CN119757755A

CN119757755A - 一种环状连接超敏免疫检测方法

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Publication number: CN119757755A
Application number: CN202411552753.3A
Authority: CN
Inventors: 王琪; 赵百慧; 涂火林; 张国伟; 陈静
Original assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co ltd
Priority date: 2024-11-01
Filing date: 2024-11-01
Publication date: 2025-04-04
Anticipated expiration: 2044-11-01
Also published as: CN119757755B

Abstract

本发明涉及一种抗原检测方法，具体地，抗原与抗体、第一环状元件和第二环状元件反应形成抗原‑抗体‑核酸复合物，随后在连接酶和外切酶的催化作用下，得到环状模板分子，以环状模板分子为目标进行核酸扩增反应，检测信号，从而得到检测结果。本发明的方法特异性好、检测效率高、背景信号低，在低丰度蛋白检测中具有优异的稳定性好灵敏度。

Description

一种环状连接超敏免疫检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种环状连接超敏免疫检测方法。

背景技术

在临床诊断领域，邻近连接技术(PLA)是一种高灵敏度的蛋白质检测技术，PLA技术通过检测特定蛋白质的表达水平和翻译后修饰，PLA有助于识别与疾病相关的生物标志物，从而提高诊断的准确性和可靠性，尤其是在需要高灵敏度和特异性检测的情况下。例如，PLA可以用于检测肿瘤标志物，帮助诊断癌症和监测疾病进展。PLA技术也已被应用于病原体的检测，如病毒、细菌等的识别。这种技术可以提供比传统免疫测定更高的灵敏度，有助于在感染早期进行快速诊断。

PLA技术的优势在于其高特异性和灵敏度，它结合了ELISA的特异性和PCR的灵敏度，使得检测低丰度蛋白质成为可能。此外，PLA技术不需要对样本进行纯化，可以直接在细胞或组织样本中进行检测，适用于多种样本类型，包括生物样本、细胞系以及新鲜、冷冻或福尔马林固定的组织切片。PLA技术还可以用于多重检测，提高实验的通量。尽管PLA技术具有许多优点，但它也存在一些限制，例如对所用抗体的质量高度依赖，抗体性能的批次差异可能导致结果的偏差，以及寡核苷酸的非特异性连接可能产生背景信号。

因此，本领域亟需一种特异性好、稳定性高、灵敏度高、基于PLA的蛋白质检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、稳定性高、灵敏度高、基于PLA的蛋白质检测技术。

本发明的第一方面，提供了一种抗原检测方法，包括步骤：

(s1)将待测样本与第一抗体和第二抗体混合，使得所述第一抗体和第二抗体与待测样本中的靶抗原结合从而形成第一抗体-抗原-第二抗体复合物，其中，所述第一抗体上偶联有第一连接元件，所述第二抗体偶联有第二连接元件；

(s2)将所述第一抗体-抗原-第二抗体复合物与第一环状元件、第二环状元件和连接酶混合，使得偶联在第一抗体的第一连接元件与第一环状元件和第二环状元件的末端碱基互补配对形成双链结构，偶联在第二抗体的第二连接元件与第一环状元件和第二环状元件的另一末端碱基互补配对形成双链结构；

第一环状元件与第二环状元件之间存在长度≤1nt的第一缺口和第二缺口；

所述的第一缺口和第二缺口在连接酶的作用下进行连接，从而形成环状模板；

(s3)在外切酶的作用下，切割线性核酸从而得到环状模板；和

(s4)对所述环状模板进行核酸扩增反应，检测信号，得到检测结果；

其中，第一环状元件、第二环状元件、第一连接元件和第二连接元件为单链核酸。

在另一优选例中，所述第一环状元件的长度为30～80个核苷酸，较佳地40～60，更佳地45～60。

在另一优选例中，所述第二环状元件的长度为60～130个核苷酸，较佳地80～120，更佳地90～110。

在另一优选例中，所述第一连接元件具有式(I)所示结构：

Z₀-Z₁-Z₂-Z₃ (I)；

式中，Z₀为0～5个核苷酸；

Z₁和Z₂各自独立地为5～15个核苷酸；

Z₃为10～30个核苷酸；

所述第二连接元件具有式(II)所示结构：

X₀-X₁-X₂-X₃ (II)；

式中，X₀为5～15个核苷酸；

X₁和X₂各自独立地为5～15个核苷酸；

X₃为15～30个核苷酸；

所述第一环状元件具有式(III)所示结构：

Z₁’-L₁-X₁’ (III)；

式中，Z₁’与Z₁互补；

X₁’与X₁互补；

L₁为20～50个核苷酸；

所述第二环状元件具有式(IV)所示结构：

Z₂’-L₂-X₂’ (IV)；

式中，Z₂’与Z₂互补；

X₂’与X₂互补；

L₂为50～100个核苷酸。

在另一优选例中，L₁为20～40个核苷酸

在另一优选例中，L₂为60～100个核苷酸。

在另一优选例中，Z₁、Z₂、X₁和X₂各自独立地为7～13个核苷酸，较佳地8～12，更佳地9～11，例如10个核苷酸。

在另一优选例中，Z₃为10～25个核苷酸，较佳地10～20，更佳地12～16，例如，14个核苷酸。

在另一优选例中，X₃为15～25个核苷酸，较佳地17～22，更佳地18～11，例如，20个核苷酸。

在另一优选例中，Z₀为1～4个核苷酸，较佳地1～3，例如，2个核苷酸。

在另一优选例中，X₀为6～13个核苷酸，较佳地8～12，例如，10个核苷酸。

在另一优选例中，L₁为20～40个核苷酸，较佳地25～35，更佳地30～35，例如，32个核苷酸。

在另一优选例中，L₂为70～100个核苷酸，较佳地80～90，更佳地85～90，例如，87个核苷酸。

在另一优选例中，所述第一连接元件具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第二连接元件具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第一环状元件具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第二环状元件具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述待测样本为1～100μL，较佳地1～50μL。

在另一优选例中，所述第一抗体连接一个或多个第一连接元件。

在另一优选例中，所述第二抗体连接一个或多个第二连接元件。

在另一优选例中，所述抗体与连接元件通过共价键连接。

在另一优选例中，所述抗体与连接元件通过点击化学反应连接。

在另一优选例中，所述步骤(s1)在20～50℃下进行，较佳地25～40℃，更佳地30～40℃，例如，约37℃。

在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述的待测样本与第一抗体和第二抗体混合的时间为0.5～5h，较佳地1～4h，更佳地1～3h，例如，约2h。

在另一优选例中，在步骤(s1)中，所述的待测样本与第一抗体和第二抗体在含有选自下组组分的样本孵育缓冲液中混合：0.01％～1％山羊IgG、0.01～1mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.01％～1％ BSA、1～10mM EDTA、0.001％～0.1％ Triton-X100、0.001％～0.01％叠氮钠和0.001％～0.01％封闭缀合物；

较佳地，0.01％～0.1％山羊IgG、0.05～0.51mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.1％～1％BSA、3～8mM EDTA、0.005％～0.05％ Triton-X100、0.005％～0.05％叠氮钠和0.001％～0.01％封闭缀合物；

例如，0.05％山羊IgG、0.1mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.5％BSA、5mM EDTA、0.01％Triton-X100、0.02％叠氮钠和0.2％封闭缀合物。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述第一环状元件和第二环状元件的浓度各自独立地为0.01～500μM。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述第一抗体和第二抗体的浓度各自独立地为0.01～5nM，较佳地0.05～1nM，更佳地0.05～0.5nM，例如，约0.1nM或0.2nM。

在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体在含有选自下组成分的抗体稀释液进行稀释：10～50mM Tris-HCI、1～20mM EDTA、0.01～1μg/mL生物素、0.01～1mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.001％～0.1％叠氮化钠和0.01％～5％PEA缀合物；

较佳地，10～30mM Tris-HCI、5～15mM EDTA、0.01～0.5μg/mL生物素、0.1～0.5mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.01％～0.05％叠氮化钠和0.1％～1％PEA缀合物；

例如，20mM Tris-HCI、10mM EDTA、0.05μg/mL生物素、0.2mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.02％叠氮化钠和0.5％PEA缀合物。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述第一环状元件和第二环状元件的摩尔比为5:1～1:5，较佳地3：1～1：3，更佳地2：1～1：2，例如，约1：1。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述第一环状元件和第二环状元件的浓度各自独立地为0.01～300μM，较佳地0.05～100μM，更佳地0.5～50μM，例如，1μM。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述双链结构在20～50℃下自发形成，较佳地25～40℃，更佳地30～40℃，例如，约37℃。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述的第一抗体-抗原-第二抗体复合物与第一环状元件和第二环状元件混合0.5～5h，较佳地1～4h，更佳地1～3h，例如，约2h。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述连接酶选自下组：T4、T7、Ampligase、或其组合。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述连接在含有选自下组成分的连接混合液中进行：Tris-HCl、MgCl₂、ATP和DTT。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述连接混合液包括以下成分：5～50mM Tris-HCl、0.1～10mM MgCl₂、0.1～10mM ATP和1～100mM DTT；

较佳地，10～30mM Tris-HCl、0.5～5mM MgCl₂、0.5～5mM ATP和5～50mM DTT；

更佳地，20mM Tris-HCl、1.5mM MgCl₂、1.5mM ATP和10mM DTT。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述的连接酶的量为1～10U，较佳地5～10U，更佳地6～8U，例如，约7.5U。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述连接在20～60℃进行，较佳地30～50℃，更佳地40～48℃，例如，约45℃。

在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述的连接的时间为10～120min，较佳地20～60min，更佳地20～40min，例如，约30min。

在另一优选例中，在步骤(s3)中，所述外切酶为外切酶I和外切酶III。

在另一优选例中，所述步骤(s3)在20～50℃下进行，较佳地25～40℃，更佳地30～40℃，例如，约37℃。

在另一优选例中，在步骤(s3)中，外切酶孵育10～120min，较佳地20～60min，更佳地20～40min，例如，约30min。

在另一优选例中，在步骤(s3)中，所述外切酶的浓度为0.1～20U/μL，较佳地0.5～10U/μL，更佳地1～5U/μL，例如，约2.5U/μL。

在另一优选例中，所述步骤(s3)在含有选自下组成分的外切酶混合液中进行：1～100mM Tris-HCl、1～50mM MgCl₂和0.1～10mM DTT；

较佳地，10～60mM Tris-HCl、1～30mM MgCl₂和0.1～5mM DTT；

更佳地，20～40mM Tris-HCl、5～20mM MgCl₂和0.5～3mM DTT；

例如，约40mM Tris-HCl、约10mM MgCl₂和约1mM DTT。

在另一优选例中，所述外切酶混合液包括以下成分：Tris-HCl、MgCl₂和DTT。

在另一优选例中，在步骤(s3)后，还包括加热步骤(s3a)，所述加热在60～85℃进行，较佳地70～85℃，更佳地75～85℃，例如，约80℃。

在另一优选例中，在加热步骤(s3a)中，所述的加热时间为10～60min，较佳地20～40min，更佳地20～30min，例如，约20min。

在另一优选例中，所述环状模板具有选自下组的结构：

其中，Z₁’、L₁、X₁’、Z₂’、L₂和X₂’如前所述。

在另一优选例中，在步骤(s4)中，在所述核酸扩增中，上游引物横跨第一缺口，下游引物横跨第二缺口。

在另一优选例中，所述上游引物横跨第一缺口指上游引物与环状模板互补的区域包含第一缺口。

在另一优选例中，所述上游引物的长度为15～30个核苷酸，较佳地15～25，更佳地18～23。

在另一优选例中，以第一缺口为基点，上游引物两侧的长度比为2:1～1:2。

在另一优选例中，所述下游引物横跨第二缺口指下游引物与环状模板互补的区域包含第二缺口。

在另一优选例中，所述下游引物的长度为15～30个核苷酸，较佳地15～25，更佳地18～23。

在另一优选例中，以第二缺口为基点，下游引物两侧的长度比为2:1～1:2。

在另一优选例中，所述上游引物具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述下游引物具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，在步骤(s4)中，所述核酸扩增还包括探针。

在另一优选例中，所述探针具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，在步骤(s4)中，所述核酸扩增反应选自下组：PCR、qPCR、染料法PCR、ddPCR、RPA、或LAMP。

在另一优选例中，所述核酸扩增反应为qPCR反应。

在另一优选例中，所述的核酸扩增反应的反应条件包括95℃预变性10分钟，95℃变性15秒，60℃延伸60秒，共45个循环。

在另一优选例中，所述方法是非诊断非治疗的。

在另一优选例中，所述方法是体外的。

在另一优选例中，所述抗原包括胶质纤维酸性蛋白和/或IL-6。

在另一优选例中，所述待测样本中靶蛋白的含量≥100pg/mL，较佳地≥10pg/mL，较佳地≥1pg/mL，更佳地≥1pg/mL。

在另一优选例中，所述待测样本包括血浆样本。

本发明第二方面，提供了一种抗原检测体系，所述抗原检测体系包含：

(a)第一抗体和第二抗体，所述第一抗体与第二抗体与靶抗原特异性结合，并且所述第一抗体上偶联有第一连接元件，所述第二抗体偶联有第二连接元件；

(b)第一环状元件；和

(c)第二环状元件；

其中，所述第一连接元件、第二连接元件、第一环状元件和第二环状元件的定义如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体在所述抗原检测体系中的浓度各自独立地为0.01～5nM，较佳地0.05～1nM，更佳地0.05～0.5nM，例如，约0.1nM或0.2nM。

在另一优选例中，在所述抗原检测体系中，所述第一环状元件和第二环状元件的摩尔比为5:1～1:5，较佳地3：1～1：3，更佳地2：1～1：2，例如，约1：1。

在另一优选例中，在所述抗原检测体系中，所述第一环状元件和第二环状元件的浓度各自独立地为0.01～300μM，较佳地0.05～100μM，更佳地0.5～50μM，例如，约1μM。

在另一优选例中，所述抗原检测体系还包括引物和探针，所述引物和探针的定义如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述抗原检测体系还包括连接酶和/或外切酶。

在另一优选例中，在所述抗原检测体系中，所述连接酶的量为1～10U，较佳地5～10U，更佳地6～8U，例如，约7.5U。

在另一优选例中，在所述抗原检测体系中，所述外切酶的浓度为0.1～20U/μL，较佳地0.5～10U/μL，更佳地1～5U/μL，例如，约2.5U/μL。

本发明第三方面，提供了一种抗原检测试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)第一容器以及位于第一容器的第一抗体和第二抗体；所述第一抗体上偶联有第一连接元件，所述第二抗体偶联有第二连接元件；

(ii)第二容器以及位于第二容器的第一环状元件和第二环状元件；

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：

(iii)第三容器以及位于第三容器的连接酶；

(iv)第四容器以及位于第四容器的外切酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器以及位于第五容器的引物和探针，所述引物和探针的定义如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和/或第五容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括样本孵育缓冲液，所述样本孵育缓冲液的定义如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括含有选自下组组分的连接混合液：5～50mMTris-HCl、0.1～10mM MgCl₂、0.1～10mM ATP和1～100mM DTT；

更佳地，20mM Tris-HCl、1.5mM MgCl₂、1.5mM ATP和10mM DTT。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括含有选自下组组分的外切酶混合液：1～100mM Tris-HCl、1～50mM MgCl₂和0.1～10mM DTT；

较佳地，10～60mM Tris-HCl、1～30mM MgCl₂和0.1～5mM DTT；

更佳地，20～40mM Tris-HCl、5～20mM MgCl₂和0.5～3mM DTT；

例如，约40mM Tris-HCl、约10mM MgCl₂和约1mM DTT。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括抗体稀释液，所述抗体稀释缓冲液的定义如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括用于核酸扩增反应的核酸扩增反应液。

在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体与靶抗原特异性结合。

本发明第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的抗原检测体系或如本发明第三方面所述的抗原检测试剂盒的用途，用于检测待测样本中的抗原。

在另一优选例中，所述待测样本中包含抗原，优选胶质纤维酸性蛋白和/或IL-6。

在另一优选例中，所述用途为疾病诊断目的。

在另一优选例中，所述用途为非疾病诊断目的。

在另一优选例中，所述待测样本包括血浆样本。

本发明第五方面，提供了一种抗原检测方法，包括步骤：

使用如本发明第二方面所述的抗原检测体系或如本发明第三方面所述的抗原检测试剂盒处理待测样本，并进行核酸扩增反应，从而得到检测结果。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明方法的原理图。

图2显示了使用本发明方法检测GFAP的结果图。

图3显示了不同长度寡核苷酸对实验结果的影响。

图4显示了使用本发明方法检测IL-6的结果图。

图5显示了PLA检测IL-6的结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量实验和筛选，首次意外地发现一种基于环状结构的蛋白检测方法。发明人通过对环状元件长度的优化，最终开发出一种特异性好、检测效率高的蛋白检测方法。本发明的方法解决了现有技术中背景信号强的问题，提高了蛋白标志物检测的稳定性和灵敏度，在低丰度蛋白检测的应用中，具有优异的稳定性和灵敏度。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被理解为包括所述元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值以及在适当时其分数的值(例如一个整数的十分之一和百分之一)。

如本文所用，术语“和/或”涉及并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合。

如本文所用，术语“本发明的第一/二连接元件”与“探针1/2”可互换使用。

如本文所用，术语“本发明的第一/二环状元件”与“寡核苷酸1/2”可互换使用。

胶质纤维酸性蛋白

胶质纤维酸性蛋白(GFAP，Glial Fibrillary Acidic Protein)是一种在中枢神经系统(CNS)的星形胶质细胞中发现的中间丝蛋白。GFAP在维持细胞结构、提供细胞支持和调节细胞内信号传导方面发挥着重要作用。在神经系统疾病中，GFAP的表达和功能可能会发生变化，这些变化通常与疾病的病理过程密切相关。

本发明的方法

如本文所用，术语“本发明的方法”和“本发明的抗原检测方法”可互换使用，均指本发明第一方面所述的方法，包括步骤：

(s3)在外切酶的作用下，切割线性核酸从而得到环状模板；和

在一个优选的实施方式下，所述第一连接元件具有式(I)所示结构：

Z₀-Z₁-Z₂-Z₃ (I)；

式中，Z₀为0～5个核苷酸；

Z₁和Z₂各自独立地为5～15个核苷酸；

Z₃为10～30个核苷酸；

所述第二连接元件具有式(II)所示结构：

X₀-X₁-X₂-X₃ (II)；

式中，X₀为5～15个核苷酸；

X₁和X₂各自独立地为5～15个核苷酸；

X₃为15～30个核苷酸；

所述第一环状元件具有式(III)所示结构：

Z₁’-L₁-X₁’ (III)；

式中，Z₁’与Z₁互补；

X₁’与X₁互补；

L₁为20～50个核苷酸；

所述第二环状元件具有式(IV)所示结构：

Z₂’-L₂-X₂’ (IV)；

式中，Z₂’与Z₂互补；

X₂’与X₂互补；

L₂为50～100个核苷酸。

在一个优选的实施方式下，所述第一连接元件具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式下，所述第二连接元件具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式下，所述第一环状元件具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式下，所述第二环状元件具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式下，在所述核酸扩增中，上游引物横跨第一缺口，下游引物横跨第二缺口。

如图1所示，本发明的方法的原理为两个抗体特异性识别靶抗原(靶蛋白)并与之结合，两个抗体上分别修饰有第一连接元件和第二连接元件，从而拉近第一连接元件和第二连接元件之间的距离。在第一环状元件和第二环状元件的存在下，偶联在第一抗体的第一连接元件与第一环状元件和第二环状元件的末端碱基互补配对形成双链结构，偶联在第二抗体的第二连接元件与第一环状元件和第二环状元件的另一末端碱基互补配对形成双链结构，从而形成第一缺口和第二缺口的结构。第一缺口和第二缺口在连接酶的作用下连接，从而形成环状模板。加入外切酶，去除体系中的线性核酸，得到高纯度的环状模板。对环状模板进行核酸扩增反应，从而得到检测结果。

本发明的主要优点包括：

1.本发明的方法重复性好、准确性高、操作简单、成本低、无需大型仪器。

2.本发明的方法适用于微量检测，可检测1μL的样本。

3.本发明的方法平台适用性广，可同时检测多种靶标，适用于高通量检测。

4.本发明的方法可实现快速检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

1.准备亲和探针：通过芳香酰肼化学将多克隆抗体与修饰有胺基的寡核苷酸结合，形成带有磷酸化的5'端或3'端的亲和探针。寡核苷酸和抗体偶联物的连接方式可以选择化学法直接连接，通过化学反应将寡核苷酸的末端功能团(如胺基或羟基)与抗体上的相应功能团(如羧基)直接连接起来。

或通过一个连接子(spacer arm)将寡核苷酸和抗体连接起来。连接子通常包含一个或多个可反应的化学基团，如异硫氰酸酯(isothiocyanate)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHSester)或马来酰亚胺(maleimide)，这些基团可以与抗体上的赖氨酸残基或半胱氨酸残基反应。

利用click chemistry原理，如铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应，将带有相应官能团的寡核苷酸和抗体连接起来也可以实现亲和探针的构建。

2.样本孵育：将样本加入亲和探针混合物中，在37℃下孵育2小时，使目标分析物与亲和探针中的抗体(两个抗体浓度分别为0.1nM和0.2nM)结合。样本量可为5～50μL。

3.连接步骤：向孵育后的样本中加入连接混合物，该混合物含有两个形成环状的连接寡核苷酸(摩尔比为1：1)、连接酶、NAD、DTT等，在45℃下孵育30分钟进行连接反应。连接酶可以采用T4、T7、Ampligase等市面在售连接酶。

4.外切酶处理：连接反应后，加入外切酶混合物，该混合物含有外切酶I和外切酶III，在37℃下孵育30分钟，然后80℃加热20分钟使外切酶失活，以降解未形成环状的DNA。

5.qPCR定量：将外切酶处理后的连接产物加入qPCR混合物(包含引物序列3、引物序列4、探针序列和qPCR反应液)中，使用实时qPCR进行定量分析。qPCR的条件为95℃预变性10分钟，然后95℃变性15秒，60℃延伸60秒，共40个循环。检测方法也可以使用染料法PCR，等温扩增，如RPA，LAMP等可以进行信号放大的方法。

6.数据分析：将qPCR的Ct值转换为连接分子的估计数量，并计算检测限。

样本孵育缓冲液配方：0.05％山羊IgG、0.1mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.5％BSA、5mMEDTA、0.01％ Triton-X100、0.02％叠氮钠和0.2％封闭缀合物。

抗体稀释液配方：20mM Tris-HCI、10mM EDTA、0.05μg/mL生物素、0.2mg/mL单链鲑鱼精子DNA、0.02％叠氮化钠和0.5％PEA缀合物。

连接混合液配方：20mM Tris-HCl、1.5mM MgCl₂、1.5mM ATP、10mM DTT、T4连接酶，寡核苷酸1和2。寡核苷酸浓度1μM，T4连接酶浓度7.5U/反应。

外切酶混合液配方：40mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT、2.5U/μL核酸外切酶I和/或核酸外切酶III。

实施例1

1.1方法

本实施例的检测靶标为胶质纤维酸性蛋白，抗体使用上海伯杰医疗科技股份有限公司自研抗体。

采用10μL临床血浆样本(添加不同浓度的GFAP，含量分别为0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL和100pg/mL)，CK组为不添加GFAP的血浆样本，按照通用方法中的步骤进行实验。本实施例中所使用的探针如表1所示。

表1

注：相同标记的序列为环状互补区域，连接反应发生在此区域。探针1和2为连接在抗体上的寡核苷酸。

探针1通过3’端的NH₂修饰与抗体上的羧基相连，探针2通过5’端的NH₂修饰与抗体上的羧基相连，使用abcam偶联试剂盒ab218260进行连接。

1.2结果

表2本发明方法检测GFAP的结果

	CK	100pg/mL	10pg/mL	1pg/mL	0.1pg/mL
						Ct 1	NoCt	24.6	27.8	31.12	33.74
Ct 2	NoCt	24.9	27.55	31.54	33.2
						AVE	NoCt	24.75	27.675	31.33	33.47

如图2和表2所示，本发明的方法针对梯度稀释的样本能够产生很好的相关性，灵敏度可达0.1pg/mL，完全满足临床诊断的需求，同时低浓度样本完全不受背景信号的干扰，结果稳定性很好。

实施例2

2.1方法

发明人探索了不同长度寡核苷酸对检测结果的影响。实验方法如通用方法所述，检测靶标为GFAP。本实施例与实施例1的区别在于寡核苷酸1的序列不同，为其余均相同。本实施例中的寡核苷酸1和2的长度基本相同。

2.2结果

表3使用长度基本相同的寡核苷酸的检测结果

	CK	100pg/mL	10pg/mL	1pg/mL	0.1pg/mL
						Ct1	39.06	33.94	36.05	37.65	38.01
Ct2	39.71	34.07	35.96	37.77	38.26
						AVE	39.385	34.005	36.005	37.71	38.135

结果如图3和表3所示，与一长一短寡核苷酸相比(实施例1)，采用双长链环状结构(本实施例)，容易产生二级结构，成环和连接难度增大，其灵敏度会降低，在一定程度上影响后续扩增的效率，存在发生非特异性扩增的风险，实验结果的不稳定性增加。因此寡核苷酸组的长度为一长一短，或在实验允许范围内缩短寡核苷酸链的长度，具有更好的扩增结果。

对比例

以IL-6为靶标，采用20μL的血浆样本(分别加入0.5pg/mL、1pg/mL、10pg/mL和100pg/mL的IL-6)，CK组为不加IL-6的血浆样本，抗体(Abclonal公司A21264和A24913)，实验方法如通用方法中所述。使用本发明方法的与环状连接的寡核苷酸序列如实施例1所述。对比例中所使用的序列如表4所示。

表4

名称	序列	SEQ ID NO：
			寡核苷酸	TTTCCAGCTTAACACTGCGCGAGAAA	9
引物3	GTTGGCAAGATCTACTCCGG	10
			引物4	TTCTTGGGTGGGAACTTGG	11
探针	ACACTTCAGGACCCATCCAGCTTAACACTG	12

本发明方法的结果如表5和图4所示。

表5本发明方法的检测结果

	CK	100pg/mL	10pg/mL	1pg/mL	0.5pg/mL
						Ct 1	NoCt	27.84	30.64	33.35	34.5
Ct 2	NoCt	27.95	30.89	33.65	34.9
						AVE	NoCt	27.895	30.765	33.5	34.7

对比例的结果如表6和图5所示。

表6 PLA检测结果

	CK	100pg/mL	10pg/mL	1pg/mL
					Ct 1	32.66	26.02	28.97	30.5
Ct 2	33.02	25.79	29.08	30.97
					AVE	32.84	25.905	29.025	30.735

常规的PLA检测背景信号可以达到Ct32～34左右，实验结果不理想时，信号可能更强。通过环状检测的方式(即本发明的方法)可以将实验背景(CK)降低到Ct38以后甚至无信号，有效降低背景对于低浓度信号的影响，实验结果总体更为稳定。同时，去除背景信号的干扰，能够在检测低丰度蛋白时获得更高的灵敏度，在临床诊断方面获得更为精确的结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗原检测方法，其特征在于，包括步骤：

(s3)在外切酶的作用下，切割线性核酸从而得到环状模板；和

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一环状元件的长度为30～80个核苷酸，较佳地40～60，更佳地45～60。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二环状元件的长度为60～130个核苷酸，较佳地80～120，更佳地90～110。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一连接元件具有式(I)所示结构：

Z₀-Z₁-Z₂-Z₃(I)；

式中，Z₀为0～5个核苷酸；

Z₁和Z₂各自独立地为5～15个核苷酸；

Z₃为10～30个核苷酸；

所述第二连接元件具有式(II)所示结构：

X₀-X₁-X₂-X₃(II)；

式中，X₀为5～15个核苷酸；

X₁和X₂各自独立地为5～15个核苷酸；

X₃为15～30个核苷酸；

所述第一环状元件具有式(III)所示结构：

Z₁’-L₁-X₁’(III)；

式中，Z₁’与Z₁互补；

X₁’与X₁互补；

L₁为20～50个核苷酸；

所述第二环状元件具有式(IV)所示结构：

Z₂’-L₂-X₂’(IV)；

式中，Z₂’与Z₂互补；

X₂’与X₂互补；

L₂为50～100个核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(s4)中，在所述核酸扩增中，上游引物横跨第一缺口，下游引物横跨第二缺口。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(s4)中，所述核酸扩增反应选自下组：PCR、qPCR、染料法PCR、ddPCR、RPA、或LAMP。

7.一种抗原检测体系，其特征在于，所述抗原检测体系包含：

(b)第一环状元件；

(c)第二环状元件；

其中，所述第一连接元件、第二连接元件、第一环状元件和第二环状元件的定义如权利要求4所述。

8.一种抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

其中，所述第一连接元件、第二连接元件、第一环状元件和第二环状元件的定义如权利要4所述。

9.如权利要求8所述的抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括

(iii)第三容器以及位于第三容器的连接酶；

(iv)第四容器以及位于第四容器的外切酶。

10.一种如权利要求7所述的抗原检测体系或如权利要求路由器8所述的抗原检测试剂盒的用途，其特征在于，用于检测待测样本中的抗原。