量。

“有效剂量”或“治疗有效剂量”是足以实现有益或期望的临床结果的量。根据之前的针对其他微小RNA的分子所获得的结果，微小RNA抑制剂/拮抗剂的有效剂量可以是约0.5mg/kg至约100mg/kg，优选小鼠为约1.5mg/kg至100mg/kg或大鼠为约0.75mg/kg至50mg/kg。然而，精确确定人类有效剂量可以基于每个患者的个体因素，包括大小、年龄，以及抑制剂或拮抗剂的性质(例如，它是否是表达构建体、抗miR或寡核苷酸类似物等)。尽管如此，本领域的普通专家可以根据本说明书和本领域知识容易地确定用量。

对于其临床应用，根据本发明用途的组合物将被视为本发明的药物组合物，并且它们可以以适当的形式制备以用于所需的应用。在特定治疗期间，可能需要或方便向对象施用多个剂量，每日、每周、每月、每两个月、每三个月或每六个月施用剂量。在某些实施方式中，对象在开始时接受初始剂量，该初始剂量大于一个或多个后续剂量或维持剂量。在某些实施方式中，对象定期或长期地接受剂量，特别是在治疗慢性疾病(例如DM1)的情况下。

胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珍珠和脂质基系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、其他寡核苷酸基递送媒介和脂质体，可用作本发明的抑制剂/拮抗剂的施用媒介，利用这些媒介形成了本发明的药物组合物。另一种可能性是使用适当的盐和缓冲液来制备本发明的药物组合物，以使施用媒介稳定并有助于靶细胞捕获。本发明的组合物可以是包含有效量施用媒介的水性组合物，其包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的本发明寡核苷酸分子(独立地或形成脂质体或其他复合物)或本发明寡核苷酸分子的表达运载体。

还可将额外的活性成分加入到组合物中，只要它们不会使本发明的分子或其表达运载体失活。

可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备活性化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液。也可以在甘油、聚乙二醇液体及其混合物和油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂以防止微生物生长。也可以将寡核苷酸制备于磷酸盐缓冲盐水和氯化钠的溶液中。例如，可以将寡核苷酸制备于pH为6.5至8(优选pH为约6.8-7)的磷酸盐缓冲盐水和浓度为约150mM的氯化钠中。

通常可以将本发明的组合物配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括例如衍生自无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)等的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的盐)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

在第三方面，本发明提供用于治疗用途的如第一方面或其任意实施方式中所定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中所定义的组合物、优选药物组合物。优选地，与寡核苷酸分子和/或其类似物缀合的油酸充当媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织，例如肌肉和/或CNS。因此，根据第一方面且在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合的寡核苷酸分子或其类似物可用于对有此需要的人类对象通过疗法进行治疗的方法，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物是所述通过疗法进行治疗的活性成分，并且其中所述油酸分子用作所述寡核苷酸分子和/或其类似物的药学上可接受的媒介或载体。本发明中使用的术语“活性成分”是指具有药学活性并负责治疗效果的物质。在抗miR拮抗剂的情况下，活性成分是靶向内源性miR的分子、优选寡核苷酸分子。最优选地，本文中使用的术语“活性成分”是指本发明的第一方面中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物。

在第四方面，本发明提供了如第一方面或其任意实施方式中所定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中所定义的组合物、优选药物组合物，其用于预防或治疗肌肉和/或神经系统疾病的用途，优选涉及肌肉组织虚弱和萎缩、特别是涉及肌肉力量丧失、无能力增加和畸形的肌肉疾病，和/或优选涉及大脑和/或CNS其他组织的结构和/或功能变化的神经系统疾病。优选地，肌肉疾病是肌肉营养不良疾病。优选地，肌肉营养不良疾病选自贝克尔肌营养不良症、先天性肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、远端肌营养不良症、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症、面肩胛肱型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、强直性肌营养不良症和眼咽型肌营养不良症。优选地，肌肉疾病是强直性肌营养不良症，优选是1型强直性肌营养不良和/或2型肌强直性营养不良。优选地，根据第四方面的用途包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。

在可选的第四方面，本发明提供如第一方面或其任意实施方式中所定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中所定义的组合物、优选药物组合物，用于预防或治疗有此需要的对象的以MBNL基因和/或蛋白质的量或功能不足为特征的疾病的用途。优选地，所述用途包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。本文中的“MBNL基因和/或蛋白质的量或功能不足”是指与健康对象相比，MBNL基因和/或蛋白的量或功能在统计学上显著更低。在又一个可选的第四方面，本发明提供了如第一方面或其任意实施方式中所定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中所定义的组合物、优选药物组合物，用于靶向有此需要的对象的肌肉和/或中枢神经系统细胞、优选患有DM或DM1的对象的肌肉细胞的用途。本文中的“靶向肌肉和/或中枢神经系统细胞”是指增加所述细胞中的不足量的MBNL蛋白和/或基因。中枢神经系统细胞优选包括神经元，但也包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和小神经胶质细胞)、脉络丛细胞、与血管和覆盖物相关的细胞。肌肉细胞包括平滑肌细胞、优选骨骼肌细胞和心肌细胞。优选地，增加是统计学上显著增加，优选与对照细胞或未处理的细胞相比。

在又一个可选的第四方面，本发明提供如第一方面或其任意实施方式中所定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中所定义的组合物、优选药物组合物，用于预防或治疗以毒性RNA表达为特征的疾病(也称为RNA病或RNA介导/RNA显性疾病)的用途。优选地，所述用途包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。所述疾病通常以由不寻常突变机制引起的不稳定微卫星重复扩增为特征，其中重复元件扩增的表达通过增加每个细胞核中的靶RNA质量以及通过增加RNA-蛋白质相互作用的亲合力(这是由于每个突变转录物中结合位点的局部浓度高引起)等机制为RNA结合蛋白创造了汇聚点。优选地，RNA病或RNA介导/RNA显性的疾病是神经肌肉疾病或神经退行性疾病，更优选地选自1型糖尿病(ORPHA:273)或2型糖尿病(ORPHA:606)；脆性X相关震颤/共济失调综合征(ORPHA:93256；FXTAS)；C9ORF72肌萎缩性侧索硬化症和/或额颞型痴呆(ORPHA:275872；ALS/FTD)；脊髓小脑共济失调(SCA)或良性成人家族性肌阵挛性癫痫(BAFME)。

在又一个可选的第四方面，本发明提供了如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸，或如第二方面或其任意实施方式中定义的组合物、优选药物组合物，用于预防或治疗以miR-23b-3p和/或miR-218-5p的量或功能过量为特征的疾病的用途。本文中的“miR-23b-3p和/或miR-218-5p的量或功能过量”是指与健康对象相比，miR-23b-3p和/或miR-218-5p的量或功能具有统计学显著更高的水平。优选地，以miR-23b-3p和/或miR-218-5p的量或功能过量为特征的疾病为强直性肌营养不良症，优选为1型和/或2型强直性肌营养不良。优选地，所述用途包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。

优选地，根据第三方面或第四方面的用途的单独地或包含在药物组合物中的如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子是分别具有SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2、或者与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3p的抑制剂。优选地，根据第三方面或第四方面的用途的单独地或包含在药物组合物中的如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子是分别具有SEQ ID NO：80-110或SEQ ID NO：52-79、或者与SEQ IDNO：80-110或SEQ ID NO：52-79具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的人hsa-miR-218-5p或人hsa-miR-23b-3p的抑制剂。

更优选地，根据第三方面或第四方面的用途的如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子是包含以下或由以下组成的拮抗剂：SEQ ID NO：3、4或5(针对hsa-miR-23b-3p的抗miR)或SEQ ID NO：7、8、9或14(针对hsa-miR-218-5p的抗miR)、或者与SEQ ID NO：3、4或5(针对hsa-miR-23b-3p的抗miR)或SEQ ID NO：7、8、9或14(针对hsa-miR-218-5p的抗miR)具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。更优选地，根据第三方面或第四方面的用途的如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分子是包含以下或由以下组成的拮抗剂：SEQ ID NO：22、23、24、49、50或51(针对hsa-miR-23b-3p的抗miR)或SEQ ID NO：25、26、27或28(针对hsa-miR-218-5p的抗miR)、或者与SEQ ID NO：3、4或5(针对hsa-miR-23b-3p的抗miR)或SEQ ID NO：7、8、9或14(针对hsa-miR-218-5p的抗miR)具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。如上文第一方面所述，根据第三方面和第四方面的用途的寡核苷酸或其类似物还包含与其3’端和/或5’端缀合的至少一个油酸分子。

在第四方面的一个实施方式中，治疗是针对1型和/或2型强直性肌营养不良的一种或多种症状的姑息治疗，或针对作为1型和/或2型强直性肌营养不良的一部分症状的一种或多种肌肉疾病的姑息治疗。在第四方面的一个优选实施方式中，治疗是针对慢性1型和/或2型强直性肌营养不良。在优选的实施方式中，治疗是治疗性治疗。优选地，所述用途包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。

在第三方面或第四方面的实施方式中，有此需要的对象是哺乳动物，优选是人类，更优选是患有DM、优选DM1的人类。

通过其可能的表达运载体施用拮抗剂，允许根据基础载体本身的趋向性和/或通过选择仅在特定组织中引起与其相连的编码序列表达的控制元件来将表达引导至特定组织或特定组织组。此外，某些特定剂型可以有利于更好地进入一种器官或其他器官。因此，本发明的第三方面或第四方面中可与任何其他方面组合的可能实施方式更直接涉及其治疗性应用，其也可以定义为：本发明寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物分子之一、两种或更多种所述分子的混合物、或包含至少一种所述分子的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于通过抑制或拮抗人hsa-miR-218-5p或hsa-miR-23b-3p在选自以下组的一种或多种器官或来自这些器官中的一种或多种的干细胞中的作用来治疗1型强直性肌营养不良：大脑、小脑、海马体或其他中枢神经系统器官、骨骼肌、心脏、脂肪组织、肾脏、肝脏和胆道系统、肺、咽、鼻咽、鼻、胎盘、脾、睾丸、子宫、胃肠道、乳腺、膀胱、前列腺、皮肤、角质形成细胞和淋巴样细胞。根据需要或适当地，本发明的寡核苷酸还可以靶向选自以下组的其他器官：大脑、小脑、海马体或中枢神经系统的其他器官、骨骼肌、心脏、脂肪组织、肾脏、肝脏和胆道系统、肺、咽、鼻咽、鼻、胎盘、脾、睾丸和子宫、胃肠道、乳腺、膀胱、前列腺、皮肤、角质形成细胞和淋巴样细胞、或来自这些器官中的一种或多种的干细胞、或其组合。

考虑到抗miR的稳定性，可以考虑直接施用至哺乳动物、优选人类，例如通过皮下或全身途径，优选静脉内或鞘内，例如溶解或悬浮在药学上可接受的载体(例如水或水性溶液例如盐水或磷酸盐缓冲液)中，或关节内递送。施用它们的组合物可以含有药学上可接受的赋形剂。

本发明的活性组合物可以通过任何常见途径施用，只要通过该途径可到达靶组织即可。途径包括口服、经鼻腔、鞘内或口腔途径，并且优选地，施用可以通过皮内、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内途径进行。如前所述，通常将包含抗miR的组合物配制成用于静脉内或皮下施用。然而，由于在通过静脉内施用时油酸增强寡核苷酸分子和/或其类似物向肌肉和/或中枢神经系统细胞的递送(参见实施例9和10)，因此优选的实施方式是静脉内、动脉内或皮下施用。此外，还优选的是所述静脉内、动脉内或皮下施用是慢性施用，这意味着它是定期进行的(在有施用需要的患者的整个生命期间)。

在配制后，溶液优选以与剂型相容的形式并且以治疗有效的量施用。制剂可以以各种剂型容易地施用，例如注射液、药物释放胶囊等。

另一方面提供了一种治疗有此需要的对象的糖尿病(优选1型糖尿病)的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明的寡核苷酸或药物组合物。在一些实施方式中，寡核苷酸将以允许施用治疗有效剂量的浓度存在。优选地，所述治疗方法包括至少一种油酸分子在所述油酸分子缀合至寡核苷酸分子和/或其类似物时作为媒介以将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至相关组织(例如肌肉和/或CNS)的用途。

如上所述，实施例提供了油酸如何能够增加向靶组织例如肌肉和大脑递送的证据。这导致以下结论：油酸不仅在分子中包含的PS量比PO量更高时能够降低毒性，而且油酸还是将寡核苷酸分子和/或其类似物递送到靶组织例如肌肉和/或CNS的有效媒介。鉴于此，本发明的第五方面涉及至少一种油酸分子在所述油酸与寡核苷酸分子和/或其类似物缀合、优选与所述寡核苷酸分子和/或类似物的3'或5'缀合时作为药学上可接受的媒介或载体的用途。重要的是，至少一种油酸分子作为药学上可接受的媒介或载体的用途是指油酸分子负责将与其缀合的寡核苷酸分子和/或其类似物运送、递送、携带到特定靶组织(优选肌肉和/或中枢神经系统组织)的用途。在此上下文中，“媒介”和“载体”被视为同义词，因此可互换使用。

本领域技术人员知晓如何测试油酸是否正充当与其缀合的寡核苷酸分子和/或其类似物的媒介。例如，评估至少一种油酸是否正被用作媒介的方法是测量在静脉内、动脉内或皮下施用后到达靶组织(优选中枢神经系统和/或肌肉组织)的寡核苷酸分子和/或其类似物的量，并且将所述量与当寡核苷酸分子和/或其类似物未缀合至少一种油酸而施用时存在于所述组织中的量进行比较。

优选地，缀合油酸的寡核苷酸分子和/或其类似物是本发明的第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物。因此，第五方面的优选实施方式涉及至少一种油酸分子在所述油酸缀合至第一方面定义的寡核苷酸分子和/或其类似物的3'端或5'端时作为药学上可接受的媒介或载体的用途，优选地，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物是本发明第三方面或第四方面或其任意实施方式中定义的通过疗法进行治疗的方法的活性成分。值得注意的是，与寡核苷酸分子和/或其类似物的缀合可以是直接缀合或通过间隔分子缀合，如本发明的第一方面所述。优选地，用作媒介的油酸通过选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇及其衍生物的间隔分子与寡核苷酸分子和/或其类似物缀合。

在第五方面的实施方式中，只有一个油酸分子缀合至第一方面或其任意实施方式中的寡核苷酸分子和/或其类似物的5'端或3'端，使得单个油酸分子充当所述寡核苷酸分子和/或其类似物的媒介。在第五方面的实施方式中，只有一个油酸分子缀合至第一方面或其任意实施方式中的寡核苷酸分子和/或其类似物，使得单个油酸分子充当所述寡核苷酸分子和/或其类似物的媒介，并且第一方面中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物充当第三方面或第四方面中定义的通过疗法进行治疗的方法中的活性成分。

在优选的实施方式中，与本发明的第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物缀合的至少一种油酸分子能够将所述寡核苷酸分子和/或其类似物运送至感兴趣组织，例如肌肉和/或CNS，比寡核苷酸分子和/或其类似物未缀合油酸时更加有效，如实施例9或10所示。因此，油酸分子用作活性成分递送媒介，其中活性成分组分是第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物。

在一个实施方式中，至少一种油酸分子在缀合至第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸分子和/或类似物的3'端或5'端时被用作药学上可接受的媒介或载体，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物包含化学连接核苷酸的硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合物，优选地其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。

在一个实施方式中，至少一种油酸分子在缀合至第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸分子和/或类似物的3'端或5'端时被用作药学上可接受的媒介或载体，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物是微小RNA的拮抗剂，优选为人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p的拮抗剂。

在一个实施方式中，至少一种油酸分子在缀合至第一方面或其任意实施方式的寡核苷酸分子和/或类似物的3'端或5'端时被用作药学上可接受的媒介或载体，其中当所述寡核苷酸分子和/或其类似物通过静脉内、动脉内或皮下途径施用时，用作媒介的油酸将所述寡核苷酸分子和/或其类似物递送至有此需要的对象的肌肉和/或中枢神经系统细胞。

在一个实施方式中，至少一种油酸分子在缀合至如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物的3'端或5'端时被用作药学上可接受的媒介或载体，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物是通过疗法进行治疗的方法的活性成分，所述通过疗法进行治疗的方法包括预防或治疗肌肉疾病、神经系统疾病和/或RNA病。

在一个实施方式中，至少一种油酸分子在缀合至如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子和/或其类似物的3'端或5'端时被用作药学上可接受的媒介或载体，其中所述寡核苷酸分子和/或其类似物是通过疗法进行治疗的方法的活性成分，所述通过疗法进行治疗的方法包括预防或治疗强直性肌营养不良症，优选地强直性肌营养不良症是1型强直性肌营养不良。

在第五方面，本发明还提供了一种缀合物，其中所述缀合物由至少一种与如第一方面或其任意实施方式中定义的寡核苷酸分子或其类似物的3'端或5'端缀合的油酸组成，其中所述寡核苷酸分子或其类似物用作如第三方面或第四方面或其任意实施方式中定义的通过疗法进行治疗的方法中的活性成分，并且其中所述至少一种油酸被用作药学上可接受的媒介以用于将所述寡核苷酸分子或其类似物递送至靶组织，例如CNS和/或肌肉组织。

本发明还包括下列条款：

1.一种寡核苷酸分子、或两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，其中所述寡核苷酸分子的长度为10个至30个核苷酸，其中所述寡核苷酸分子包含至少两个通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子在其3’端和/或5’端与至少一个油酸分子缀合。

2.条款1的寡核苷酸分子，其中所述分子是微小RNA的拮抗剂。

3.条款2的寡核苷酸分子，其中所述微小RNA是人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p。

4.根据条款1至3中任一项的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，其中所述分子中的至少两个核苷酸通过磷酸二酯键连接，并且其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。

5.根据条款1至4中任一项的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子包含由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQID NO：2(抗miR-23b-3p)或SEQ ID NO:52-110中存在的区域的序列具有至少80％的同一性的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

6.根据条款1至5中任一项的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子包含由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQID NO：2(抗miR-23b-3p)中存在的区域的序列完全相同的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

7.根据条款1至6中任一项的寡核苷酸分子，其包含至少一种化学修饰，其中所述化学修饰选自下组：

i)2’-O-甲基(2’OMe)，

ii)2'-O-甲氧基乙基(2′MOE)，和/或

iii)连接2'氧和4'碳的额外桥(LNA)。

8.根据条款1至7中任一项的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸分子包含由与SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50或51(hsa-miR-23b的拮抗剂)或SEQ ID NO：7、8、9、14、25、26、27或28(hsa-miR-218-5p的拮抗剂)中存在的区域的序列具有至少80％的同一性的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

9.根据条款1至8中任一项的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子的长度为15个至30个核苷酸，并且其中所述寡核苷酸的核苷酸序列由SEQ ID NO：3、4、5、22、23、24、49、50或51(hsa-miR-23b的拮抗剂)或SEQ ID NO：7、8、9、14、25、26、27或28(hsa-miR-218-5p的拮抗剂)组成。

10.一种组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种如条款1至9中任一项所定义的寡核苷酸分子或者两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

11.用于治疗用途的组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种如条款1至9中任一项所定义的寡核苷酸分子或者两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

12.用于靶向有此需要的对象的肌肉细胞的用途的组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种如条款1至9中任一项所定义的寡核苷酸或者两种或更多种所述寡核苷酸的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

13.用于预防或治疗肌肉疾病或者预防或治疗RNA病的用途的组合物、优选是药物组合物，其包含至少一种如条款1至9中任一项所定义的寡核苷酸或者两种或更多种所述寡核苷酸的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

14.根据条款13所述的用途的组合物、优选药物组合物，其中所述疾病是强直性肌营养不良症。

15.根据条款14所述的用途的组合物、优选药物组合物，其中所述强直性肌营养不良症为1型强直性肌营养不良。

序列表(5'至3'的方向)

如上所述，下面列出的和整个申请中提及的SEQ ID NO包括核碱基序列，并且对于那些偏离其天然化学性质的寡核苷酸，还包括其化学修饰和/或脂肪酸缀合。在整个说明书中，使用以下命名法来定义本文公开的SEQ ID NO中包含的化学修饰：

-LNA核苷酸用大写字母和小写字母的组合表示：Ab，Gb，Tb，Cb，

-硫代磷酸酯键用小写字母“s”表示，

-2'-O-MOE RNA核苷酸用大写字母和小写字母的组合表示：Am，Cm，Gm，Tm，

-2'-O-甲基核苷酸用小写字母表示：a、g、c、u，

-2'-氟化RNA核苷酸用大写字母和小写字母的组合表示：Af、Cf、Gf、Tf，

-2'-O-甲基-2,6-二氨基嘌呤修饰用表达(dap)表示，

-脱氧核苷酸用小写字母和大写字母的组合表示：dA、dC、dG、dT，

-2'-OMe-5-甲基尿苷或2'-OMe-核糖胸苷用小写字母“t”表示，

-5-甲基-2'-O-甲基胞苷用表达(5Mc)表示，

-表达(油酸)表示寡核苷酸与油酸缀合，

-表达(棕榈酸)表示寡核苷酸与棕榈酸缀合，

-(间隔分子)优选选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇或其衍生物。优选地，间隔分子为NHC6或NHC3，

-“Y”表示任意嘧啶(C或U/T)

-“I”表示次黄嘌呤，因为次黄嘌呤是肌苷的核碱基。

SEQ ID NO 1：人hsa-miR-218-5p的拮抗剂：TTAGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 2:人hsa-miR-23b-3p的拮抗剂：ATCCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 3：MD23b-2V2 3’OI：

AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO 4：MD23b-2-PS/PO 3'OI：

AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO 5：MD23b-2-PS/PO 5'OI：

(油酸)(NHC6)AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb

SEQ ID NO：6：MD23b-2-PS/PO：

AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb

SEQ ID NO 7：218MOE油酸3'：

TbsTbsAmsGbsAmsTmsCbAmsAmGbCmAbsCmsAbsAb(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO：8：

218MOE DD油酸3'：TbsTbsAmsGbsAmsTmsCbAmsAmsGbCmAbsCms(dap)s(dap)(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO：9：

218OME/MOE油酸3'：TbsTmsasGbsastsCbAmsAmGbCmAbsCmsAmsAb(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO：10：hsa-miR-218-5p：UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU

SEQ ID NO：11：hsa-miR-23b-3p：AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC

SEQ ID NO：12：hsa-miR-218-5p的种子区域：UGUGCU

SEQ ID NO：13：hsa-miR-23b-3p的种子区域：UCACAU

SEQ ID NO：14：

218OME/MOE油酸3'2：TbsTbsasGbsastsCbAmsAmGbCmAbsCmsAmsAb(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO：15：

218MOE：TbsTbsAmsGbsAmsTmsCbAmsAmGbCmAbsCmsAbsAb

SEQ ID NO：16：

MD23b-2V2 3’Pal：AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(NHC6)(棕榈酸)

SEQ ID NO：17：MD23b-2V2：AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb

SEQ ID NO：18：MD23 MOE：AbsTbsCmsCmCmsTmsGmGmsCmAmAmsTbGmsTmGbsAb

SEQ ID NO：19：hsa-miR-23b-3p的微小RNA前体(pre-微小RNA)：

CUCAGGUGCUCUGGCUGCUUGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUUGUGACUUAAGAUUAAAAUCACAUUGCCAGGGAUUACCACGCAACCACGACCUUGGC

SEQ ID NO：20：Pre-hsa-miR-218-5p-1(chr4:20529898-20530007)：

GUGAUAAUGUAGCGAGAUUUUCUGUUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGUUGCGAGGUAUGAGUAAAACAUGGUUCCGUCAAGCACCAUGGAACGUCACGCAGCUUUCUACA

SEQ ID NO：21：Pre-miR-218-2(chr5:1681951SI-168195260):

GACCAGUCGCUGCGGGGCUUUCCUUUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGUGGAACGAUGGAAACGGAACAUGGUUCUGUCAAGCACCGCGGAAAGCACCGUGCUCUCCUGCA

SEQ ID NO 22：不含特定间隔分子的MD23b-2V2 3’OI：

AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO 23：不含特定间隔分子的MD23b-2-PS/PO 3’OI：

AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO 24：不含特定间隔分子的MD23b-2-PS/PO 5’OI：

(油酸)(间隔分子)AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO 25：不含特定间隔分子的218MOE油酸3’：

TbsTbsAmsGbsAmsTmsCbAmsAmGbCmAbsCmsAbsAb(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO：26：不含特定间隔分子的218MOEDD油酸3’：

TbsTbsAmsGbsAmsTmsCbAmsAmsGbCmAbsCms(dap)s(dap)(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO：27：不含特定间隔分子的218OME/MOE油酸3’：

TbsTmsasGbsastsCbAmsAmGbCmAbsCmsAmsAb(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO：28：不含特定间隔分子的218OME/MOE油酸3’2：

TbsTbsasGbsastsCbAmsAmGbCmAbsCmsAmsAb(间隔分子)(油酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO：29：不含特定间隔分子的MD23b-2V2 3’Pal：

AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(间隔分子)(棕榈酸)，其中间隔分子优选地选自NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、或其衍生物。

SEQ ID NO 49:含有C6SSC6和NHC6的MD23b-2V2 3’OI

AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(C6SSC6)(NHC6)(油酸)

SEQ ID NO：50：含有C6SSC6和NHC3的MD23b-2V2 3’OI

AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(C6SSC6)(NHC3)(油酸)

SEQ ID NO 51：不含间隔分子的MD23b-2-PS/PO 5’OI:

(油酸)AbsTms(5Mc)s(5Mc)(5Mc)Tbgsgs(5Mc)sAbAmTbGbsTmsGbsAb.

SEQ ID NO 52：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

YTCCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 53：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTYGCAATGTGA

SEQ ID NO 54：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGYCAATGTGA

SEQ ID NO 55：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCYATGTGA

SEQ ID NO 56：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAYTGTGA

SEQ ID NO 57：抗miR-23b-3p的功能等效序列:

ATCCCTGGCAATYTGA

SEQ ID NO 58：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGTYA

SEQ ID NO 59：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGTGY

SEQ ID NO 60：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

GTCCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 61：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATUCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 62：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCUCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 63抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCUTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 64：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGUAATGTGA

SEQ ID NO 65：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCGATGTGA

SEQ ID NO 66：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAGTGTGA

SEQ ID NO 67：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGTGG

SEQ ID NO 68：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ITCCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 69：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCIATGTGA

SEQ ID NO 70：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAITGTGA

SEQ ID NO 71：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGTGI

SEQ ID NO 72：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

AICCCTGGCAATGTGA

SEQ ID NO 73：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCIGGCAATGTGA

SEQ ID NO 74：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAAIGTGA

SEQ ID NO 75：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGIGA

SEQ ID NO 76：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTIGCAATGTGA

SEQ ID NO 77：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGICAATGTGA

SEQ ID NO 78：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATITGA

SEQ ID NO 79：抗miR-23b-3p的功能等效序列：

ATCCCTGGCAATGTIA

SEQ ID NO 80：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTYGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 81：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAYATCAAGCACAA

SEQ ID NO 82：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGYTCAAGCACAA

SEQ ID NO 83：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCYAGCACAA

SEQ ID NO 84：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAYGCACAA

SEQ ID NO 85：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAYCACAA

SEQ ID NO 86：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCYCAA

SEQ ID NO 87：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACYA

SEQ ID NO 88：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACAY

SEQ ID NO 89：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTGGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 90：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGGTCAAGCACAA

SEQ ID NO 91：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATUAAGCACAA

SEQ ID NO 92：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCGAGCACAA

SEQ ID NO 93：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAGGCACAA

SEQ ID NO 94：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGUACAA

SEQ ID NO 95：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCGCAA

SEQ ID NO 96：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCAUAA

SEQ ID NO 97：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACGA

SEQ ID NO 98：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACAG

SEQ ID NO 99：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTIGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 100：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGITCAAGCACAA

SEQ ID NO 101：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCIAGCACAA

SEQ ID NO 102：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAIGCACAA

SEQ ID NO 103：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCICAA

SEQ ID NO 104：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACIA

SEQ ID NO 105：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAGCACAI

SEQ ID NO 106：抗miR-218-5p的功能等效序列：

ITAGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 107：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TIAGATCAAGCACAA

SEQ ID NO 108：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGAICAAGCACAA

SEQ ID NO 109：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAIATCAAGCACAA

SEQ ID NO 110：抗miR-218-5p的功能等效序列：

TTAGATCAAICACAA

SEQ ID NO 111：TbsCsAsCbsAsTsTbsGsCsCbsAsGsGbsGsAsTb-地高辛NHS酯

下面的实施例仅仅用于说明本发明。

实施例

材料和方法

细胞培养实验

将永生化MyoD诱导型(强力霉素)DM1和对照成纤维细胞(Arandel L.等人(2017)."Immortalized human myotonic dystrophy muscle cell lines to assesstherapeutic compounds."Dis Model Mech 10(4):487-497)在含有4.5g/L葡萄糖、1％ P/S和10％ FBS的DMEM中生长(Sigma,圣路易斯，密苏里州)。成纤维细胞转分化为肌管是根据(Cerro-Herreros等人.(2018).“miR-23b and miR-218silencing increaseMuscleblind-like expression and alleviate myotonic dystrophy phenotypes inmammalian models”.Nat.Commun.9,2482)。在第0天诱导转分化，并且向细胞培养基中加入不同浓度的测试化合物(对于MD23b-2、MD23b-8、MD23b-4、MD23b-13、MD23b-7、MD23b-14、MD-23b-1、23-LNA4、MD23b-10、MD23b-3、抗miR-23b、MD23b-6、MD23b-12、MD23b-9、MD23b-5、MD23b-11、23-LNA6、非缀合-23b、5’-23b-油酸、5’-23b-亚油酸、5’-23b-MeToc、5’-23b-MeChol、5’-23b-MePal、5’-23b-反油酸、5’-23b-硬脂酸、OL-MD23b-2、MD23b-2-PS/PO、MD23b-2-PS/PO 5’Ol、非缀合-218、Ax-218、5’-218-油酸、5’-218-MeChol、5’-218-亚油酸、5’-218-MePal、5’-218-MeToc、Sc-油酸、MD218-12、MD218-6、MD218-11、非缀合-218、MD218-13、MD218-5、MD218-4、MD218-15、MD218-10、MD218-3：10nM、50nM、200nM、1μM和5μM；对于23-LNA8、AX-23b、MD23b-2V2 3’Ol、MD23b-2V2 3’Ol(C6SSC6)(NHC6)、MD23b-2V2 3’Ol(C6SSC6)(NHC3)和MD23b-2V2 3’Ol(苏氨醇)：2nM、10nM、50nM、200nM和1μM；23-D/LNA1、23-D/LNA2和218-2F/LNA1：0.4nM、2nM、10nM、50nM和200nM)；并且对于218-D/LNA2、218-2F/MOE：0.08nM、0.4nM、2nM、10nM和50nM)，通过用X-tremeGENE^TMHP(罗氏,巴塞尔，瑞士)进行脂质转染，并且在4小时后用新鲜分化培养基替换。在第4天，在分化培养基中收集细胞，并且进行蛋白提取处理。

细胞增殖测定法

如前所述，以10⁵个细胞/ml接种在96孔板中的细胞在24小时后用抗miR转染；96小时后，使用CellTiter水性非放射性细胞增殖测定法(Promega,麦迪逊,威斯康星州)测量细胞增殖。使用非线性最小二乘回归计算TC50，使用Infinite M200 PRO板读数器(Tecan,门内多夫,瑞士)测定吸光度水平。

定量斑点印迹(QDB)测定法

对于活性测定，将细胞以每孔8x10⁴个细胞的密度接种在6孔板中，24小时后用抗miR转染，如前所述。对于总蛋白提取，对人肌肉细胞进行超声处理，同时在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学,彭茨贝格,德国)的RIPA缓冲液(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)中对小鼠肌肉(腓肠肌和股四头肌)进行匀浆。使用牛血清白蛋白作为标准，用BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)进行总蛋白质的定量。对于免疫检测测定法，将1μg/孔的细胞样品和2μg/孔的小鼠样品变性(100℃，5分钟)并且在QDB板(Quanticision Diagnostics Inc,三角研究园,北卡罗来纳州)上上样。将每个细胞样品一式四份在两个不同的板上上样；一个用于检测MBNL1，另一个用于检测GAPDH，GAPDH在此用作内源性对照。在小鼠样品的情况下，将每个样品一式四份在三个不同的板上上样，一个用于检测MBNL1，一个用于检测微管蛋白，用作内源性对照，另一个用于检测抗小鼠IgG二抗，作为阴性对照以减去背景。对于QDB方案，蛋白质以2μg/孔制备。将每个样品一式四份加载到两个不同的板上，一个用于检测MBNL1，另一个用于检测GAPDH，GAPDH在此用作内源性对照。为了制备样品混合物(足够10份样品，以考虑到移液误差)，将蛋白提取物置于指定浓度，加入10.4μl上样缓冲液4X，最后加入50μl ddH2O。制备好样品后，将其在水中煮沸5分钟，蛋白质变性后，将其置于冰上。要上样样品，将QDB板(Quanticision Diagnostics,Inc)倒置放置。在每个膜圈上，放入5μl之前制备的蛋白质混合物。允许上样的QDB板在室温下在通风良好的空间中干燥30分钟，以完全干燥膜。干燥后，将QDB板浸入转移缓冲液(0.039M甘氨酸、0.048M Tris、0.37％ SDS、20％甲醇)中，并且轻轻摇动板1分钟。用TBST(137mM NaCl、2.7mM KCl、20mM Tris，pH7.4，加上0.1％吐温-20)冲洗板3次，并且在一个容器中用封闭缓冲液(加入5％脱脂乳的TBST)遮蔽。将板与小鼠抗MBNL1(1:1000，ab77017，Abcam)或小鼠抗GAPDH(1:500，克隆G-9，圣克鲁兹)一抗在96孔板中于4℃下孵育过夜。用TBST洗涤板三次，并且再与抗小鼠POD的二抗(1:200，Sigma-Aldrich)一起孵育2小时，然后用TBST再次洗涤板三次。将该板插入装有100μL/孔ECL底物(Pierce)溶液的96孔板中1分钟，然后将其插入白色96孔板中，使用Tecan Infiniti200pro酶标仪进行化学发光信号定量，在用户界面中选择选项“带盖的板”。

将板与小鼠抗MBNL1(1:200，MB1a(4A8)(DSHB,爱荷华市,爱荷华州)和兔抗α-微管蛋白(1:1000，PA5-16891，赛默飞世尔)一抗在4℃下孵育过夜。分别使用山羊辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG和抗兔IgG二抗(1:3500，(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)检测一抗。使用PierceTM ECL Western试剂(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)检测免疫反应，并且使用Infinite M200 PRO板读取器(Tecan,门内多夫,瑞士)获得发光。

RNA提取、逆转录PCR(RT-PCR)和实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)

根据生产商的说明，使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen,希尔登,德国)从鼠腓肠肌和股四头肌中分离总RNA。用DNase I(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)消化1微克RNA，并且用SuperScript II(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)使用随机六核苷酸进行逆转录。对于随后的PCR反应，20ng cDNA与GoTaq聚合酶(Promega，麦迪逊，威斯康星州)一起使用。使用特异性引物分析小鼠样品(两种肌肉)中Atp2a1、Nfix、Mbnl1和Clcn1的选择性剪接。Gapdh水平使用0.2ng cDNA建立了内源性参考水平。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，并且用ImageJ软件(NIH，北贝塞斯达，马里兰州)定量。剪接恢复指数百分比(PSR)定义为％_SI值减去再除以(减去)(SI：每个样品的剪接包含率；DSI：疾病下的剪接包含率；HSI：健康下的剪接包含率；在所有情况下，剪接是指包含指定的选择性外显子)。这个比率是为ATP2A1、NFIX、MBNL1和CLCN1计算的。分析的引物序列和外显子可在(Cerro-Herreros et al.2018 2018Jun26；9(1):2482.doi:10.1038/s41467-018-04892-4.)获得并且转载如下：

SEQ ID NO：30:Gapdh Fwd:ATCAACGGGAAGCCCATCAC

SEQ ID NO：31:Gapdh Rv:CTTCCACAATGCCAAAGTTGT

SEQ ID NO：32:Atp2a Fwd:GCTCATGGTCCTCAAGATCTCAC

SEQ ID NO：33:Atp2a Rv:GGGTCAGTGCCTCAGCTTTG

SEQ ID NO：34:Clcn1 Fwd:GTCCTCAGCAAGTTTATGTCC

SEQ ID NO：35:Clcn1 Rv:GAATCCTCGCCAGTAATTCC

SEQ ID NO：36:Nfix Fwd:TCGACGACAGTGAGATGGAG

SEQ ID NO：37:Nfix Rv:CAAACTCCTTCAGCGAGTCC

SEQ ID NO：38:Mbnl1 ex5 F:

AGGGGAGATGCTCTCGGGAAAAGTG

SEQ ID NO：39:Mbnl1 ex5 R:

GTTGGCTAGAGCCTGTTGGTATTGGAAAATAC

使用1ng小鼠组织cDNA作为模板，使用QuantiFast Probe PCR Kit试剂进行多重qRT-PCR。将商业TaqMan探针(Qiagen,希尔登,德国)用于小鼠(MBNL1和MBNL2；FAM标记的探针)和参照(GAPDH，MAX标记的探针)基因。结果基于Gapdh内源性基因表达归一化。使用的引物如下：

SEQ ID NO：40:探针Mbnl1：/56-FAM/TCGCAAATCAGCTGTGAGGAGATTCCCT/3IAbRQSp/

SEQ ID NO：41:Mbnl1 F：TACCGATTGCACCACCAAAC

SEQ ID NO：42:Mbnl1 R：GCTGCTTTCAGCAAAGTTGTC

SEQ ID NO：43:Mbnl2探针：/56-FAM/CCCGGCAGACAGCACCATGATCGA/3IAbRQSp/

SEQ ID NO：44:Mbnl2 F：GAGACAGACTGCCGCTTTG

SEQ ID NO：45:Mbnl2 R：GGTTACGGTGTTGTCGTTTGT

SEQ ID NO：46:Gapdh探针：/5MAXN/-CGCCTGGTCACCAGGGCTGCT-/3BHQ_1/

SEQ ID NO：47:Gapdh_F：CAACGGATTTGGTCGTATTGG

SEQ ID NO：48:Gapdh_R：TGATGGCAACAATATCCACTTTACC

根据制造商的说明，使用特异性miRCURY^TM-锁核酸微小RNA PCR引物(Qiagen,希尔登,德国)对肌肉组织中的miRNA表达进行定量。相对基因表达基于U1(YP00203909)和U6(YP00203907)snRNA被归一化。

使用QuantStudio 5实时PCR系统(Applied Biosystems,福斯特城,加利福尼亚)测量表达水平。使用2^-ΔΔCt方法计算相对于内源性基因和对照组的表达。使用双尾t检验(α＝0.05)对样品对进行比较，必要时应用Welch校正。通过对归一化数据的学生t检验(p<0.05)来估计统计学差异。

动物实验和施用寡核苷酸

小鼠处理和实验程序遵循关于实验动物护理和实验的欧洲法律(2003/65/C.E.)，并且由巴伦西亚农业委员会批准。纯合的转基因HSALR(系20b)小鼠(Mankodi etal.2000Science:289(5485):1769-73.doi:10.1126/science.289.5485.1769)由C.Thornton教授(美国纽约州罗切斯特市罗切斯特大学医学中心)提供。实验组是作为正常对照的FVB和作为阴性对照的用PBS处理的HSALR，以及用所有实验寡核苷酸处理的HSALR小鼠。样品大小为每个处理组4只小鼠，PBS组12只小鼠，FVB组18只小鼠。所有组均以单剂量3mg/kg静脉内注射(尾静脉)150μl的1×PBS(溶媒)或特定寡核苷酸(参见图2-5)。注射后四天，处死小鼠，将感兴趣的组织冷冻在液氮中用于分子测定法。

肌电图研究

如前所述，在全身麻醉下在处理前和处死动物时进行肌电图检查(Kanadia等人2006Proc Natl Acad Sci U S A.2006Aug 1；103(31):11748-53.doi:10.1073/pnas.0604970103)。为了消除偏差，测定以盲法进行。在两个后肢的每个股四头肌中进行五次针刺，并且按五分制对肌强直放电进行分级：0，无肌强直；1，≤50％的针刺发生偶发性肌强直放电；2，>50％的针刺发生肌强直放电；3，几乎所有针刺都发生肌强直放电；以及4，所有针刺都发生肌强直放电。

前肢握力测试

前肢握力用握力计(BIO-GS3；Bioseb,皮内拉斯帕克,佛罗里达州)测量。当小鼠抓住棒时，在数字力传感器上记录峰值拉力(以克计)。在每次测量后，力传感器的计量值被重置为0g。通过小鼠把它的前爪从杆上松开时的计量值记录张力。我们以30秒的间隔执行了三次连续测量。体重测量是并行执行的。通过将握力的平均值除以每只小鼠的体重获得最终值。体重测量是平行执行的，实验是用代码标识的动物执行的，以消除实验偏差。

雷达图

获得的值表示为恢复指数(RI)，它测量了用经处理的HSA^LR小鼠获得的不同参数值与FVB对照组的不同参数值有多接近。得到处理后每只小鼠的不同参数(Mbnl1蛋白、Mbnl1/2表达水平、剪接恢复、Mbnl1ex5包含恢复、和功能恢复)的RI，RI是根据以下公式：％MT值减去X％MNT，再除以(X％MH减去X％MNT)，其中MT是经处理的每只小鼠的值(PBS或寡核苷酸)，MNT是用PBS处理的HSA^LR小鼠的值(PBS)，MH是健康小鼠的值(FVB)。这些值的范围从0到1，其中0是未处理的小鼠(HSA^LR-PBS)，并且1是健康小鼠(FVB)。

Mbnl1蛋白是指通过每个处理组的两种肌肉(股四头肌和腓肠肌)的定量斑点印迹获得的值的平均值。

Mbnl1/2表达水平是指通过实时PCR在两种肌肉(股四头肌和腓肠肌)中获得的基因Mbnl1和Mbnl2的mRNA值的平均值，以及应用前述公式的每组处理的平均值。

剪接恢复是指每组处理的两种肌肉中Nfix外显子7、Atp2a1外显子22和Clcn1外显子7a的平均包含百分比。

Mbnl1 ex5包含恢复是指每组处理的两种肌肉中Mbnl1外显子5的包含百分比。

功能恢复是指处理后每只小鼠的力/体重所获得值的平均值和每组处理的肌强直放电等级。前肢握力测试用于获得力，肌电图用于获得肌强直放电等级。

实施例1

我们之前已经表明，抑制miR-23b-3p或miR-218-5p可以通过使用针对miR-23b-3p(Ax-23b)或miR-218-5p(Ax-218)的具有miR拮抗剂结构的市售抗miR治疗强直性肌营养不良(Cerro-Herreros et al.2018Nat.Commun.26；9(1):2482.doi:10.1038/s41467-018-04892-4.)。用这些拮抗剂转染人DM1细胞并且将其注射到疾病的小鼠模型中，产生了靶miRNA表达的下调，并且伴随着MBNL1(其直接靶点)上调。所用的拮抗剂很长(22nt)，几乎包含miRNA的全部互补序列，并且均由2个OME核苷酸构成。它们在3’端和5’端的核苷酸之间携带硫代磷酸酯键，以提高分子核苷酸部分的稳定性，并且在3’端与作为载体的胆固醇结合，以增强药物代谢动力学行为和细胞内化。为了寻找最有效和最安全的载体，我们将Ax-23b的多核苷酸部分(序列名称：表1中的非缀合-23b)与不同脂质载体在分子的3’端或5’端结合，该脂质载体包括甾醇胆固醇和生育酚；以及脂肪酸棕榈酰酸、硬脂酸、反油酸、亚油酸和油酸(表1中的分子列表)。我们对用这些缀合拮抗剂转染的人DM1细胞进行了筛选(ArandelL.等人(2017).Dis Model Mech 10(4):487-497.)."Immortalized human myotonicdystrophy muscle cell lines to assess therapeutic compounds."Dis Model Mech10(4):487-497.)，以便探究它们对毒性(细胞活力研究)和MBNL1蛋白水平的效果。

将这些分子中的每一种以一系列5种不同的浓度转染到DM1人肌管中，并且定量细胞活力百分比和MBNL1蛋白水平。我们根据抗miR的治疗指数(TI)对其进行了排名，定义如下：

TI＝(TC50/EC50)*Emax

其中：

TC50是化合物将细胞活力降低到模拟(mock)的50％的浓度，

EC50是化合物产生50％ Emax的浓度，

Emax是与模拟(用溶媒转染)相比，用特定抗miR转染后获得的MBNL1蛋白的最大倍数变化。

从这些实验中，我们得出结论：

-与油酸(具有18个碳原子的顺式单不饱和脂肪酸)的缀合是产生最高T指数的缀合(参见表1)。命名为“非缀合-23b”和“5-23B-油酸”的分子的毒性和疗效(MBNL1蛋白水平)曲线显示在图1C和图1B中，用于直接比较。重要的是，与油酸缀合的杂乱(scramble)寡核苷酸(“Sc-油酸”)的低T指数表明油酸本身对T指数没有影响。

-亚油酸(具有18个碳原子的顺式多不饱和脂肪酸)是第二有效的载体。令人惊讶的是，用反油酸(油酸的反式异构体)、棕榈酸(具有16个碳原子的饱和非酯化脂肪酸)和硬脂酸(具有18个碳原子的碳链的饱和脂肪酸)获得的T指数结果显著较低。因此，我们的数据表明，在我们的DM1细胞中，顺式不饱和脂肪酸是更好的抗miR的载体。

-胆固醇是我们测试的唯一在两个不同位置(3’端和5’端)缀合的载体。根据我们的数据，似乎3’端的缀合比5’端的更有效。使用胆固醇衍生物如生育酚并且没有改善T指数。

我们进行了相同的实验，将Ax-218的核苷酸部分(序列名称：表1中的非缀合-218)与不同的脂质载体缀合(表1)。在所有测试的脂肪酸中，油酸被确认为是最好的载体，胆固醇在3’端比5’端的效果更好。然而，值得注意的是，胆固醇与小鼠肝脏中的毒性有关，即使肝脏变化在恢复期后可以变得可逆(参见胆固醇注册档案ECHA，2017年4月4日，可在https://echa.europa.eu/es/registration-dossier/-/registered-dossier/11031/7/6/1#上获得)。然而，由于寡核苷酸的治疗剂量学旨在进行长期处理，胆固醇作为接头可以增加肝脏毒性的风险。相反，油酸具有良好的安全特性，并且已被用作对人体有益的食品添加剂(参见FDA对有关油酸的健康声明请愿书的回复信，2018年11月19日，可在https://www.fda.gov/food/cfsan-constituent-updates/fda-completes-review-qualified-health-claim-petition-oleic-acid-and-risk-coronary-heart-disease上获得)。

一旦我们找到了合适的载体，我们的下一步就是优化抗miR分子中包含的序列和化学修饰，以便与载体缀合。因此，我们也进行了相同的体外筛选，寻找最有效的序列和化学修饰，以提高DM1细胞中非缀合(未缀合)抗miR的T指数。我们生成了一组不同的单链分子(长度在16至22个核苷酸之间)，它们与人类miR-23b-3p或miR-218-5p的不同部分互补。该筛选中包括的分子带有不同的化学修饰，包括LNA、2’OME和2’OME寡核苷酸，并且核苷酸之间的所有连接均是硫代磷酸酯(PS)(表2和表3中测试的分子列表)。

针对miR-23b-3p的T指数评分较好的分子是MD23b-2，在设计用于抑制miR-218-5p的抗miR分子的情况下，评分最好的分子是218-D/LNA2(参见表2和表3)。重要的是，与218-D/LNA2相比，MD23b-2对MBNL1水平(Emax)和T指数的影响显著更高。这些分子的毒性和疗效(MBNL1蛋白的水平)曲线显示在图1A和图1D中。

接下来，我们测试了油酸缀合对最佳评分抗miR序列MD23b-2的影响(表4)。令人惊讶的是，与MD23b-2相比，缀合分子(Ol-MD23b-2)表现出降低的T指数。另一方面，我们观察到油酸与具有PS/PO混合物的寡核苷酸的缀合增加了它们的T指数(表4)。该数据证实，在混合的PS/PO寡核苷酸中，T指数中油酸的作用令人惊讶地显著。

表1

注：(Pro)(Chol)代表羟脯氨酸C5-烷基胆固醇。(Teg)(Chol)代表15个原子的三甘醇胆固醇，取决于所用的间隔分子。

表2

表3

表4

实施例2

接下来，我们在体外针对miR-23b-3p(MD23b-2)和miR-218-5p(218-D/LNA2)选择了表现最好的寡核苷酸，并且对这些分子进行了一些修饰以改善它们的ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)属性，以便评估它们在DM1(HSA^LR)小鼠模型中的体内治疗性潜力。进行修饰的理由如下：

(1)胞嘧啶的甲基化是通过用反义寡核苷酸进行体内处理来抑制免疫系统激活的一种众所周知的方法(Joseph J.Senn等人，Non-CpG-Containing Antisense 2′-Methoxyethyl Oligonucleotides Activate a Proinflammatory Response Independentof Toll-Like Receptor 9or Myeloid Differentiation Factor 88.Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics September 1,2005,314(3)972-979；DOI:https://doi.org/10.1124/jpet.105.084004)。

(2)已知LNA和2’MOE修饰类型的化学修饰核苷酸比标准RNA、DNA或2’OME修饰的寡核苷酸更稳定(W.Brad Wan和Punit P.Seth.2016.The Medicinal Chemistry ofTherapeutic Oligonucleotides)。

(3)在所有体外测试的分子中，核苷酸之间的磷酸二酯(PO)键被硫代磷酸酯(PS)键取代，以增加它们的稳定性和效力。完全修饰的PS寡核苷酸广泛用于体外研究。然而，先前已有报道称，与单个分子中PS键过量相关的一些体内毒性(例如，Smith和Zain.2019.Therapeutic oligonucleotides:State of the Art.Annual Review ofPharmacology and Toxicology,以及Hu等人，2020.Therapeutic siRNA:state of theart.Signal transduction and targeted therapy)和混合寡核苷酸PS/PO已被证明在体内更稳定(Zhang等人,In vivo stability,disposition and metabolism of a“hybrid”oligonucleotide phosphorothioate in rats.Biochemical Pharmacology.Volume 50,Issue 4,1995,Pages 545-556,ISSN 0006-2952,https://doi.org/10.1016/0006-2952(95)00159-W)。因此，为了设计可以在体内模型中测试的反义寡核苷酸，我们决定在随后的体内研究中减少PS键的量。

考虑到这3个标准，我们生成了4种反义寡核苷酸：

-MD23b-2PS/PO，其保留了在MD23b-2中发现的相同化学修饰，但是其PS含量更低，并且所有胞嘧啶均被甲基化。

-MD23b-2V2，序列与MD23b-2相同，但是其在2’处有一些OME修饰被MOE取代，PS含量更低，并且所有胞嘧啶均被甲基化。

-218MOE，具有218-D/LNA2的序列，其全部天然DNA核苷酸被2’MOE取代，所有胞嘧啶均被甲基化，PS含量更低。

-218OME/MOE，具有218-D/LNA2的序列，其全部天然DNA核苷酸被2’MOE或2’MOE取代，所有胞嘧啶均被甲基化，PS含量更低。

使用的这些分子是非缀合的(除了218OME/摩尔)以及与油酸缀合的，以便评估它们在HSA^LR小鼠中的治疗性潜力(DM1的模型，参见Mankodi,A.，等人(2000)."Myotonicdystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat."Science 289(5485):1769-1773.)。具体而言；使用了非缀合的MD23b-2PS/PO，在3’端与油酸缀合的MD23b-2PS/PO(MD23b 2PS/PO 3’Ol)，在5’端与油酸缀合的MD23b-2PS/PO(MD23b-2PS/PO5’Ol)，以评估与油酸缀合的位点对治疗效果的影响。使用非缀合的MD23b-2V2，在3’端与油酸缀合的MD23b-2V2(MD23 b-2V2 3’Ol)，并且在3’端与棕榈酸缀合的MD23b-2V2(MD23b-2V2 3’Palm)，以证实与油酸缀合是否比与棕榈酸缀合产生更强的抗miR的效果，同样在体内进行了评估。两个针对miR-218-5p的抗miR均在3’端与油酸缀合。

将所有这些分子以3mg/Kg的浓度静脉内注射到3-5月龄的HSA^LR小鼠的尾静脉中。在注射前，以及在单次注射后5天处死前评估这些小鼠的力量和肌强直。图2显示了在处死小鼠之前测量的相对于体重归一化的握力(A)和肌强直(B)水平的结果。在所有用抗miR处理的小鼠中，与注射PBS的小鼠相比，强度有所提高，但是这种差异仅在某些抗miR中是统计学显著的。类似地，抗miR处理的小鼠肌强直减少。通过分子MD23b-2V2 3’Ol和218MOE油酸3’实现了肌强直的最重要的减少。对于这两种分子，油酸缀合分子比非缀合版本产生更强的拯救作用，并且当在3’缀合时产生更强的作用。

实施例3

在处死的时刻，解剖了小鼠后肢的股四头肌和腓肠肌，并且对其进行处理，以提取蛋白质和RNA。提取的RNA逆转录后的qPCR，用特异性探针检测miR-23b-3p(图3A)或miR-218-5p(图3b)的水平，显示所有抗miR有效降低其相应miRNA的水平。重要的是，非缀合版本的抗miR往往不如缀合形式的有效。在针对miR-218-5p的抗miR中，218MOE是效果最差的。

实施例4

qRT-PCR用于量化Mbnl1(图4A)和Mbnl2(图4B)转录物在股四头肌和腓肠肌中的表达水平，从这些肌肉中提取的总蛋白质通过定量斑点印迹分析进行蛋白质Mbnl1检测(图4C)。尽管抗miR-23b-3p和抗miR-218-5p在Mbnl1转录物水平上存在微小差异，但是miR-23b-3b抗miR对Mbnl蛋白有更强的作用。重要的是，我们观察到将油酸载体放置在分子MD23b-2PS/PO中的3’或5’处没有差异，并且在分子MD23b-2V2的情况下，非缀合版本明显不如具有油酸或棕榈酰酸的缀合版本有效，并且油酸具有更强的作用，特别是对Mbnl2转录物和Mbnl1蛋白水平。

实施例5

总RNA也被用于分析由Mbnl1蛋白调节的转录物的剪接错误，诸如Atp2a1外显子22、Nfix外显子7、Mbnl1外显子5和氯离子通道(Clcn1)外显子7a(图5和图6)。

在HSA^LR小鼠中，Nfix、Clcn1、Atp2a1和Mbnl1转录物分别显示外显子7、7a、22和5的包含异常地增加，但是在用3mg/kg的MD23-b V2 3’Ol和其他类似分子处理后，它们在肌肉中的含量恢复为正常值的30％至50％。

实施例6

为了分析在模型小鼠中测量的所有DM1相关的功能和分子表型，我们生成了蜘蛛图(图7)，根据以下公式计算处理后的每只小鼠的不同参数(Mbnl1蛋白、Mbnl1/2表达水平、剪接恢复、Mbnl1 ex5包含恢复和功能恢复)的每只个体小鼠恢复指数(RIm)：

其中值_MT是每只经处理(注射PBS或寡核苷酸)小鼠的个体值，是未处理的患病小鼠(注射PBS)的平均值，并且是健康小鼠组(FVB)的平均值。接下来，对单个RI值(RIm)进行平均，以生成图7所示的全局RI值。

这些值的范围从0到1，其中0是未处理的小鼠(HSA^LR-PBS)，并且1是健康小鼠(FVB)。Mbnl1蛋白是指通过每组处理的两种肌肉(股四头肌和腓肠肌)的定量斑点印迹获得的值的平均值。Mbnl1/2表达水平是指应用前述公式通过每组处理的肌肉(股四头肌和腓肠肌)和基因(Mbnl1和Mbnl2)的实时PCR获得的值的平均值。剪接恢复是指每组处理的两种肌肉中Nfix外显子7、Atp2a1外显子22和Clcn1外显子7a的平均包含百分比。Mbnl1 ex5包含恢复是指每组处理的两种肌肉中Mbnl1外显子5的包含百分比。功能恢复是指处理后每只小鼠的力/体重获得值的平均值和每个处理组的肌强直放电等级。

这些图在图7和表5和表6中的表示显示，MD23b-2V2 3’Ol是在所有研究的表型中产生最强拯救的抗miR分子。值得注意的是，当相同的抗miR序列为非缀合或与棕榈酸缀合时的效力差异支持了我们在体外研究中的惊人结果，并且证实了当与油酸缀合时，该分子具有明显更强的治疗效果。表现第二好的分子是MD23b-2PS/PO 3’Ol，略好于MD23b-2PS/PO5’Ol。这些数据也支持体外缀合胆固醇获得的结果，证实了在3’处缀合载体是有益的。正如在体外观察到的，针对miR-218-5p的抗miR产生较低的表型拯救。数据支持抑制miR-23b-3p(图7B和表5)比抑制miR-218-5p(图7B和表6)具有更强的治疗性效果。在分子218MOE的情况下(图7B)，与油酸的缀合也提高了其体内活性。因此，证实了油酸缀合对体内治疗效果的影响不限于特定的含氮碱基序列，而是具有更广泛的应用。

表5

表6

实施例7

在所有测试的抗miR中，我们总是使用含有氨基的间隔分子在油酸与寡核苷酸之间形成酰胺键，以在3’或5’缀合油酸。第一种间隔分子是在3’端和5’端均引入了的6-氨基己基基团(NHC6间隔分子)。接下来，我们测试了其他类型的间隔分子(NHC6、NHC3或苏氨醇)以及在寡聚序列MD23b-2V2和油酸之间添加不同大小(3或6个碳原子)的间隔分子(图8)是否可以改善缀合所得分子对MBNL1蛋白水平的效果。我们观察到产生的所有抗miR(表7、表8和图9中总共4个)能够产生MBNL1蛋白的上调。值得注意的是，使用苏氨醇缀合的分子是最有活性的，因为它在最低浓度下达到EC50，但是具有6个碳的间隔分子(NHC6)对蛋白质的最大上调作用最强。该数据表明，间隔分子的修饰还可以调节本发明的缀合油酸的抗miR的疗效和药效学。

表7

表8

ASO	EC50(μM)	Emax(最大倍数变化)
			MD23b-2 V2 3’Ol	0.062	2.30
MD23b-2 V2 3’Ol(C6SSC6)(NHC3)	0.217	1.96
			MD23b-2 V2 3’O1(C6SSC6)(NHC6)	0.164	3.05
MD23b-2 V2 3'Ol(苏氨醇)	0.007	1.98

实施例8

尽管寡核苷酸的合成方法在本领域是众所周知的，我们在此提供了一个合成MD23b-2V23’Ol的实施例，MD23 b-2V23’Ol是16nt长的寡核苷酸，由通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接的LNA、2’-O-MOE和2’-O-Me修饰的核苷酸组成。其3’端被油酸部分修饰(图10)。该油酸是通过将活化的羧酸缀合到前体寡核苷酸3’端的己基氨基间隔分子上而引入的。MD23b-2V23’Ol的合成是基于使用核苷酸和间隔分子-GPG的固相合成。这个过程包括两个主要步骤。

首先，合成序列AbsTbs(5Mc)s(5Mc)sCmTbGmsgsCmsAbAmTbGbTmsGbsAb(NH2C6)的未缀合寡核苷酸(前体)。被认为是链中结构单元的第一个亚磷酰胺通过催化缩合反应连接到固体表面。该步骤将重复与最终序列的核苷酸长度一样多的次数。在这种情况下，是16次。完成固相合成后，生产包括以下步骤：切割和脱保护、纯化、脱盐。

其次，缀合油酸。在上一步骤的经脱盐的未缀合寡核苷酸与油酸缀合后，将其纯化、脱盐和冻干。

实施例9

1.1通过ELISA对MD23 b-2V23’Ol进行定量

使用了MD23b-2V2和MD23 b-2V23’Ol。对HSA^LR小鼠静脉内施用12mg/kg剂量的化合物。14天后，对所有小鼠实施安乐死，取出它们的大脑、肾脏、肝脏、腓肠肌和股四头肌，称重并冷冻用于进一步处理。实验由研究者以盲法方式进行。在尸检程序期间，从所有实验组收集大脑、肌肉(股四头肌和腓肠肌)、肾脏和肝脏的样品。样品收集后称重，以克为单位，精确到小数点后3位。将每一块置于无RNase的试管中，并且快速冷冻(例如，2ml无RNase的Eppendorf试管)。

1.1.1样品制备

1)取出组织并在磷酸盐缓冲盐水中清洗。

2)在吸水纸上干燥组织并称重(每个组织取20mg；在大脑的情况下，每个组织取30mg)。

3)每10mg组织加入100μL补充有PhosSTOP EASYpack和Complete ULTRA Tablets,Mini,EASYpack的RIPA缓冲液(每10mL RIPA缓冲液各1片)。

4)使用组织研磨机在2ml Eppendorf管中匀浆组织20秒，在5000RPM下4次，或者直到组织完全匀浆化。

5)将匀浆物在55℃下孵育过夜。

6)以15000rpm离心匀浆物15分钟，将上清液等分，并且将等分试样储存在-20℃下以备分析。

对于肌肉裂解物，使用实际匀浆物在寡核苷酸稀释缓冲液中以1/10稀释。如果样品高于定量限，则采用1:40的稀释度。

对于大脑，使用1/5的稀释度，对于肝脏和肾脏，使用1:400的稀释度。

1.1.2标准曲线的储备液制备

在标准曲线的储备液制备情况下。首先，制备20μM的MD23b-2V23’Ol的储备液。对于标准曲线制备，使用1μM浓度。因此，将20μM储备液在水中稀释至1μM的最终体积，并且以不同的等分试样储存。对于每个实验，制作新鲜的标准曲线，为此有必要每次在65℃下加热1μM储备液15分钟。另一方面，在制备组织匀浆物后，将55μL匀浆物加入5445μL化合物稀释缓冲液中，得到对照组织匀浆物。

1.1.3标准曲线的制备

为此，需要对照组织匀浆物来制备标准稀释液。然后，为了制备连续稀释液，将1μM所需化合物在65℃下变性15分钟，并且涡旋至少30秒。然后将32μL该变性化合物稀释在968μL对照匀浆物中。这是标准曲线的第一个点(32000pM)。然后对于下一个点，将500μL的32000pM稀释在500μL化合物稀释缓冲液中(16000pM)。通过这种类似的方式，制备8000pM、4000pM、2000pM和1000pM。

表9：ELISA设计

1.1.4QC

每次运行三个QC水平(L、M、H)，一式三份

验收标准：

≥67％的QC应当为标称(理论)值的±30％。

1.1.5ELISA方案

-探针miR-23b TbsCsAsCbsAsTsTbsGsCsCbsAsGsGbsGsAsTb-地高辛NHS酯(在水中储备液为100μM，并且在水中对该储备液制备1μM)需要在65℃下加热15分钟并且涡旋30秒。

-开始实验前，制备样品匀浆物和寡核苷酸连续稀释液。

-在杂交缓冲液中以0.5nM的浓度稀释探针(1μM)。

-添加70μL所需化合物的每种稀释液，一式三份；如果是样品匀浆物，则以一式两份添加。然后加入70μL浓度为0.5nM的探针。

-用PCR膜密封板，并且在37℃下孵育30分钟(这是探针与化合物杂交的重要步骤！)——在这一步之前，我们可以在普通的透明96孔板中进行。

-然后立即将100μL杂交溶液转移到黑色的中性链霉亲和素包被板上。

-然后再次用PCR膜密封板，并且在37℃下孵育30分钟(这是将生物素与抗生物素蛋白包被的板结合的重要步骤)。

-在孵育步骤期间，在微球菌核酸酶稀释缓冲液(1.6μL核酸酶+16ml缓冲液)中制备微球菌核酸酶。这个计算是对整个板进行的。

-首先取出液体，用100μL洗涤缓冲液洗涤板6次，然后通过保持板倒置使用吸水纸干燥板，并且在每个孔中加入150μL微球菌核酸酶(最终量为30U/孔)。

-加入微球菌核酸酶后，用PCR膜密封板，并且在37℃下孵育板1小时(该步骤足以裂解至少99％的单链探针)。

-制备含有0.25％吐温20的TBS缓冲液和抗体(抗地高辛抗体，罗氏#11093274910)，充分涡旋，并且将其置于室温下。对于不需要的其余量，可以以等分试样保存在冰箱中。

-首先取出液体，然后用100μL洗涤缓冲液洗涤板6次，干燥板并加入150μL在TBS缓冲液(含0.25％v/v吐温20)中以1/5,000稀释的抗地高辛抗体(与碱性磷酸酶缀合)。

-用PCR膜密封板，并且在37℃下孵育30分钟。

-为了制备Attophos底物，通过添加60ml Attophos缓冲液稀释36mg粉末(在瓶中)，并且在冰箱中避光保存(最好用铝箔包裹)。

-取出液体，用100μL洗涤缓冲液洗涤板6次，干燥板并加入150μL Attophos底物(在Attophos缓冲液中以1:1的比例稀释)。

-用PCR膜密封板，然后用铝箔包裹，在室温(RT)下孵育40分钟。然后使用SynergyH1(Biotek)测定荧光强度。使用444nm激发和555nm发射。每孔延迟1秒，在60分钟、70分钟、80分钟和90分钟时执行连续读数。

表10：大脑、腓肠肌、股四头肌、肾脏和肝脏中MD23b-2V2 3’Ol和MD23b-2V2的平均值(ng/g)

测试项目	处理时间(天数)	剂量(mg/kg)	组织	化合物(ng/g)
					MD23b-2V2 3’Ol	14	12	大脑	289.9
MD23b-2V2 3’Ol	14	12	腓肠肌	25657.9
					MD23b-2V2 3’Ol	14	12	股四头肌	15827.7
MD23b-2V2 3’Ol	14	12	肾脏	74971.6
					MD23b-2V2 3’Ol	14	12	肝脏	183881.1
MD23b-2V2	14	12	大脑	0.0
					MD23b-2V2	14	12	腓肠肌	2705.2
MD23b-2V2	14	12	股四头肌	1790.2
					MD23b-2V2	14	12	肾脏	18840.3
MD23b-2V2	14	12	肝脏	39570.1

表11：MD23B-2V2 3’OL相比MD23b-2V2的递送效率的倍数变化

*根据化合物MD23b-2V2的量计算了倍数变化

结果和图11

我们已经观察到在施用14天后，在肌肉(腓肠肌和股四头肌)以及肝脏和肾脏中存在这两种化合物。在所有组织中，对照组均低于定量限。而化合物MD23 b-2V2 3’Ol是唯一能够到达大脑的化合物。在组织递送方面，MD23b-2V2 3’Ol化合物优于MD23 b-2V2，因为它能够更有效地到达所有组织，包括腓肠肌、股四头肌、肝、肾和大脑。虽然我们在所有组织中检测到更高量的MD23b-2V2 3’Ol，但是其向腓肠肌和股四头肌的递送分别是MD23 b-2V2的9.5倍和8.8倍。相比之下，向肾脏和肝脏的递送分别仅为4倍和4.5倍，表明与疾病中不太相关的组织相比，向肌肉的递送增强。MD23b-2V2 3’Ol能够到达大脑，而MD 23b-2V2没有，这表明与油酸的缀合有利于其到达该组织。综上所述，我们得出结论，油酸改善了化合物的递送，最重要的是，油酸改善了其对涉及病理的组织诸如肌肉和大脑的递送。

实施例10：非人类灵长类大脑中MD23 b-2V2 3’OL和MBNL1蛋白水平的测定

本研究的目的是使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定用MD23b-2V2 3’OL处理的动物的大脑中的暴露量。此外，通过量化来自非人类灵长类动物大脑的肌盲样1型(MBNL1)蛋白水平来测量经处理动物的大脑上的靶标接合。

1.实验设计

1.1实验组和给药

为此，将大约24至50个月的总共8只食蟹猴(4只雄性和4只雌性)分成3组实验组，并且还进行分配到1期(最大耐受剂量(MTD)组分配)和2期(固定剂量(FD)组分配)。在1期(最大耐受剂量[MTD]阶段)，一只雄性和一只雌性亚洲食蟹猴被分配到第1组，并且在非禁食条件下，以上升剂量设计，在MTD阶段的第1天、15天、29天和43天以5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和20mg/kg的剂量以5mL/kg的剂量体积静脉内施用(缓慢推注[10分钟])。

MTD阶段完成后，将亚洲来源的三只雄性和三只雌性食蟹猴分配到2期(固定剂量阶段)的第2组和第3组，并且在2期的第1天和第22天，在非禁食条件下以5mL/kg的剂量体积静脉内施用溶媒(磷酸盐缓冲溶液[PBS，pH：7.4])或20mg/kg MD23 b-2V2 3’Ol(缓慢推注[10分钟])。

在处死当天，在尸检程序期间收集大脑样品。

分组和剂量水平

表12：1期：最大耐受剂量(MTD)分组

表13：2期：固定剂量(FD)分组

2.实验数据

2.1实验程序

2.1.1样品收集

收集第1组至第3组的所有动物的大脑用于ELISA定量、MBNL1研究和潜在脱靶的测定。1期动物最后一次施用后两周，2期动物处理期结束后3周。将每一块放入单独的无核糖核酸酶的Eppendorf试管中，在液氮中冷冻并在(-80±10℃)下储存。总共产生了8个大脑样品。

2.1.2ELISA定量

2.1.2.1样品制备

1)取出组织并在磷酸盐缓冲盐水中清洗。

2)在吸水纸上擦干组织并称重(每个组织取20mg)。

5)将匀浆物在55℃下孵育过夜。

6)以15000rpm离心匀浆物15分钟，等分上清液，并且将等分试样储存在-20℃下以备分析。

对于大脑裂解物，使用的实际匀浆物为1/5稀释液(80μL+320μL寡核苷酸稀释缓冲液)。

2.1.2.2标准曲线的储备液制备

在标准曲线的储备液制备情况下。首先，制备20μM的MD23b-2V2 3’Ol的储备液。这可以在-20℃下储存更长时间。由该20μM的储备液中，我们可以根据需要进行若干次稀释。对于标准曲线制备，我们需要1μM。因此，将20μM储备液在水中稀释至1μM的最终体积，并且以不同的等分试样储存。对于每个实验，我们需要制作新鲜的标准曲线，为此，我们需要每次在65℃下加热1μM储备液15分钟。另一方面，在制备组织匀浆物后，在5445μL化合物稀释缓冲液中加入55μL组织匀浆物作为对照。

2.1.2.3标准曲线的制备

为此，我们需要对照组织匀浆来制备标准稀释液。然后制备连续稀释液，首先取1μM所需化合物，在65℃下变性15分钟，并且涡旋至少30秒。然后取16μL该变性化合物，并且将其稀释在984μL对照匀浆物中。这是标准曲线的第一个点(16000pM)。然后，对于下一个点，取500μL的16000pM，并且将其稀释在500μL的PMO稀释缓冲液中(8000pM)。通过这种类似的方式，制备4000pM、2000pM、1000pM和500pM。

表14：

2.1.2.4QC

每次运行三个QC水平(L、M、H)，一式三份。验收标准：

≥67％的QC应当为标称(理论)值的±20％，并且每个水平≥50％的QC应当为其标称浓度的±20％。

2.1.2.5ELISA方案

-在开始实验之前，制备样品匀浆物和寡核苷酸连续稀释液。

-在杂交缓冲液中以0.5nM的浓度稀释探针(1μM)。

-添加70μL所需化合物的每种稀释液，一式三份，如果是样品匀浆物，则以一式两份添加。然后加入70μL浓度为0.5nM的探针。

-然后立即将100μL的杂交溶液转移到黑色的中性链霉亲和素包被板上。

-然后再次用PCR膜密封板，并且在37℃下孵育30分钟(这是将生物素与抗生物素蛋白包被的板结合的重要步骤！)

-在孵育步骤期间，在微球菌核酸酶稀释缓冲液中制备微球菌核酸酶(1.6μL核酸酶+16ml缓冲液)。这个计算是对整个板进行的。

-制备含有0.25％吐温20的TBS缓冲液和抗体，充分涡旋，并且将其置于室温下。对于不需要的剩余量，可以将其以等分试样保存在冰箱中。

-用PCR薄膜密封板，并且在37℃下孵育30分钟。

-为了制备Attophos底物，通过添加60ml Attophos缓冲液稀释36mg粉末(在瓶中)，并且将其在冰箱中避光保存(最好用铝箔包裹)。

-用PCR膜密封板，然后用铝箔包裹，在室温(RT)下孵育40分钟。然后使用SynergyH1(Biotek)测定荧光强度。使用444nm激发和555nm发射。每孔延迟1秒，在40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟和90分钟时进行连续读数。

2.1.2.6ELISA测定法的验收标准

分析方法的准确度描述了通过该方法获得的测试结果平均值与分析的真实值(浓度)的接近程度。精确度由测量的相对误差(RE％)来估计。两种ELISA测定法的参考对照的真实值与仅基于计算的理论浓度不一致。因此，对照的标称浓度将被计算为所有分析批次中每个浓度水平的所有参考样品集合的平均值。

分析方法的精度描述了当该程序重复应用于单个均一体积的生物基质的多个等分试样时，分析物的单个测量值的接近程度。精密度由变异系数(CV％)来估计。

表15：

2.1.3MBNL测定

2.1.3.1蛋白提取

用TissueLyser II(QIAGEN)以机械方式分解NHP大脑样品，并且在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏，货号11873580001和4906845001)的RIPA缓冲液(赛默飞世尔科技，货号89900)中均质化。以牛血清白蛋白为标准品，用PierceTM BCA蛋白检测试剂盒(货号23225)定量总蛋白。

2.1.3.2蛋白质印迹：

对于MBNL1蛋白和GAPDH蛋白(用于归一化的内部对照)的免疫检测，通过在100℃下热处理5分钟使每个动物样品的15μg总蛋白变性，通过在12％ SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，随后转移到0.45μm硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。

使用添加5％脱脂乳的PBS-T(8mM Na2HPO4、150mM NaCl、2mM KH2PO4、3mM KCl、1％吐温20，pH 7.4)封闭膜1小时。封闭后，将膜与抗MBNL1小鼠一抗(1:200，MB1a(4A8)(DSHB,爱荷华市,爱荷华州)在4℃下孵育过夜。与一抗孵育后，在室温下与缀合辣根过氧化物酶的抗小鼠二抗(1:3500，(HRP)-缀合的抗小鼠IgG二抗，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)孵育1小时。最后，使用增强化学发光底物(ECL,Pierce)进行可视化，并且使用ImageQuant 800Amersham设备(GE Healthcare)获取图像。

在检测到对应于MBNL1的免疫反应条带后，剥离膜以去除目前使用的抗体，并且检测到对应于用作归一化物的GAPDH蛋白的条带。在封闭(如上所述进行)之后，使用缀合HRP的抗GAPDH抗体(1:3500，克隆G-9，Santa Cruz)进行该检测。对于HRP缀合的抗GAPDH抗体，孵育时间持续1小时，在室温下进行。分析一式两份地执行。

2.1.3.3量化：

使用分析软件ImageJ对所有图像进行量化。首先将每个样品的MBNL1蛋白量的结果基于GAPDH归一化，并且将该比率基于未处理动物的比率平均值进行归一化(相对蛋白水平)。

3.结果

3.1测定来自NHP大脑的MD23 b-2V2 3’Ol

表16：最后一次处理后第14天(第1组)和第21天(第2组和第3组)食蟹猴大脑中MD23 b-2V2 3’Ol的浓度(nM，ng/mg，ng/g)。

在1次分析运行中将来自8只动物的8个样品在1个板中进行分析，以用于通过ELISA测定MD23 b-2V2 3’Ol。所有样品均以一式三份测量。分析运行符合验收标准。

在分析期间，阶段I和阶段II的所有经处理的动物均表现出一定的测试项目水平。来自对照组的动物的大脑中没有表现出可量化水平的MD23b-2V2 3’OL。

在固定剂量期间，以20mg/kg处理的所有动物在所有测试大脑中呈现出一定的测试项目水平。对于来自MTD的动物，雄性(P0001)呈现出高于定量限的水平。

3.2MBNL1相对水平

表17：MBNL1相对水平。阶段I和阶段II的平均值。

在最后一次给药后两周收集的样品中，对第1组的MBNL1蛋白水平进行定量。结果显示，与来自未处理动物的样品相比，测试大脑中的MBNL1蛋白水平更高(表18，图12)。大脑中蛋白质水平是对照组的2倍。当与未处理的动物相比时，测试项目在大脑中产生了导致MBNL蛋白增加的药理学效应，并且在给药后2周和3周仍然存在MBNL蛋白增加。雄性和雌性的结果相似。

4.论述和结论

通过ELISA进行定量的结果显示，在最后一次静脉内施用MD23 b-2V2 3’Ol后2周和3周，处理组(第1组和第3组)在大脑中具有可定量的MD23b-2V2 3’OL水平。此外，在最后一次施用后2周和3周，与未处理的动物相比，经处理的动物在大脑中具有更高的MBNL1蛋白水平。这些结果证实了用MD23b-2 V2 3’OL处理的动物大脑中测试项目存在并具有活性。

Claims

1.一种油酸分子，所述油酸分子在缀合至寡核苷酸分子或其类似物的3’端和/或5’端时用作药学上可接受的媒介或载体，其中所述寡核苷酸分子或其类似物是通过疗法进行治疗的方法的活性成分。

2.根据权利要求1所述的用途的油酸，其中所述寡核苷酸分子或其类似物包含化学连接核苷酸的硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合物，并且其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。

3.根据权利要求1或2所述的用途的油酸，其中所述寡核苷酸分子或其类似物是微小RNA的拮抗剂。

4.根据权利要求3所述的用途的油酸，其中所述微小RNA是人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途的油酸，其中当经由静脉内、动脉内或皮下途径施用所述寡核苷酸分子或其类似物时，用作媒介的所述油酸将所述寡核苷酸分子或其类似物递送至有此需要的对象的肌肉和/或CNS细胞。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的油酸，其中所述通过疗法进行治疗的方法包括预防或治疗肌肉疾病、神经系统疾病、和/或RNA病。

7.根据权利要求6所述的用途的油酸，其中所述疾病是强直性肌营养不良症。

8.根据权利要求7所述的用途的油酸，其中所述强直性肌营养不良症为1型强直性肌营养不良。

9.一种寡核苷酸分子、或两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，所述寡核苷酸分子在其3’端和/或5’端与至少一种油酸分子缀合，其中所述寡核苷酸分子是人hsa-miR-23b-3p或人hsa-miR-218-5p的拮抗剂，长度为10个至30个核苷酸，并且包含由与SEQ IDNO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)或SEQ ID NO：52-110中存在的区域的序列具有至少80％的同一性的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

10.根据权利要求9所述的寡核苷酸分子，还包含化学连接所述核苷酸的硫代磷酸酯键与磷酸二酯键的混合物，其中通过硫代磷酸酯键化学连接的核苷酸数目大于通过磷酸二酯键化学连接的核苷酸数目。

11.根据权利要求9或10任一项所述的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子包含由与SEQ ID NO：1(抗miR-218-5p)或SEQ ID NO：2(抗miR-23b-3p)中存在的区域的序列完全相同的核苷酸的一连串至少15个连续氮碱基构成的片段。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子与SEQID NO：22、23或25具有至少80％的同一性，并且其中所述SEQ ID NO：22、23或25中定义的间隔分子优选地选自由NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、及其衍生物组成的组。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子与SEQID NO：22、23或25具有至少80％的同一性，其中所述SEQ ID NO：22、23或25中定义的间隔分子优选地选自由NHC3、NHC5、NHC6、苏氨醇、及其衍生物组成的组，并且其中所述寡核苷酸分子能够增加MBNL1和/或MBNL2蛋白的内源性水平。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸的核苷酸序列由SEQ ID NO：3、4或7组成。

15.一种组合物，优选药物组合物，包含至少一种权利要求9至14中任一项所述的寡核苷酸分子或两种或更多种所述寡核苷酸分子的混合物，任选地还包含载体和/或一种或多种药学上可接受的赋形剂。

16.用于治疗用途的权利要求15所述的组合物。

17.权利要求15所述的组合物，当将所述组合物经由静脉内、动脉内或皮下途径施用时，所述组合物用于靶向有此需要的对象的肌肉细胞和/或中枢神经系统细胞。

18.权利要求15所述的组合物，所述组合物用于预防或治疗肌肉疾病、神经系统疾病、和/或RNA病。

19.根据权利要求18所述的用途的组合物，其中所述疾病是强直性肌营养不良症。

20.根据权利要求19所述的用途的组合物，其中所述强直性肌营养不良症为1型强直性肌营养不良。