CN119791126B - 4,15-二乙酰基疣孢菌醇在除草剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及4,15‑二乙酰基疣孢菌醇在除草剂中的应用。本发明发现单端孢霉烯类化合物4,15‑二乙酰基疣孢菌醇对大田主要禾本科杂草的除草活性，具有发展成为天然绿色生物类选择除草剂的潜力。

Description

4,15-二乙酰基疣孢菌醇在除草剂中的应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及4,15-二乙酰基疣孢菌醇在除草剂中的应用。

背景技术

杂草对农业生产构成了严重威胁，不仅与作物竞争养分和光照，同时也是多种病虫害的宿主。除草剂作为现代农业中控制杂草的重要手段也同样面临着诸多问题与挑战。随着除草剂的广泛使用，杂草逐渐进化出抗药性，这一问题日益严重。抗药性杂草的出现使得原本高效的除草剂效果大打折扣，甚至完全失效。抗药性杂草的蔓延不仅增加了除草成本，还迫使农民使用更高剂量或更多种类的除草剂，进而加剧环境污染和生态破坏。研发新型作用机制及靶标的除草剂是解决这一问题的有效方法，天然来源的具有除草活性的化合物为开发新型除草剂提供了宝贵的资源，其中真菌毒素作为除草剂的重要来源之一，其具备作用机制独特，有选择性，能精准除草，保护作物等特点，并且真菌资源丰富，这为开发新型选择性除草剂提供了更多可能。

选择性除草剂是指在一定剂量和使用条件下，能够选择性地杀死或抑制某些杂草种类，而对作物或其他目标植物相对安全的除草剂。该类除草剂能特异性地识别并作用于杂草，精准去除田间杂草，减少杂草与作物争夺养分、水分、光照等资源，保障作物正常生长，提高作物产量和品质，对特定作物相对安全，在有效防除杂草的同时，不会对目标作物造成显著伤害，降低了除草作业对作物的风险。精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵等除草剂均对双子叶作物田中马唐、稗草、看麦娘等单子叶杂草具有良好的防除效果。精喹禾灵和高效氟吡甲禾灵选择性机制主要体现在：一是吸收传导上，禾本科杂草叶片形态与结构利于药剂吸收，且维管束系统使药剂能快速传导至生长点等部位，而阔叶作物吸收少、传导慢；二是生理上，禾本科杂草的乙酰辅酶A羧化酶对其极为敏感，药剂能抑制杂草脂肪酸合成，而阔叶作物该酶不敏感且自身代谢解毒能力强，不易受伤害。但长期使用同一种或同一类选择性除草剂，易使杂草产生抗药性，导致除草效果下降，增加除草难度和成本，并且也可能对农田中的有益昆虫、蚯蚓等非靶标生物产生毒害作用，破坏农田生态平衡。

因此，开发新型选择性除草剂意义重大，能更精准除草，提高作物产量与品质，降低对非靶标生物及环境的影响，减少农药残留与污染；还可应对杂草抗药性问题，降低除草成本，助力农业可持续发展，保障粮食安全，推动绿色农业进步。

发明内容

鉴于此，本发明提供了4,15-二乙酰基疣孢菌醇在除草剂中的应用。本发明从一株真菌中发现了一个单端孢霉烯类化合物4,15-二乙酰基疣孢菌醇，并公开了该化合物的制备方法及其对大田主要禾本科杂草的除草活性，该化合物具有发展成为天然绿色生物类除草剂的潜力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明保护4,15-二乙酰基疣孢菌醇（4,15-Diacetylverrucarol）在抑制杂草生长中的应用。

本发明利用硅胶、凝胶柱层析、结合重结晶、高效液相色谱技术对一株来源于青稞病原真菌禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）的次级代谢产物进行分离纯化，制备得到单端孢霉烯类化合物；借助高分辨质谱，核磁共振谱及X-ray单晶衍射，对该单端孢霉烯类化合物进行了结构鉴定并将其命名为4,15-二乙酰基疣孢菌醇（4,15-Diacetylverrucarol）；所述单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol对常见禾本科杂草：马唐、千金子、日本看麦娘和稗草均具有显著的除草活性，所述4,15-二乙酰基疣孢菌醇分子结构如下：

。

进一步，所述的4,15-Diacetylverrucarol的制备方法，具体步骤如下：

（1）菌种发酵

将菌种禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）DGC接种于PSA（马铃薯蔗糖固体培养基）中进行活化，将活化菌株接入大米培养基进行固体发酵；

（2）萃取浓缩

步骤（1）完成后将菌体与培养基一同放入乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩萃取液，上述过程重复三遍后得到粗提物浸膏。

（3）分离纯化

将步骤（2）所得粗提物用甲醇、二氯甲烷等有机溶剂溶解，按质量1:1.2的比例与硅胶（200-300目）混合均匀，放入通风橱中自然风干，之后将其碾碎成粉末。以拌样与装柱硅胶按1:20的比例使用干法上样进行装柱。分别采用二氯甲烷和甲醇100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32和0:100比例的流动相，得到极性由小到大的8个组分Fr.1-Fr.8。将组分Fr.2经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离，然后通过重结晶制备得到单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol。

第二方面，本发明保护前文所述的4,15-二乙酰基疣孢菌醇（4,15-Diacetylverrucarol）在制备除草剂中的应用。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有其他抑制杂草生长的相关活性成分。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有安全剂或生长调节剂等相关活性成分。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有农药上可接受的载体或辅料。

第三方面，本发明保护一种除草剂，所述除草剂中含有单端孢霉烯类化合物4,15-二乙酰基疣孢菌醇。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有其他抑制杂草生长的相关活性成分。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有安全剂或生长调节剂等相关活性成分。

在具体的实施方案中，所述除草剂中还含有农药上可接受的载体或辅料。

第四方面，本发明保护一种防治杂草的方法，通过将4,15-二乙酰基疣孢菌醇或含有4,15-二乙酰基疣孢菌醇的除草剂施用于杂草生长区域来实现。

在具体的实施方案中，所述草主要为禾本科杂草。

在更具体的实施方案中，所述禾本科杂草为马唐、千金子、日本看麦娘、稗草等。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供的单端孢霉烯类化合物的应用，具有以下有益效果：(1)通过SciFinder数据库检索，与已报道此类化合物的比较，本发明真菌来源的单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol为首次报道的具有选择除草活性；(2)本发明提供的制备方法可以高效准确的对目标单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol进行分离纯化；(3)单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol对马唐、千金子、日本看麦娘和稗草等禾本科杂草的生长具有明显的抑制活性；对作物生长未产生抑制及影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol的分子结构。

图2为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol的高分辨质谱图。

图3为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol的X-ray图。

图4为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol对马唐生长的抑制作用。

图5为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol对稗草生长的抑制作用。

图6为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol对醴肠生长的抑制作用。

图7为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol对反枝苋生长的抑制作用。

图8为本发明化合物4,15-Diacetylverrucarol未对作物（大豆）生长产生抑制作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例1：4,15-Diacetylverrucarol分离纯化的具体过程

（1）菌种活化及大规模发酵

供试菌株禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）DGC接种于PSA（马铃薯蔗糖固体）培养基上，25℃恒温培养箱中黑暗培养3天，用打孔器在菌落边缘生长活性最好的地方打孔，菌落直径为6 mm。将菌落进行转接，放置于新的PSA固体培养基平板中央，25℃恒温培养箱中培养5-7天。

用打孔器在活化好的菌株边缘取菌块，将其放入大米培养基中，在25℃恒温黑暗中静置发酵12天。

（2）萃取及分离纯化

将发酵完成后的菌体与培养基整体放入三倍体积的乙酸乙酯中进行萃取，减压浓缩萃取液并重复萃取浓缩三次后得到粗提物浸膏。

将所得粗提物用甲醇溶解，按质量1:1.2的比例与硅胶（200-300目）混合均匀，放入通风橱中自然风干，之后将其碾碎成粉末。以拌样与装柱硅胶按1:20的比例使用干法上样进行装柱。分别采用二氯甲烷和甲醇100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32和0:100比例的流动相，得到极性由小到大的8个组分Fr.1-Fr.8。将组分Fr.2（二氯甲烷:甲醇=100:1）经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离，然后通过重结晶制备得到单端孢霉烯类化合物4,15-Diacetylverrucarol。

（3）化合物结构鉴定

通过高分辨质谱、一维核磁共振谱、X-ray单晶衍射确定了化合物4,15-Diacetylverrucarol的分子结构（图1）。核磁共振氢谱数据为：¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz):δ 5.75 (dd, J = 7.9, 3.6 Hz, 1H), 5.45 – 5.41 (m, 1H), 4.16 (d, J = 12.3 Hz,1H), 4.04 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 5.6Hz, 1H), 3.13 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.82 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.53 (dd, J =15.5, 7.8 Hz, 1H), 1.71 (s, 4H), 0.80 (s, 3H)。碳谱数据为：¹³C NMR (CDCl₃, 125MHz): δ_C170.9, 170.8, 141.0, 118.3, 79.1, 75.3, 66.8, 65.4, 63.6, 48.7, 48.0,43.1, 36.6, 28.0, 23.3, 21.2, 21.1, 6.7。化合物4,15-Diacetylverrucarol的高分辨质谱图见图2。化合物4,15-Diacetylverrucarol的X-ray单晶衍射图见图3。

实施例2：4,15-Diacetylverrucarol对杂草及作物（大豆）的生长抑制作用

将4,15-Diacetylverrucarol用甲醇配制成1 g/L的母液，用清水分别稀释为0.05、0.1、0.2 g/L的溶液用于喷施，设置清水喷雾对照，每个处理重复3次。

采用室内整株生物测定法，在规格为7.0×7.0×7.8 cm的塑料盆钵中装满沙土与营养基质按2:1比例混合均匀的营养土（pH=6.3，有机质含量1.1%），将装好土的盆钵放入塑料盒中并让盆钵提前吸水至饱和，在吸好水的盆钵中均匀地各撒20粒杂草种子和10粒大豆种子，在播种后需在种子表面覆盖一层细土，将完成播种的盆钵连同塑料盒子一起置于室内自然光照培养箱中培养，培养温度为白天30 ℃，夜晚25 ℃，待植株长至3叶期进行间苗，定至10株/盆，2天后，用3WP-2000行走式喷雾塔（有效喷幅350 mm，喷雾高度300 mm，喷头流量390 mL/min，喷头前进速度291 mm/s）对植株进行茎叶喷雾处理。待药剂晾干，放回温室培养，施药24 h后上水。药剂处理后21天，将植株地上部分剪下并进行称量记录，按公式1计算鲜重抑制率。利用SPSS软件计算GR₁₀、GR₉₀，按公式2计算选择性指数(Z)分析药剂对大豆的安全性。当Z＜2表示对大豆不安全；当2＜Z＜4表示对大豆相对安全；当Z＞4表示对大豆安全。

鲜重抑制率（%）=（对照组鲜重-处理组鲜重）/对照组鲜重×100 ——公式1

选择性指数（Z）=抑制大豆10%的剂量/抑制杂草90%的剂量 ——公式2

结果见图4-8及表1-3。

表1结果表明，化合物4,15-Diacetylverrucarol对马唐和稗草均具有明显的生长抑制作用。其中，在0.1 g/L浓度下对马唐和稗草的鲜重抑制率为92.87%和91.41%，对大豆的鲜重抑制率为3.24%。施药后目测观察，大豆鲜重与对照组差异不显著，未见明显抑制生长。

由表3可知，4,15-Diacetylverrucarol茎叶处理对大豆和杂草之间的选择性指数为2.67，表明4,15-Diacetylverrucarol对大豆相对安全。表2结果表明，4,15-Diacetylverrucarol对禾本科与阔叶类杂草具有显著不同的生物毒性。4,15-Diacetylverrucarol对禾本科杂草具有良好的生物活性，而对阔叶类杂草抑制效果不佳，在常规使用剂量下几乎无法产生显著的除草效果，相较于禾本科杂草，需要投入远超数倍乃至十倍毒素剂量才能达到相同的防除效果。但在实际操作中，高剂量用药不经济，还易引发土壤污染、生态失衡等问题，所以基本可判定该毒素对阔叶类杂草无效。因此，4,15-Diacetylverrucarol具备作为选择性防除禾本科杂草的除草剂候选靶标的潜力。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (6)

1.4,15-二乙酰基疣孢菌醇在抑制杂草生长中的应用，所述杂草为马唐或稗草。

2.4,15-二乙酰基疣孢菌醇作为活性成分在制备除草剂中的应用，所述草为马唐或稗草。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述除草剂中还含有其他抑制杂草生长的相关活性成分。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述除草剂中还含有安全剂或生长调节剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述除草剂中还含有农药上可接受的辅料。

6.一种防治杂草的方法，其特征在于，将含有4,15-二乙酰基疣孢菌醇的除草剂施用于杂草生长区域来实现，所述杂草为马唐或稗草。