CN119799903A - 用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合、试剂盒及方法，所述用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合包括血源孪生球菌，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌。用于预测肺癌转移的试剂盒，包括用于检测呼出气冷凝液样品提取溶液中血源孪生球菌，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌的含量所需的内标物。通过本发明涉及的组合标志物，能够对肺癌转移的诊断具有高灵敏、高特异性特征。

Description

用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合、试剂盒及 方法

技术领域

本发明涉及肺癌转移预测方法，具体涉及一种用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合、试剂盒及方法。

背景技术

肺癌转移是指癌细胞从原发肿瘤部位脱落，通过血液循环或淋巴系统等途径，迁移到身体其他部位并在那里继续生长，形成新的肿瘤病灶的过程。转移与否是判断预后的重要指标，如果肺癌暂未扩散和转移，则相对应预后越好。但是如果未得到及时治疗，肺癌转移发展到中晚期，出现明显的扩散和转移，则预后较差，对患者生存时间的影响较大。因此如何早期、准确的鉴别肺癌转移与否是当前临床研究的热点和难点。

目前临床上诊断和鉴定肺癌转移的方法包括影像学检查和病理检查等，其中最常用的方法是采用CT扫描，它可以清晰地显示肺部原发肿瘤的大小、形状、位置，同时也能够发现身体其他部位的转移灶，如肝脏、骨骼等部位的转移。但是该方法受诊断者水平和仪器精度的影响，其敏感性较低，主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊，因此发展新型高灵敏的肺癌转移诊断技术具有十分重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合、试剂盒及方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合，包括血源孪生球菌 ，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌。

用于预测肺癌转移的试剂盒，包括用于检测呼出气冷凝液样品提取溶液中血源孪生球菌、梭状芽胞杆菌和大阪堺菌的含量所需的试剂。

进一步的，所述检测试剂包括16S rRNA基因V3-V4可变区特异性扩增引物。

进一步的，所述特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-和SEQ ID NO：2所示。

用于预测肺癌转移方法，包括以下步骤：

步骤1、取受试者呼出气冷凝液样品提取溶液，检测得到提取液中的血源孪生球菌、梭状芽胞杆菌、和大阪堺菌的质量分数；

步骤2、计算肺癌转移概率Prob，若Prob＞0.17，则判断受试者患有肺癌转移，所述肺癌转移概率的计算方法为：Prob =1/(1+e^-X)，其中X=3.967a-217.946b-109.974c-56.418，其中，a、b和c分别为步骤1中得到的血源孪生球菌、梭状芽胞杆菌和大阪堺菌的质量分数。

本发明的有益效果为：呼出气冷凝液中微生物组合血源孪生杆菌，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌可以联合用于肺癌转移疾病病人的识别。通过本发明涉及的组合标志物，能够对肺部癌症的诊断具有高灵敏、高特异性特征。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为联合标志物在判别肺癌转移疾病组的ROC曲线 ；

图2为血源孪生球菌 ，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌在转移和非转移肺癌患者呼出气冷凝液中的含量变化示意图（均值±标准误差表示）。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

相同条件下采集呼出气冷凝液样本建立筛选集：采集42例患有浸润性肺癌患者且确定肺癌已转移的患者呼出气冷凝液样本和42例患有浸润性肺癌患者且确定肺癌未转移的患者呼出气冷凝液样本建立筛选集；

通过宏基因组学技术，以样本中的整个微生物群落作为研究对象，直接提取筛选集中的样本DNA进行测序，研究呼出气冷凝液微生物的物种分类。

本发明确定的肺癌已转移和肺癌未转移的呼出冷凝液中存在3种显著差异的微生物，具体如下：血源孪生球菌 ，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌，是人体呼出冷凝液中重要的微生物。

根据该试剂盒的检测方法如下 ：

（1）呼出气冷凝液样本预处理方法：

呼出冷凝液样在4℃下解冻，取其200 µL，加入800 µL含内标的甲醇提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000×g转速离心10-15 mins，取上清冷冻干燥；加入50 uL 10-20%（v/v）甲醇水溶液，4℃条件下10000-14000×g转速离心10-15 mins，取上清进行测序分析。

（2）PCR扩增和测序文库构建测目标微生物方法：

使用携带Barcode序列的上游引物338F和下游引物806R对 16S rRNA基因V3-V4可变区进行 PCR 扩增，PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu 缓冲液4 μL，2.5mMdNTPs 2μL，上游引物（5uM） 0.8 μL，下游引物（5uM）0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。

338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’（SEQ ID NO：1）；

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2）。

扩增程序如下：95℃ 预变性 3min，27个循环（95℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s,72℃ 延伸 30s），然后 72℃ 稳定延伸 10min，最后在4℃进行保存（PCR 仪：ABI GeneAmp® 9700 型）。每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，并进行产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测条带片段大小，并用Quantus™Fluorometer (Promega, USA) 对回收产物进行检测定量。

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，Austin，Texas，USA）对纯化后的PCR产物进行建库: (1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的PE300/PE250平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI SRA数据库。

（3）基于质谱检测数据的判断模型 ：

所获得数据通过SPSS软件进行二元逻辑回归分析，所建模型获得的回归方程如下：

X=3.967a-217.946b-109.974c-56.418。

Prob（肺癌转移） =1/(1+e^-X)

从所述受试者采集呼出冷凝液样品，提取微生物，检测呼出冷凝液样品中的血源孪生球菌 ，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌的含量， Prob（肺癌转移）为预测肺癌转移的概率，Cutoff=0.17，即当Prob（肺癌转移）值大于0.17时，则预测肺癌转移。

所建模型对肺癌转移具有良好的预测能力，如图1，组合标志物的AUC=0.833、灵敏度为80%、特异性为66.7%。如图2所示，相比非转移肺癌组患者，肺癌转移组患者呼出气冷凝液中的血源孪生球菌和大阪堺菌显著升高，梭状芽胞杆菌显著下降。

实施例

呼出气冷凝液样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

浸润性肺癌患者纳入标准：具有浸润性肺癌的临床表现 ：咳嗽、痰血、喘鸣、消瘦等；并且后续诊断为浸润性肺癌患者。

相同条件下采集呼出气冷凝液样本：采集42例不确定是否肺癌转移的浸润性肺癌患者的呼出气冷凝液样本建立验证集用于验证；采集方法为：入院后未进行任何治疗前留取患者呼出气冷凝液50ml，半小时之内分离呼出气冷凝液，置于-80℃冰箱保存，备检。

2．分析方法

2.1 呼出冷凝液样本预处理

呼出冷凝液样在4℃下解冻，取其200 µL，加入800 µL含有内标的甲醇提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000×g转速离心10-15 mins，取上清冷冻干燥；加入50 uL 10-20%（v/v）甲醇水溶液，4℃条件下12000×g转速离心15mins，取上清进行后续分析。

2.2 PCR扩增和测序文库构建

以上述提取的DNA为模板，使用携带Barcode序列的上游引物338F 和下游引物806R对16S rRNA基因V3-V4 可变区进行PCR 扩增，PCR反应体系为：5×TransStartFastPfu 缓冲液4 μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物（5uM） 0.8 μL，下游引物（5uM）0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。扩增程序如下：95℃ 预变性 3min，27 个循环（95℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s, 72℃ 延伸 30s），然后 72℃ 稳定延伸 10min，最后在4℃进行保存（PCR 仪：ABI GeneAmp® 9700 型）。每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，并进行产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测条带片段大小，并用Quantus™ Fluorometer (Promega, USA) 对回收产物进行检测定量。

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，Austin，Texas，USA）对纯化后的PCR产物进行建库: (1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的PE300/PE250平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI SRA数据库。

2.3 呼出气冷凝液测试结果及辅助诊断方法

将菌群的相对含量带入回归方程式中，计算出概率，采用的cutoff值为0.17，即组合标志物的概率大于0.17则认为是肺癌转移，组合标志物的AUC=0.833，灵敏度和特异性也比较高，分别为80%和66.7%，见图1；通过本方法，最终42例浸润性肺癌患者中有21位患者被判定为肺癌转移，通过病理活检确诊为肺癌转移的15位患者中有12位患者被判定为肺癌转移，通过病理活检确诊为非肺癌转移的27位患者中有18为被判定为非肺癌转移，说明本方法的预测成功率较高。

Claims (5)

1.用于预测肺癌转移的呼出气冷凝液微生物组合，其特征在于，包括血源孪生球菌 ，梭状芽胞杆菌和大阪堺菌。

2.用于预测肺癌转移的试剂盒，其特征在于，包括用于检测呼出气冷凝液样品提取溶液中血源孪生球菌、梭状芽胞杆菌和大阪堺菌的含量所需的试剂。

3.根据权利要求2所述的用于预测肺癌转移的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括16S rRNA基因V3-V4可变区特异性扩增引物。

4.根据权利要求3所述的用于预测肺癌转移的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-和SEQ ID NO：2所示。

5.权利要求2-4中任意一项所述的试剂盒在预测肺癌转移中的应用。